奶牛乳房炎源肺炎克雷伯菌耐药特性分析_高兴.pdf

南京农业大学学报，（）：收稿日期：基金项目：国家自然科学基金青年基金项目（）作者简介：高兴，硕士研究生。通信作者：姚火春，教授，主要从事兽医微生物与免疫学研究，：。高兴，赵柯杰，于勇，等 奶牛乳房炎源肺炎克雷伯菌耐药特性分析 南京农业大学学报，（）：，（）：奶牛乳房炎源肺炎克雷伯菌耐药特性分析高兴，赵柯杰，于勇，潘子豪，马家乐，姚火春（南京农业大学动物医学院，江苏 南京）摘要：目目的的 通过分析 株奶牛乳房炎源肺炎克雷伯菌分离株的耐药特性和超广谱 内酰胺酶（）产生情况，了解该类致病菌对新型抗生素的耐药现状，防范其对公共卫生安全产生的潜在威胁，为防控肺炎克雷伯菌引起的奶牛乳房炎提供参考。方方法法 通过对分离株的细菌形态学观察、基因的 检测和 序列测定筛选并鉴定肺炎克雷伯菌株，利用 琼脂平板扩散法和微量肉汤稀释法评估肺炎克雷伯分离株的耐药性。结结果果 肺炎克雷伯菌耐药率由高到低依次为头孢吡肟（）、环丙沙星（）、头孢他啶（）、美罗培南（）、厄他培南（）、亚胺培南和替加环素（）。在对替加环素中度敏感菌株中均检测到 基因，但未发现 和 基因。在对喹诺酮类抗生素耐受菌株中，有 株检测到 基因，株检测到 基因，株检测到 基因，未发现 基因。在对 内酰胺类抗生素耐受菌株中，、和 检出率分别是、和，未检测到上述耐药基因的突变体。结结论论 本试验分离的肺炎克雷伯菌对新型头孢类抗生素产生耐药性，部分菌株具有多重耐药性，甚至对碳青霉烯类抗生素产生耐药。该结果提示需防范新型抗生素耐药菌株的产生和传播，以免引发公共卫生安全危害，对防控肺炎克雷伯菌引起的奶牛乳房炎提出了新要求。关键词：奶牛乳房炎；肺炎克雷伯菌；产 菌株；耐药分析中图分类号：文献标志码：文章编号：（），（，）：（），.，.，.：；第 期高兴，等：奶牛乳房炎源肺炎克雷伯菌耐药特性分析奶牛乳房炎是一种奶牛常见且多发的疾病，它不仅会降低乳品质量，还会导致患病奶牛的生产性能显著下降，造成巨大的经济损失，严重影响奶牛养殖业的健康和绿色发展。环境致病性病原微生物有葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌等，它们能够引起奶牛乳房炎，其临床症状主要表现为乳区急性红肿，触摸坚硬且疼痛，乳汁呈现絮状或水样且产量显著降低。其中，肺炎克雷伯菌不仅会引起奶牛的乳房炎，还会感染尿道引起尿道炎、感染呼吸道引起肺炎和进入血液引起菌血症等。近年来，肺炎克雷伯菌引起的动物感染及其潜在的公共卫生安全危害性受到科研人员越来越多的关注，但对该菌感染及传播机制的认识仍然十分有限。目前，主要用 内酰胺类、喹诺酮类、氨基糖苷类等抗生素治疗肺炎克雷伯菌引起的奶牛乳房炎。由于抗生素的过度使用，越来越多的肺炎克雷伯菌携带产超广谱 内酰胺酶、碳青霉烯酶和氨基糖苷钝化酶，进而导致细菌多重耐药越来越严重。同时，肺炎克雷伯菌耐药基因较多，与合成超广谱 内酰胺酶（，）有关的耐药基因有、和；与合成碳青霉烯酶有关的高度保守基因有 和 等；与合成 酶有关的耐药基因有、和 等。