化学原料药生产过程中的高效液相色谱法定量分析.pdf

中国科技期刊数据库 工业 A 收稿日期：2024 年 01 月 08 日 作者简介：吴梦月（1999)，女，安徽六安人，研究方向为药物分析。-176-化学原料药生产过程中的高效液相色谱法定量分析 吴梦月 田晓然 黄方志 李士阔（通讯作者）安徽大学化学化工学院，安徽 合肥 230601 摘要：摘要：化学原料药作为化学药物制剂中的关键性有效成分，是现代制药工业的重要基础，其生产过程中的质量检测至关重要。高效液相色谱（HPLC）作为一种广泛应用于制药领域的重要分析检测工具，在化学原料药生产和开发过程中可以完成药品的纯度、含量以及稳定性的定量分析。文章以一种典型的化学原料药核苷类似物的生产过程中基于 HPLC 的定量分析的质量管控为典型案例，提出一种面向化学原料药生产过程的质量管控方法。在论证本次方法的有效性与优势基础上，供我国化学原料药产业加以借鉴、参考。关键词：关键词：化学原料药；定量分析；高效液相色谱 中图分类号：中图分类号：O65 核苷类似物齐多夫定是惟一被 FDA 核准预防HIV-1 母婴传播的药物1。从 1987 年开始，该药被广泛使用，疗效显著。自此，核苷类似物的原料药设计合成已逐渐成为医药工作者研究的重点。5-O-DMT-胸苷 3-O-琥珀酸三乙基铵盐是一种新型核苷类似物，具有很强抗病毒活性，通过与天然核苷竞争掺入病毒 DNA 或 RNA 来抑制病毒复制。5-O-DMT 基团可防止胸苷从单磷酸盐形式中消除。该产品具有高纯度和质量，以及对 HIV 和其他病毒的有效抗病毒活性2。琥珀酸核苷单体是合成多种抗病毒、抗肿瘤药物的重要中间体，由天然的脱氧核苷进行化学修饰，被广泛的应用于合成寡核苷酸药物和基因工程的研究中。高纯度琥珀酸三乙胺盐单体对于寡核苷酸的固相合成至关重要3。因此，如何以此种核苷原料药生产管控为典型案例，开发一种有效的定量分析方法，实现原料药生产过程的高效监测，对核苷类似物原料药生产领域而言具有十分重要影响。在药物生产研发过程中，常用薄层色谱法进行反应监控。但该方法精密度差，难以定量描述反应历程及产品纯度。高效液相色谱（HPLC）能够对药品中的有效成分、杂质和降解产物进行精确分析，并确定其含量和纯度。这有助于确保药物的质量和安全性，提供科学依据促进药品合规生产4。因此，本文在文献调研的基础上，摸索确立生产工艺路线，建立一种成熟稳定、产量高且易于纯化分离的合成工艺来制备胸苷琥珀酸三乙胺盐单体。建立完整的高效液相色谱法，以实现对 5-O-(4,4-二甲氧基三苯甲基)-2-脱氧胸苷-3-O-琥珀酸三乙胺盐的合成生产过程进行定量分析以实现质量管控。1 核苷类似物概述 核苷类似物，是一类抗病毒性原料药的统称，主要用于核苷类似物治疗，抗病毒，提高免疫及恢复肝功。目前而言，常见核苷类似物主要有三种：1.拉米夫定，抑制病毒的药物。但不能清除乙肝病毒。在应用拉米夫定时，会对病人自身的 HBV 的特异性免疫反应状态及病毒毒力密切相关，很难彻底清除病毒，需要联合应用胸腺肽、治疗性疫苗及高效价乙肝免疫球蛋白等，以提高机体对 HBV 特异性免疫反应5。2.阿德福韦酯，我国 SFDA 已批准上市的、针对肝功能代偿的成年慢性乙型肝炎患者的治疗慢性乙型肝炎的药物6。3.恩替卡韦，化学名：2-氨基-9-(1S,3S,4S)-4-羟基-3-羟甲基-2-亚甲戊基-1，9-氢-6-H-嘌呤-6-酮-水合物，属于最新的应用广泛的抗乙肝抗艾滋的一线药物7。2 核苷类似物的主要原料药胸苷的生产工艺及其定量分析研究 2.1 胸苷类似物的生产工艺路线 中国科技期刊数据库 工业 A-177-图 1 5-O-(4,4-二甲氧基三苯甲基)-2-脱氧胸苷-3-O-琥珀酸三乙胺盐合成路线 图 1 是一种典型的核苷类似物的原料药胸苷的合成路线。经过课题组多年的不断探索与实验，构建了一类反应产率和纯度都很理想的生产工艺路线，如图 1所示，可以很成功地生产 5-O-(4,4-二甲氧基三苯甲基)-2-脱氧胸苷-3-O-琥珀酸三乙胺盐（简称 dT-P）。