津力达联合通心络通过Nrf...静脉内皮细胞损伤的干预作用_郑文丽.pdf

论著基础研究基金项目：河北省中医药类科研计划课题（）第一作者简介：郑文丽，硕士，主管中药师，研究方向：中药制剂。通信作者简介：位庚，博士，主治医师，研究方向：中西医结合临床专业。津力达联合通心络通过 信号通路对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞损伤的干预作用郑文丽 魏艳婷 位 庚（石家庄市第二医院药剂科、河北省糖尿病基础医学研究重点实验室、石家庄市糖尿病精准诊疗技术创新中心，河北省石家庄市；石家庄市第四医院药剂科，河北省石家庄市）【摘要】目的 探讨津力达联合通心络通过核因子 相关因子（）血红素氧合酶（）信号通路对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞（）损伤的干预作用。方法将 分成正常对照组、模型组、津力达组、通心络组、联合用药组，正常对照组细胞采用含 葡萄糖的 培养，模型组、津力达组、通心络组、联合用药组细胞采用含 葡萄糖的 培养，津力达组加入 的津力达贮存液，通心络组加入 的通心络贮存液，联合用药组加入 的津力达贮存液和 的通心络贮存液。采用 法检测各组细胞活力，采用克隆形成实验检测各组细胞的克隆形成数量，采用 检测细胞侵袭能力，采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率，采用划痕实验检测各组细胞迁移率，采用 检测各组细胞的炎症因子水平，检测各组细胞的氧化应激相关指标水平，采用 检测各组细胞的、蛋白表达量。结果 与正常对照组相比，模型组细胞的活力、克隆形成数量、侵袭细胞数量、细胞迁移率均降低，细胞凋亡率升高，细胞间黏附分子（）、肿瘤坏死因子（）、白细胞介素（）、丙二醛、乳酸脱氢酶（）水平均升高，超氧化物歧化酶（）、一氧化氮、一氧化氮合成酶（）水平及、蛋白表达量均降低（均 ）；与模型组相比，津力达组、通心络组和联合用药组细胞的活力、克隆形成数量、侵袭细胞数量、细胞迁移率均升高，细胞凋亡率均降低，、丙二醛、水平均降低，、一氧化氮、水平及、蛋白表达量均升高，且联合用药组上述指标均优于津力达组和通心络组（均 ）。结论 津力达和通心络均通过抑制炎症反应和氧化应激反应来减轻高糖所致的 损伤，且联合用药效果更好，其机制可能与激活 信号通路有关。【关键词】人脐静脉内皮细胞；高糖损伤；津力达；通心络；核因子 相关因子；血红素氧合酶；炎症因子；氧化应激【中图分类号】【文献标识码】【文章编号】（）：，（，；，）【】（）（）（），广西医学 年 月第 卷第 期 ，（），（），（），（），（），（），（），；，（），【】，糖尿病是由环境和遗传因素相互作用导致胰岛素分泌相对或绝对不足，或者组织细胞对胰岛素敏感性相对降低，而引起的脂肪、糖、蛋白和电解质等一系列代谢紊乱。糖尿病可引起一系列微血管和大血管并发症，例如糖尿病肾病、视网膜病变、神经病变和心脑血管疾病等，严重影响患者的生活质量。研究表明，糖尿病是我国继心脑血管疾病和肿瘤疾病之后的第三大非传染性慢性疾病，严重威胁着居民健康。有学者发现，炎症和氧化应激在糖尿病患者的心血管病变的发病中起着至关重要的作用，高血糖引发的蛋白激酶 激活、细胞内糖基化终产物增加等都与线粒体产生过多的活性氧簇相关，并最终导致氧化应激。目前糖尿病主要以药物治疗为主，新药的研发和应用对于疾病的治疗具有重要意义。本研究观察津力达联合通心络通过核因子 相关因子（，）血红素氧合酶（，）信号通路抑制高糖诱导损伤的人脐静脉内皮细胞（，）的炎症和氧化应激反应，现报告如下。