虽然抗生素在畜禽养殖业中的使用已受到严格控制，但目前仍不能完全阻断耐药性在奶牛乳房炎源肺炎克雷伯菌中产生。评估奶牛乳房炎源肺炎克雷伯菌对新型抗生素的耐药情况，可指导对该病原的防控及公共卫生安全策略的制定。本研究对来自全国大型规模化奶牛场乳房炎奶样进行了肺炎克雷伯菌的分离鉴定、药敏试验、产 肺炎克雷伯菌的筛选和耐药基因的检测与分析，以了解该菌的耐药情况，为该菌感染的防治提供理论依据。材料与方法 菌株准备从全国 个省、直辖市、自治区 个大型规模化奶牛场的 批乳房炎 多份奶样中分离得到的疑似肺炎克雷伯菌株，共计 株（菌株编号见后表）。质控菌株为大肠埃希菌（）。试验材料（）琼脂购自杭州微生物试剂有限公司；药敏纸片（包含头孢吡肟、头孢他啶、头孢他啶 棒酸、美罗培南、厄他培南、亚胺培南、环丙沙星、替加环素、多黏菌素）购自温州康泰生物科技有限公司；孔平底培养板和多黏菌素、替加环素、环丙沙星、头孢他啶、头孢吡肟、美罗培南和厄他培南抗生素粉末购自南京鼎周生物技术有限公司等。细菌的鉴定将疑似菌株复苏，接种至血琼脂平板和麦康凯琼脂平板培养基上，于 培养 后观察。以提取的肺炎克雷伯菌 为模板，参照 中肺炎克雷伯菌溶血素 基因和 基因序列，设计引物对序列：，目的基因片段长度；：，目的片段长度 。反应体系：，上、下游引物各，模板 ，。程序：；，共 个循环；。凝胶电泳试验，检测 产物大小。引物扩增产物送苏州金唯智生物技术公司进行序列测定，所获序列在 网站进行 分析，以鉴定菌株确实为肺炎克雷伯菌。药敏试验利用 琼脂平板扩散法，对已确认的肺炎克雷伯菌进行药敏试验。先将培养的菌液稀释比浊度至 个麦氏浓度，然后吸取该菌液 于 固体培养基上，涂布均匀后放置药敏纸片，保证每张纸片中心距离不少于，之后放于 恒温培养箱培养，测量抑菌圈直径。根据美国临床实验室标准化委员会（）的药敏试验标准判断其耐药性。用微量肉汤稀释法测定替加环素、环丙沙星、头孢他啶、头孢吡肟和美罗培南对肺炎克雷伯菌株的最低抑菌浓度（），进一步判断肺炎克雷伯菌的耐药性。将 细菌悬液用肉汤稀释至 后加入 孔板中，再配制抗生素，药物的初始浓度分别为替加环素 、环丙沙星 、头孢他啶 、头孢吡肟 和美罗培南 。在 孔板中，加入要进行梯度稀释的药物和菌液各，逐步稀释后在 恒温箱中培养，肉眼未见浑浊的最低药物浓度南 京 农 业 大 学 学 报第 卷即为；同时以大肠埃希菌 为质控菌。细菌 的提取将冻存的肺炎克雷伯菌株接种至 液体培养基中，摇床振荡培养。、离心 ，弃上清液。在 管中加入 ，充分煮沸，、离心，吸取上清液至高压灭菌的无菌 管作为模板备用。耐药基因的 扩增及其序列分析肺炎克雷伯菌耐药基因庞杂，通过 抗性基因数据库筛选肺炎克雷伯菌及其他肠杆菌科细菌 内酰胺类相关耐药基因，利用 软件构建系统进化树。根据进化树结果设计引物并由南京擎科生物技术有限公司合成。引物序列详见表。利用 法对替加环素、喹诺酮类和 内酰胺类抗生素耐药基因进行 扩增。反应体系（）：，上、下游引物各 ，模板。程序：；，共 个循环；。产物经 琼脂糖凝胶电泳检测。