具体的生产过程如下：2.1.1 实验材料 2-脱氧胸苷（记 2-dT 南京有为生物技术有限公司）；4,4-双甲氧基三苯甲基氯（DMT-Cl 上海麦克林生化科技有限公司）；吡啶（上海麦克林生化科技有限公司）；4-二甲氨基吡啶（上海卡努生物科技有限公司）；丁二酸酐（安徽泽升科技有限公司）；5-O-DMT-Thymidine（记 dT-02，自制，纯 度 98%）；5-O-DMT-Thymidine 3-O-Succinate Triethy lammonium Salt（记 dT-P，自制，纯 度 98%）；乙腈（色谱纯）；水；醋酸铵。2.1.2 具体生产工艺与过程 5-O-DMT-Thymidine（dT-02）的合成过程：称取 70 g 2-脱氧胸苷溶于 700 mL 干燥吡啶，降温至-10，迅速将 105 g 4.4-二甲氧基-三苯甲基氯（DMTrCl）加入溶液中，室温下搅拌 5 h，减压蒸馏除去吡啶。将所得残余物溶解在 3.0 L 二氯甲烷中，用 5%碳酸氢钠溶液洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，并浓缩至接近干燥，过柱收集所需馏分，得 124 g 产品(产率 79%，HPLC:98%)。5-O-DMT-Thymidine 3-O-Succinate Triethy lammonium Salt（dT-P）的合成过程：称取 20 g dT-02 溶于 100 mL 二氯甲烷，并加入 5.75 g 4-二甲氨基吡啶和 4.71 mg 丁二酸酐。混合溶液在室温下搅拌过夜。然后用 10%NaH2PO4水溶液洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，真空蒸发即得产品 23 g(产率 85%，HPLC:98%)。2.2 胸苷类似物的生产过程定量分析 制药领域在生产过程中一直追求严格控制原料药的纯度，以满足最终的药物以达到人民对更好健康的需求。高效液相色谱技术（HPLC）作为一种快速和可靠的技术手段，被广泛应用到药物分析、原材料和药品的分离、鉴别分析、药品稳定性的评估和药品质量控制等各个方面。相对而言，设备成本低廉、检测快速，是生产过程中较为理想的检测手段，但如何高效地运用它来实现高效地定量分析，仍是难点。为此，我们尝试建立一种全新的 HPLC 定量分析方法，以实现原料药生产过程的定量分析8。2.2.1 色谱条件及优化 色谱柱：Agilent Eclipse XDB C18 250 mm 4.6 mm 5.0 m；流动相：10 mmol/L 醋酸铵为流动相 A，乙腈为流动相 B，进行梯度洗脱（见表 1）；流速：1 mL/min；柱温：40；紫外检测波长：230 nm；进样量 1 L。表 1 流动相梯度洗脱 时间/min 流动相 B/%流动相 A/%0 10 90 10 90 10 20 90 10 21 10 90 30 10 90 2.2.1.1 检测波长的选择 根据待分析物的最大吸收峰来确定检测波长可以提高检测的灵敏度。一般来说，理想的波长是在待分析物的最大吸收峰处。同时需要确保基线平稳并且噪音较低，以便获取更准确和可靠的结果。有些情况下，特定的化合物或混合物可以在多个波长上进行检测。在这种情况下，可以选择一个具有最佳分离和检测灵敏度的波长组合来获取更多信息。采用二极管阵列检测器对 dT-P 及各中间体进行全波长扫描。在本文色谱条件下，由混合对照品溶液 DAD 图谱，选择检测波长为 230 nm。2.2.1.2 流动相的选择（1）有机相的选择 针对 HPLC 有机相的选择，可以根据所研究的化合物性质和分离目标进行选择。常见的有：正己烷（n-Hexane），适用于非极性或低极性化合物的分离，如脂肪族化合物、烷烃等。乙酸乙酯（Ethyl acetate），适用于中等极性化合物的分离，如酮类、酯类等。