材料与方法 主要药物、试剂和仪器 购自中国科学院上海细胞库。津力达干粉、通心络超微粉购自石家庄以岭药业股份有限公司（批号：、）；、胎牛血清、青霉素链霉素双抗均购自宝生物工程（大连）有限公司（批号：、）；试剂盒、细胞凋亡检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；、一抗均购自 公司（批号：、）；丙二醛、超氧化物歧化酶（，）、一氧化氮合酶（，）、一氧化氮检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所（批号：、）；葡萄糖培养基、结合缓冲液、乳酸脱氢酶（，）、细胞裂解液均购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；细胞间黏附分子（，）、肿瘤坏死因子（，）、白细胞介素（，）、，检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所（批号：、）；流式细胞仪购自，；酶标仪购自 公司。实验方法 细胞培养：采用含 胎牛血清的，并置于、相对湿度为 的培养箱中进行培养，根据细胞的生长贴壁情况约每 更换培养基一次，待细胞生长至融合度为 时进行传代培养。药物配置和细胞分组干预：取津力达干粉 和通心络超微粉 ，分别溶于 含 胎牛血清、青霉素链霉素双抗的，使用超声波震动 促进药物溶解，然后在 下以 离心 ，将获得的沉淀物采用 的羧甲基纤维素钠微孔滤器过滤，将所有沉淀物加热烘干，配制成 的津力达贮存液和 的通心络贮存液。将处于对数生长期的 分成正常对照组、模型组、津力达组、通心络组、联合用药组，正常对照组细胞采用含 葡萄糖的 培养；模型组、津力达组、通心络组、联合用药组细胞均采用含 葡萄糖的 培养，在此基础上，津力达组加入 的津力达贮存液，通心络组加入 的通心络贮存液，联合用药组加入 的津力达贮存液和 的通心络贮存液。各组细胞均培养 后进行后续实验。法检测细胞活力：将处于对数生长期的 以 个 孔的密度接种于 孔板，按 的方法对细胞进行分组并干预 后，继续培养 ，弃掉各组 原有培养基，每孔加入 的 工作液，室温孵育 ，采用酶标仪检测 波长处的吸光度值。按照公式计算细胞活力，细胞活力 （实验组吸光度值 空白对照吸光度值）（正常对照组吸光度值 空白对照吸光度值），其中空白对照为仅加入培养液的空白培养孔。实验重复 次。克隆形成实验检测细胞克隆形成能力：将处于对数生长期的 以 个 孔接种于 孔板，按 的方法对细胞进行分组并干预 后，将 的琼脂与 以 的比例混匀，加入细胞中，再将细胞培养板放入 、培养箱内培养 周，肉眼可观察到克隆形成时终止培养，采用 洗涤 次，次，采用 的甲醇固定，结晶紫染色，自来水冲洗晾干后于显微镜（）下拍照计数。克隆形成率 （克隆数 接种细胞数）。实验重复 次。检测细胞侵袭能力：（）小室的准备。取出冻存于 的基质胶，溶解后过夜。将溶解后的基质胶与无血清的 培养基按照 混合后，取 混合液加入 小室的上室内，将 小室置于培养箱孵育 后取出，于 小室的下室加入 无血清的 培养基，于上室内加 无血清的 培养基，孵育 。（）实验。将处于对数生长期的 以 个 接种于 孔板，按 的方法对细胞进行分组并干预 后，弃上清液，加入无血清的 培养基，置于 、培养箱培养 后，收集细胞，制备单细胞悬液，下以 离心，弃上清液，调整细胞密度为 个，将 单细胞悬液加入 上室，将调整密度后的细胞加入下室，加入含 胎牛血清的 培养基 ，将 小室置于、培养箱中培养 后，用棉签拭去膜上的细胞后，在小室中添加甲醛溶液固定细胞，使用 结晶紫溶液染色，显微镜（）下记录 个视野的细胞数，取 个视野的平均值。