将未纯化的 产物送南京金唯智测序，测序结果在 上进行同源性分析，确定耐药基因型及亚型。表 耐药基因的引物序列 抗生素分类引物名称 引物对序列 （）产物大小 目标基因 内酰胺类：、：、：、：、：、：喹诺酮类：四环素类：表型筛选和确认试验采用 琼脂平板扩散法，对分离的 株肺炎克雷伯菌进行产 的筛选和确认试验。将肺炎克雷伯菌株菌液浓度稀释为 ，将菌液均匀涂布 固体培养基，再分别贴上头孢他啶和头孢他啶 棒酸药敏纸片，孵育过夜。若 产物筛选试验判定结果为头孢他啶药敏纸片抑菌圈直径，且头孢他啶 棒酸药敏纸片抑菌圈直径与头孢他啶相比增加 及以上，则可确认其为产 菌株。质控菌为大肠埃希菌。内酰胺类抗生素耐药基因的序列测定使用表 中引物按照 节中操作程序鉴定后，阳性 产物送苏州金唯智公司测序。根据第 次测序结果初步判定耐药基因型，设计引物，扩增耐药基因全长序列，测序结果在 上进行同源性分析，确定耐药基因型及亚型。第 期高兴，等：奶牛乳房炎源肺炎克雷伯菌耐药特性分析 结果与分析 致奶牛乳房炎肺炎克雷伯菌分离鉴定对从乳房炎奶样中分离到的细菌进行菌落形态学鉴定：肺炎克雷伯菌在血琼脂平板上为灰白色，黏稠，形成菌丝的较大菌落；在麦康凯琼脂培养基上呈现红色、较大且黏稠的菌落，用接种环挑取时有拉丝的现象；对符合上述特点的菌落进行纯化培养，以作进一步鉴定。肺炎克雷伯菌的分子生物学鉴定：首先采用溶血素 基因特异性引物进行 检测；对检测到条带且大小符合预期的菌株进一步进行 序列测定，经 比对与 数据库中肺炎克雷伯菌序列一致性达到 以上的菌株最终鉴定为肺炎克雷伯菌。经菌落形态学鉴定及分子生物学鉴定（基因检测及 序列分析），总计有 株纯化的细菌符合肺炎克雷伯菌的所有特征，鉴定为奶牛乳房炎源肺炎克雷伯菌。肺炎克雷伯菌的药敏试验本研究选用的抗生素均为较新的产品，并非全部来自兽用制剂，主要是为了根据牛源分离株的耐药特性评估它们对公共卫生安全的潜在威胁。其中，四环素类 种，喹诺酮类 种，头孢类 种，碳青霉烯类 种。在 株肺炎克雷伯菌中，株菌对所选的抗生素均敏感，剩余 株菌显示不同程度抗生素耐受（图）。根据 和 试验值，肺炎克雷伯对替加环素的中度敏感率最高，对环丙沙星的耐药率最高。由于所选抗生素代次较新，株样品克雷伯菌的耐药情况并不严重。上述菌株对碳青霉烯类抗生素普遍敏感，仅 株菌对美罗培南显示中度敏感或耐药，株菌对厄他培南耐药，对亚胺培南完全敏感。图 株肺炎克雷伯菌的药敏试验结果.图 肺炎克雷伯菌的多重耐药菌株分布.肺炎克雷伯菌的多耐药菌株分析如图 所示：在本研究检测的肺炎克雷伯菌中，多重耐药的菌株仅 株，检出率为；另有 株菌显示多重中度敏感；两者合计检出 株，检出率为。检出二重耐药菌株有 株，检出率；三重耐药菌株有 株，检出率；四重耐药菌株有 株，检出率；五重耐药菌株有 株（）。还发现，这些肺炎克雷伯菌同时耐环丙沙星、头孢他啶和头孢吡肟抗生素的较多，对同类抗生素的耐受情况比较一致。对碳青霉烯类抗生素耐药的菌株多数来自多重耐药情况比较严重的菌株，其中仅 株（）同时对美罗培南及厄他培南产生耐药。