甲醇（Methanol）或乙醇（Ethanol）：适用于极性化合物 的 分 离，如 羟 基 化 合 物、氨 基 酸 等。乙 腈（Acetonitrile），适用于许多有机化合物、金属离子、无机盐和某些生物大分子。考虑到乙腈是一种非极性溶剂，具有高溶解度和低粘度，因此在很多化学反应和分析方法中被广泛应用。并且乙腈在紫外光区域的吸收相对较小，这有助于通过紫外检测器进行灵中国科技期刊数据库 工业 A-178-敏度较高的分析。考虑到检测波长在 230 nm，因此优先考虑乙腈为本反应的 HPLC 检测流动相的有机相。（2）水相的选择 为了选择合适的水相，开展了相关的初步探索实验，在不同流动相条件下进样，具体结果如图 2 所示。纯水为流动相时，HPLC 图谱上的各峰保留时间推迟，导致 2-dT、吡啶、dT-P 峰型重合分离效果不好。0.1%磷酸水作流动相时各峰保留时间推迟，导致 DMT-Cl、dT-P 峰型重合无法分离。选择用 0.1%的磷酸氢二钠水溶液为流动相时，HPLC 图谱上的各峰出现明显拖尾，峰型不理想。选择 10 mM 醋酸铵水溶液为流动相时，HPLC 图谱的基线平滑，各峰分离度较均大于 2，分离效果良好，因此，本论文 HPLC 检测时，选择 10 mM 醋酸铵水溶液为水相。图 2 不同溶液为流动相水相时，反应各物质的 HPLC 图谱的出峰情况 2.2.2 溶液配制（1）反应中控液：取1滴第一步反应液（约0.5 mg），加 0.5 mL 水淬灭，并用乙腈稀释至 1 mL。取 1 滴第二步反应液（约 0.5 mg），用 0.5 mL 甲醇淬灭，并用乙腈稀释至 1 mL。（2）对照品溶液：称取 2-dT、dT-P对照品各 25 mg 于两个 25 mL 容量瓶，加少量稀释剂超声溶解并定容至刻度。（3）混合对照品溶液：称取2-dT、DMT-Cl、吡啶、dT-02、dT-P 各 25 mg 于 25 mL容量瓶，加少量水稀释超声溶解，并用稀释剂定容至刻度。2.2.3 分析方法验证 2.2.3.1 反应中控 参照 2.2.2 反应中控液的配制方法进行配制。反应初始 1 小时内，每间隔 15 分钟取样、监控；1 小时以后，每间隔 30 分钟取样、监控。具体时间以取样时刻为准，对反应进行实时在线监控。以反应时间（min）为横坐标，原料和产品面积比（%）为纵坐标进行拟合得到图 3。如图 3 所示，随着反应时间的延长，原料逐渐减少，产品逐渐增多。第一步反应限度可达 77%，第二步反应限度可达 98%。这可能时因为第一步反应对水敏感，多次取样导致反应含水终止。初步的实验结果表明，我们建立的 HPLC 方法可以对 dT-P 的合成过程进行全方位的在线检测与监控。图 3 5-O-DMT-Thymidine 及 5-O-DMT-Thymidine 3-O-Succinate Triethylammonium Salt 的反应限度图 2.2.3.2 系统适应性试验 取 2.2.2 项下混合对照品溶液，按 2.2.1 项下色谱条件进样，得到 HPLC 图谱如图 4。由图 4 可见，我们建立的 HPLC 方法可以很好地实现 2-dT、DMT-Cl、吡啶、dT-02、dT-P 的基线分离。同时，主峰与周围未知杂质的分离度均大于 2，理论塔板数不低于 5000，拖尾因子均小于 2，空白溶液不干扰检测系统适应性良好。图 4 系统适用性试验结果 2.2.3.3 线性关系 HPLC 线性关系是指在一定的浓度范围内，样品溶液的峰面积或峰高与其浓度之间存在直线相关关系。中国科技期刊数据库 工业 A-179-这种线性关系是HPLC分析中一个重要的质量控制参数，对于确保分析结果的准确性和可靠性至关重要。按2.2.2项下配制供试品溶液分别逐步用稀释溶剂溶解，并逐步稀释成 7 个不同浓度的溶液作为线性试验供试品溶液，分别为 4%(40 g/mL)，20%(200 g/mL)，40%(400 g/mL)，50%(500 g/mL)，60%(600 g/mL)，80%(800 g/mL)和 100%(1000 g/mL)。