实验重复 次。划痕实验检测细胞迁移能力：将处于对数生长期的 以 个 孔接种于 孔板，采用 枪头在孔板底部垂直画线，按 的方法对细胞进行分组并干预 后，采用 冲洗 次，次，在倒置显微镜下拍照记录 和 的细胞迁移情况，计算 的迁移率，细胞迁移率 迁移面积 划痕面积。实验重复 次。流式细胞仪检测细胞凋亡情况：将处于对数生长期的 以 个 孔接种于 孔板，按的方法对细胞进行分组并干预 后，加入 结合缓冲液，再分别加入 染色液，混匀后避光反应 ，另加入 结合缓冲液混匀，使用流式细胞仪检测细胞凋亡率，细胞凋亡率 凋亡细胞数（凋亡细胞数 正常细胞数）。实验重复 次。检测炎症因子水平：将处于对数生长期的 以 个 孔接种于 孔板，按 的方法对细胞进行分组并干预 后，收集各组，下以 离心，收集上清液，严格按照 检测试剂盒说明书进行操作，检测 、和 水平，实验重复 次。氧化应激相关指标的检测：将处于对数生长期的 以 个 孔接种于 孔板，按 的广西医学 年 月第 卷第 期方法对细胞进行分组并干预 后，收集上清液，采用硫代巴比妥酸显色法检测丙二醛水平，用黄嘌呤氧化酶法测定 水平，用重叠比色法检测 水平，用硝酸还原酶法检测一氧化氮水平，用比色法检测 水平，检测方法严格参照各试剂盒产品说明书进行操作。实验重复 次。检测、蛋白表达量：将处于对数生长期的 以 个 孔接种于 孔板，按 的方法对细胞进行分组并干预 后，收集各组，采用 细胞裂解液裂解细胞，提取各组细胞的总蛋白，采用二喹啉甲酸法进行蛋白定量。取 蛋白进行，然后将蛋白转移到 膜上，采用 的脱脂奶粉封闭液在室温下封闭 膜 ，加入 一抗（以 比例稀释）、一抗（以 比例稀释）和 一抗（以 比例稀释），摇床孵育过夜后加入 荧光二抗（公司，批号：；以 比例稀释），室温孵育 后采用 红外荧光成像仪扫描成像，以目的蛋白（、）条带的灰度值 内参蛋白（）条带的灰度值作为目的蛋白的相对表达量。实验重复 次。统计学分析 采用 软件进行统计分析。计量资料以（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用 检验。以 为差异有统计学意义。结 果 组 活力的比较与正常对照组相比，模型组细胞活力降低（）；与模型组比较，津力达组、通心络组和联合用药组细胞活力均升高，且联合用药组细胞活力均高于津力达组和通心络组（均 ），而津力达组和通心络组细胞活力差异无统计学意义（）。见表。表 组 活力、克隆形成能力、侵袭能力的比较（）组别细胞活力（）克隆形成数量（个 视野）侵袭细胞数量（个 视野）正常对照组 模型组 津力达组 通心络组 联合用药组 值 值 注：与模型组比较，；与联合用药组比较，。组 克隆形成能力的比较 与正常对照组相比，模型组细胞的克隆形成数量减少（）；与模型组比较，津力达组、通心络组和联合用药组细胞的克隆形成数量均增加，且联合用药组细胞的克隆形成数量均多于津力达组和通心络组（均 ），而津力达组和通心络组细胞的克隆形成数量差异无统计学意义（）。见表、图。图 组 克隆形成情况（）组 侵袭能力的比较 与正常对照组相比，模型组的侵袭细胞数量减少（）；与模型组比较，津力达组、通心络组和联合用药组的侵袭细胞数量均增加，且联合用药组中的侵袭细胞数量均多于津力达组和通心络组（均 ），而津力达组和通心络组的侵袭细胞数量差异无统计学意义（）。见表、图。，图 组 的侵袭能力 组 迁移能力的比较 与正常对照组相比，模型组的细胞迁移率降低（）；与模型组比较，津力达组、通心络组和联合用药组的细胞迁移率均升高，且联合用药组的细胞迁移率均高于津力达组和通心络组（均 ），而津力达组和通心络组的细胞迁移率差异无统计学意义（）。