替加环素及环丙沙星耐药菌株分析及耐药基因鉴定 株对替加环素存在不同程度耐受的肺炎克雷伯菌都属于中度敏感。此外，耐药基因检测结果显示，全部 株均编码 基因，但均不编码 基因和 基因。此结果提示，基因可能是乳房炎源肺炎克雷伯菌对替加环素产生中度敏感的主要原因。如表 所示，菌株对替加环素的耐药表型和 基因编码南 京 农 业 大 学 学 报第 卷情况并不完全对应，暗示存在其他的耐药基因介导了菌株的替加环素耐受。株对环丙沙星存在不同程度耐受的肺炎克雷伯菌中，株菌中度敏感，株菌为耐药。耐药基因检测结果显示，有 株菌编码 基因，株菌编码 基因，株菌编码 基因，但均不编码 基因。表 结果显示菌株对环丙沙星的耐药表型和耐药基因编码情况并非完全对应，提示存在其他的耐药基因介导了菌株耐药。表 肺炎克雷伯菌对替加环素菌株的耐药性及相关耐药基因的鉴定 .菌株耐药情况（）基因检测 菌株耐药情况（）基因检测 注：最低抑菌浓度；、表示中度敏感、耐药和敏感；“”“”表示检测到和未检测到的基因。下表同此。：；，；“”“”表 肺炎克雷伯菌对环丙沙星耐药性及其耐药基因的鉴定 .菌株耐药情况（）基因检测 菌株耐药情况（）基因检测 肺炎克雷伯菌的 内酰胺类抗生素（包括碳青霉烯类）耐药性分析 株肺炎克雷伯菌对 内酰胺类抗生素耐药，如图 所示。根据 和 试验值，肺炎克雷伯菌对头孢他啶、头孢吡肟、美罗培南、厄他培南、亚胺培南显示出不同的耐药性。尽管上述菌株对头孢他啶和头孢吡肟的耐药性不同，但大多数 都高于 。此外，上述菌株对美罗培南的耐药性也不相同，但大部分 偏低，多数小于 ，少数大于 。其大多数对厄他培南和亚胺培南比较敏感。第 期高兴，等：奶牛乳房炎源肺炎克雷伯菌耐药特性分析图 肺炎克雷伯菌对 内酰胺类抗生素的耐药情况.：头孢他啶；：头孢吡肟；：美罗培南；：厄他培南；：亚胺培南 肺炎克雷伯菌株的产 分析在所有 株肺炎克雷伯菌中，仅 株确证为产 菌株，占（表）。理论上，产 特性与菌株是否具有 内酰胺类抗生素耐药性显著相关，但是本试验结果显示，产 特性与 内酰胺类抗生素耐药性并不完全一致。有 株产 的菌株对本试验所选用的 种 内酰胺类抗生素（包括 种碳青霉烯类抗生素）均敏感，而对 内酰胺类抗生素耐药最严重的 株菌 及 却并未被判定为产 菌株。在 株产 菌中，对头孢他啶中度敏感和耐药的有 株，占；对头孢吡肟中度敏感和耐药的有 株，占；对美罗培南中度敏感和耐药的有 株，占；而此 株菌对厄他培南和亚胺培南均敏感。在 株产 型菌株中，无耐药的菌株有 株，占；单耐药的菌株有 株，占；多重耐药的菌株有 株，占；碳青霉烯类耐药的菌株有 株，占。表 产 肺炎克雷伯菌的耐药特性分析 .菌株 头孢他啶 头孢吡肟 美罗培南 厄他培南 亚胺培南 南 京 农 业 大 学 学 报第 卷续表 菌株 头孢他啶 头孢吡肟 美罗培南 厄他培南 亚胺培南 注：“”表示产（）。：“”（）内酰胺类抗生素耐药基因鉴定使用设计的 对 引物对 株 内酰胺类抗生素耐药的肺炎克雷伯菌进行 内酰胺类抗生素耐药基因检测，结果详见图 和表。