按“2.2.1”项下建立的液相色谱条件将供试液从低至高浓度依次进样检测，由样品的浓度和样品的峰面积值做线性回归曲线，列出回归方程，并计算相关系数 r（如图 5 所示）。结果表明 dT-02、dT-P的质量浓度分别在 44.321108 ugmL-1（R2=0.9990）、40.961024 ugmL-1(R2=0.9995)内与峰面积呈良好的线性关系。图 5 dT-02、dT-P 的 HPLC 标准曲线 2.2.3.5 专属性试验 按2.2.2项下配制对照品溶液作为未处理样品，并按下列条件进行强制降解。1）酸处理。移取 1 mL 未破坏母液，加入 1.0 moL/L 盐酸溶液 1 mL，室温放置 3 h 后用 1.0 moL/L 氢氧化钠溶液调 pH 7；同法配制酸破坏空白。2)碱处理。移取 1 mL 未破坏母液，加入 1.0 moL/L 氢氧化钠溶液 1 mL，室温放置 3 h后用 1.0 moL/L 盐酸溶液调 pH 7；同法配制酸破坏空白。3)氧化处理。移取 1 mL 未破坏母液，加入 0.3%双氧水 1 mL，摇匀，室温放置 3 h；同法配制氧化破坏空白。4)高温处理。移取 1 mL 未破坏母液，于 60 下放置 5 h，同法配制高温破坏空白。按照2.2.1项下色谱方法进样得到如图6所示的 dT-02 和 dT-P 的强制降解实验 HPLC 谱图。由图可见，dT-02、dT-P 在高温下较稳定，在强酸、强碱、氧化条件下均会发生不同程度的降解，降解杂质与主成分的分离度均大于 1.5 符合中国药典规定，说明本方法专属性好。图 6 强制降解实验 HPLC 谱图 2.2.3.6 精密度试验 按照“2.3”项下步骤操作，制备 3 组不同浓度混合对照品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件连续进样测定 3 次，记录色谱图。测得 2-dT、DMT-Cl、吡啶、dT-02、dT-P 的基线分离.同时，主峰与周围未知杂质的分离度均大于 2，理论塔板数不低于 5000，拖尾因子均小于 2，峰面积的 RSD（n=3）均小于 1%，表明方法精密度良好。2.2.3.7 加标回收率 称取一定量 dT-P 配制成 100%对照品溶液，分别加入 50%、100%、150%的 dT-P，平行制备 3 批样品，测定其峰面积，并用外标法计算回收率(表 2)。结果显示平均回收率为 99.9%，RSD 为 0.11%，表明该方法回收率好。表 2 dT-P 样品的加标回收率数据 标样/ug 称样量/ug 实测量/ug 回收率%平均回收率/%RSD/%645 240 881.871 0.987 0.999 0.011 250 894.812 0.999 290 931.668 0.989 530 1181.334 1.012 550 1202.228 1.013 610 1262.759 1.013 740 1385.016 1.000 810 1452.230 0.997 860 1492.264 0.985 2.2.3.8 稳定性试验 药物的稳定性验证是为了确定药物在特定条件下051015202530时间（min）未处理高温碱处理酸处理氧处理A dT-02051015202530时间（min）未处理高温碱处理酸处理氧处理BdT-P中国科技期刊数据库 工业 A-180-的物理、化学和生物学特性是否得到保持，以确保其质量和有效性。本方法验证 12 小时内 2-dT、DMT-Cl、吡啶、dT-02、dT-P 在流动相中是否可以稳定存在。通过监测药物在不同时间点的含量变化，可以对药物的稳定性进行定量评估。按照“2.2.2”项下步骤操作，制备供试品溶液，间隔 1h 进样，以考察供试品溶液的稳定性，结果如图 7 所示。