见表、图。表 组细胞迁移率、细胞凋亡率的比较（，）组别细胞迁移率细胞凋亡率正常对照组 模型组 津力达组 通心络组 联合用药组 值 值 注：与模型组比较，；与联合用药组比较，。图 组 的迁移能力 组 凋亡情况的比较 与正常对照组相比，模型组的细胞凋亡率升高（）；与模型组比较，津力达组、通心络组和联合用药组的细胞凋亡率均降低，且联合用药组的细胞凋亡率均低于津力达组和通心络组（均 ），而津力达组和通心络组的细胞凋亡率差异无统计学意义（）。见表、图。图 组 的凋亡率检测结果 组 炎症因子水平的比较 与正常对照组相比，模型组细胞的、水平均升高（均 ）；与模型组比较，津力达组、通心络组和联合用药组细胞的、水平均降低，且联合用药组细胞的、水平均低于津力达组和通心络组（均 ），而津力达组和通心络组细胞的、水平差异均无统计学意义（均 ）。见表。广西医学 年 月第 卷第 期表 组细胞炎症因子水平的比较（）组别（）（）（）（）正常对照组 模型组 津力达组 通心络组 联合用药组 值 值 注：与模型组比较，；与联合用药组比较，。组 氧化应激相关指标水平的比较 与正常对照组相比，模型组细胞的丙二醛、水平均升高，、一氧化氮、水平均降低（均 ）；与模型组比较，津力达组、通心络组和联合用药组细胞的丙二醛、水平均降低，、一氧化氮、水平均升高（均 ），且联合用药组细胞的丙二醛、水平均低于津力达组和通心络组，、一氧化氮、水平均高于津力达组和通心络组（均 ），而津力达组和通心络组上述指标差异均无统计学意义（均 ）。见表。表 组细胞氧化应激相关指标水平的比较（）组别丙二醛（）（）一氧化氮（）（吸光度值）（）正常对照组 模型组 津力达组 通心络组 联合用药组 值 值 注：与模型组比较，；与联合用药组比较，。组 、蛋白表达量的比较 与正常对照组相比，模型组细胞的、蛋白表达量均降低（均 ）；与模型组比较，津力达组、通心络组和联合用药组细胞的、蛋白表达量均升高，且联合用药组细胞的、蛋白表达量均高于津力达组和通心络组（均 ），而津力达组和通心络组细胞的、蛋白表达量差异均无统计学意义（均 ）。见表、图。表 组细胞、蛋白相对表达量的比较（）组别正常对照组 模型组 津力达组 通心络组 联合用药组 值 值 注：与模型组比较，；与联合用药组比较，。图 各组 的蛋白条带图 讨 论 糖尿病是以慢性血糖水平升高为特征的代谢性疾病，该病由胰岛素分泌和 或作用缺陷所引起。糖尿病可引起碳水化合物、脂肪、蛋白质的代谢紊乱，最终导致多系统损害，如神经损伤、糖尿病肾病、视网膜病变、心血管病变等，严重者甚至可以导致器官功能衰竭，但对于大多数糖尿病患者而言，其病情是可以有效控制的。早期强化血糖控制，可以明显减少糖尿病相关并发症的发生。津力达是由人参、苍术、苦参、黄精等 味中药 ，组成的复方制剂，具有益气养阴、健脾运津的功效，降糖效果较好，能够有效改善糖尿病患者的症状。通心络是吴以岭院士基于“络病学说”拟定的通络脉代表药方，能够有效降低糖尿病患者的血肌酐、蛋白尿、空腹血糖等指标，具有肾脏保护作用。关于津力达联合通心络对高糖诱导 损伤的干预作用及机制已有相关研究报告，但其通过 信号通路在高糖诱导的 损伤中的干预作用鲜有报告，因此，本研究基于 信号通路探讨津力达联合通心络抑制高糖诱导 损伤的潜在机制，以明确其是否通过改善内皮细胞的炎症反应和氧化应激反应发挥治疗糖尿病的作用。本研究结果显示，与正常对照组相比，模型组细胞活力、克隆形成能力、侵袭能力、迁移率均降低，细胞凋亡率升高，且、丙二醛、水平均升高，、一氧化氮、水平均降低，说明高糖诱导可损伤，降低 的存活率，加剧炎症反应及氧化应激反应。