在 株菌中，株含有 种耐药基因，株含有 种耐药基因，株含有 种耐药基因，株只含有 种耐药基因。对 引物检测阳性的菌株进行 产物测序分析，以确定具体属于哪一种耐药基因。结果显示：检测到的 类的耐药基因主要有（）、（）、（）、（）和（）；检测到的 类的耐药基因主要为（）；检测到的 类的耐药基因主要有（）、（）、（）、（）、（）和（）；检测到的 类的耐药基因主要有（）和（）；检测到的 类的耐药基因主要为（）；检测到的 类的耐药基因主要有（）和（）；检测到的 类的耐药基因主要为（）。未检测到突变的耐药基因。图 内酰胺类抗生素耐药基因分布.第 期高兴，等：奶牛乳房炎源肺炎克雷伯菌耐药特性分析表 内酰胺类抗生素耐药基因鉴定结果 菌株检测引物 注：“”表示未测得耐药基因。“”讨论肺炎克雷伯菌感染导致的奶牛乳房炎对全世界奶牛养殖业和乳制品业造成了巨大的经济损失。近年来，由于临床上滥用抗生素导致菌株耐药十分严重，并且产 的肺炎克雷伯菌在奶牛场的流行，对该细菌的防治十分艰难。本试验对来自全国大型规模化牧场的 余份乳房炎奶样进行细菌分离鉴定，经过麦康凯选择性培养基筛选，及肺炎克雷伯 基因检测和 测序分析，共筛选到 株肺炎克雷伯菌，分离率约。曹菲菲等对规模化牧场的奶牛乳腺炎致病菌进行了分离鉴定，肺炎克雷伯菌检出率为。同样，石玉祥等对来自河北某省的大规模奶牛场的 份乳样进行了分离鉴定，发现肺炎克雷伯占。说明全国各地奶牛场的卫生防护措施参差不齐。肺炎克雷伯菌已被证实是严重耐药菌，而奶牛养殖业中所用的兽用抗生素一般代次较低，因此理论上奶牛乳房炎源的肺炎克雷伯菌应当对最新代次的抗生素较为敏感。本试验结果显示，奶牛源肺炎克雷伯菌虽然对较新代次的抗生素较敏感，但仍有菌株产生了耐药，甚至对最新的碳青霉烯类抗生素产生耐药。对抗生素的耐药率由大到小依次是头孢吡肟（）、环丙沙星（）、头孢他啶（）、美罗培南（）、厄他培南（）。碳青霉烯类抗生素耐药也越来越严重，尤其近几年来 型、型碳青霉烯酶编码基因在肺炎克雷伯菌中广泛传播，再加上这些耐药基因的跨物种跨区域水平传播，用这些抗生素治疗产碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌感染已达不到理想效果。本试验结果还表明，部分菌株对 内酰胺类抗生素（包括碳青霉烯类）的多重耐药性十分严重，邓波等的研究也有报道。因此，在后期治疗肺炎克雷伯菌感染过程中，需要减少头孢菌素类抗生素的使用，并注意抗生素联合用药以及抗生素之间的合理配比，防范这类菌株在奶牛生产中广泛传播。肺炎克雷伯菌对四环素的耐药机制与、和 基因有关，本试验只检测到了 基因，对于大多数耐替加环素的肺炎克雷伯菌来说，基因抑制 基因，调节 和 基因的过表达，从而介导了革兰阴性杆菌的多重耐药，但是本试验未检测到 基因，而 基因经测序未发现突变位点，提示上述菌株的替加环素耐药性可能由其他机制介导。另外，肺炎克雷伯菌对环丙沙星的耐药表型和耐药基因没有对应性，其中有几株为环丙沙星敏感菌株，却含有 基因，暗示质粒介导的喹诺酮类耐药南 京 农 业 大 学 学 报第 卷基因是可以在耐药传播过程中水平转移的，且细菌的耐药调节可能需要几种耐药基因共同作用，所以应加强对该类基因的监测。