图 7 稳定性试验结果 供试品溶液中 2-dT、dT-02、吡啶、dT-P、DMT-Cl的峰面积的 RSD 分别为 0.802%、0.918%、0.462%、0.629%、0.443%，均小于 1.0%，综上所述，供试品溶液在室温下放置 12 h 内稳定。3 结束语 综上所述，核苷类似物是一类重要的化学原料药，是我国原料药生产实现弯道超车的机遇。因此，在最基础的原料药的生产过程中实现严格的质量管控是一条必经之路。本文提供了一种有效的在原料药生产过程中采用定量分析来实现质量管控的方法。HPLC 技术作为一种高效的、可靠的定量分析工具，被成功地开发应用于原料药的生产质量管控。HPLC 能够提供精准、准确的结果，保证原料药的质量和安全性。此外，随着技术的不断进步，相信 HPLC 在制药领域的应用也将不断扩大和深入，为我国原料药产业的滕飞，有效提高制药工艺水平，强化生产项目管控，提供良好保障，以推动制药企业可持续发展。参考文献 1WEN P,GE X,WANG Y,et al.Short-term toxicity assessment of combined use of zidovudine,lamivudine and lopinavir/ritonavir in vitro and in vivo J.Basic&Clinical Pharmacology&Toxicology,2023,133(1):82-97.2SHCHUR V V,BURANKOVA Y P,ZHAUNIAROVICH A I,et al.5-DMT-protected double-stranded DNA:Synthesis and competence to enzymatic reactions J.Analytical Biochemistry,2021,617:114115.3ZHOU X,KIESMAN W F,YAN W,et al.Development of Kilogram-Scale Convergent Liquid-Phase Synthesis of Oligonucleotides J.The Journal of Organic Chemistry,2022,87(4):2087-110.4MARLS-TORRES A,LPEZ-GARCA R,BESSA-JAMBRINA S,et al.Ultra-high-speed liquid chromatography combined with mass spectrometry detection analytical methods for the determination of nitrosamine drug substance-related impurities J.Journal of Separation Science,2023,46(13):2300125.5唐嘉悦,黄德见.拉米夫定替诺福韦片有关物质 HPLC 方法检测 J.赤峰学院学报(自然科学版),2023,39(11):16-9.6沈广志,郭强,于凤波,et al.阿德福韦酯的合成工艺优化及质量控制 J.实验室科学,2021,24(02):34-6.7陈宁.恩替卡韦的合成 J.广州化工,2023,51(12):86-9.8MOHAMED H M,SAAD A S,MORSI A M,et al.Green RP-HPLC method for simultaneous determination of sofosbuvir,ledipasvir,velpatasvir antivirals and beyond in their bulk material and co-formulated products J.Microchemical Journal,2023,186:108344.基金项目：梯度氧掺杂 AB2S4 纳米片阵列载流子分离的微观机理研究，国家自然基金项目编号为 52172174。