肺炎克雷伯菌编码的与合成超广谱 内酰胺酶有关的耐药基因较多，本试验主要检测到、和 型，其中 型最多，型较少。此外，、和 耐药基因在本次调查中也普遍存在，而 等在日本分离的肺炎克雷伯菌主要有、和 基因，说明耐药基因在不同区域的流行情况既相似又有差异。本试验中有 株菌同时含有、和 耐药基因，且对头孢类抗生素多重耐药，证实了上述耐药基因与 内酰胺类抗生素耐药表型之间具有一定相关性，肺炎克雷伯菌对 内酰胺类抗生素的耐药性可由以上基因协同所致。分离菌株中，有很多菌株含有 种及以上的 内酰胺类相关耐药基因，表明肺炎克雷伯菌对 内酰胺类抗生素耐药机制比较复杂，菌株同时编码多种耐药基因，可显著增强细菌对这类抗生素的适应性及耐受强度。在本试验中，有 株肺炎克雷伯菌为产 菌株，占，这与张颖欣等在 年检测到的产 肺炎克雷伯菌的分离率基本一致。需要注意的是，年来，产 肺炎克雷伯菌的分离率呈现上升趋势，在临床管理期间如果使用抗生素不当或过量，那些对抗生素敏感且不产 肺炎克雷伯菌有可能转化为产 菌株。产 菌株有较强的耐药性，在临床上，会影响乳房炎的治疗效果。所以，在临床治疗中，应该规范治疗流程，减少抗生素的误用和滥用，从而降低产 肺炎克雷伯菌的流行率。综上所述，在兽医临床和动物生产上，应加强对肺炎克雷伯菌耐药性的监测，规范指导抗生素的使用，从而减少耐药菌株的产生。同时积极开展分子流行病学调查，及时监控该菌的流行趋势和耐药性变迁，防范对新型抗生素耐药菌株的产生和传播，以免引起公共卫生安全危害，为有效预防和控制肺炎克雷伯耐药菌株的流行提供参考。参考文献：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：许立，郭英华，刘长庭 肺炎克雷伯菌对临床常见抗生素耐药机制研究进展 解放军医学院学报，（）：，（）：（），：，（），（）：，（）：，（）：，第 期高兴，等：奶牛乳房炎源肺炎克雷伯菌耐药特性分析，（）：，（），（）：曹菲菲，刘康军，孙莹慧，等 规模化牧场奶牛乳腺炎病原菌感染流行病学调查及肺炎克雷伯菌耐药性分析 畜牧与兽医，（）：，（）：（）石玉祥，赵文鹏，刘洋，等 奶牛乳房炎源性肺炎克雷伯杆菌的分离鉴定和耐药性分析 中国兽医杂志，（）：，（）：，（），（）：，：，（）：龚林，刘小丽，许慧琼，等 耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌分子流行病学研究 中国感染控制杂志，（）：，（）：（）邓波，王晓旭，刘洋，等 上海地区生乳中肺炎克雷伯氏菌毒力基因和耐药性分析 中国奶牛，（）：，（）：（），：，（）：，（）：，（，），（）：张颖欣，陈友涵，李树梅，等 奶牛乳房炎源性肺炎克雷伯菌 基因型分布特征 中国兽医杂志，（）：，（）：（），（）：孙乃岩，龚倩梅，胡建春，等 屠宰场鸡源碳青霉烯耐药大肠埃希菌的耐药特征分析 南京农业大学学报，（）：，（）：（）责任编辑：周广礼