与模型组相比，津力达组、通心络组和联合用药组细胞活力、克隆形成数量、侵袭细胞数量、细胞迁移率均升高，细胞凋亡率均降低，、丙二醛、水平均降低，、一氧化氮、水平均升高，且联合用药组上述指标的改善均优于津力达组和通心络组（均 ），这说明津力达和通心络均可减轻高糖所致的炎症反应和氧化应激反应，提高细胞活力、改善细胞生物学行为、降低细胞凋亡率。而联合用药可能具有叠加作用，因此联合用药组的改善效果较单一用药组更明显。研究表明，津力达联合通心络能够改善高糖诱导的小鼠胰岛内皮细胞内皮功能损伤，并通过减轻氧化应激损伤发挥细胞保护作用，其结果与本研究类似。高血糖诱导的自由基产生和氧化应激反应促进了糖尿病及相关并发症的发生和发展，活性氧簇是线粒体产生的氧自由基，参与细胞的增殖、凋亡、迁移和氧化应激等活动。在氧化应激反应中发挥抑制作用：转移到细胞核中可激活抗氧化应答元件，导致 的表达增加，从而下调细胞内活性氧簇的水平。因此，信号通路是调控氧化应激的重要靶点。有研究表明，游离的 与 结合后可介导下游的固有免疫应答过程，减轻各种感染性疾病的炎症反应，也可直接抑制促炎因子的产生，表明 信号通路在炎症反应中发挥重要的作用。本研究结果显示，与正常对照组相比，模型组的、蛋白表达量均降低（均 ）；与模型组比较，津力达组、通心络组和联合用药组中的、蛋白表达量均升高，且联合用药组中的、蛋白表达量均高于津力达组和通心络组（均 ），说明津力达和通心络可能通过激活 信号通路，发挥抑制高糖所致炎症反应和氧化应激反应的作用，从而改善 损伤，而联合用药的效果更为明显，但具体机制仍需要进一步研究。综上所述，津力达和通心络均可通过抑制高糖所致的炎症反应和氧化应激反应，来减轻高糖所致的 损伤，且联合用药效果更显著，其机制可能与激活 信号通路有关。参 考 文 献 吕佳璇，李月红 糖尿病肾病的研究进展 临床内科杂志，（）：，：王亚昕，贺星星，马晓静，等 血糖、血压等变异度与糖尿病心血管并发症的研究进展 中华内科杂志，（）：李雪英，杨丽霞，姜良恩，等 炎症因子在糖尿病肾病发病机制中的中西医研究述评 世界中西医结合杂志，（）：汪 容，曹和欣 炎症及氧化应激机制与糖尿病肾病关系 辽宁中医药大学学报，（）：，（）：罗伟昭 糖尿病早期肾损伤诊断中尿糖、尿微量白蛋白联合检验的临床研究 临床检验杂志（电子版），（）：尤良震，林逸轩，方朝晖，等 黄芪甲苷治疗糖尿病及其并发症药理作用研究进展 中国中药杂志，（）：李 琳，陈夏 津力达颗粒治疗糖尿病前期临床疗效 陕西中医，（）：王静娜，侯瑞田，金凤表，等 通心络胶囊对 型糖尿病合并冠心病病人氧化应激的影响 中西医结合心脑血管病杂志，（）：庞 洁，梁俊清，王志鑫，等 津力达联合通心络对高糖诱导胰岛微血管内皮细胞损伤干预作用及机制研究中国药理学通报，（）：广西医学 年 月第 卷第 期 ，：，（）：，（）：，（）：，：，（）：（收稿日期：修回日期：）（上接第 页）李齐云，马东东，张珍珍 磁共振成像在鉴别诊断浸润性导管癌与肿块型肉芽肿性乳腺炎中的价值分析 山西医药杂志，（）：唐玲玲，刘成义，纪存委，等 肉芽肿性乳腺炎的病原菌分布及药敏分析 中国抗生素杂志，（）：刘晓雁，佟琳，罗强，等 肉芽肿性小叶性乳腺炎细菌学分析 广东医学，（）：罗 强，林 敏，徐 宁，屈平华 化脓性乳腺炎病原菌分型对比分析 广东医学，（）：，：，（）：鲁嘉，刘赫，姜玉新，等 肉芽肿性乳腺炎的超声表现及临床、病理分析 中国医学影像技术，（）：唐振华，李开坤，谢芳，等 基于高通量测序技术分析患乳腺炎水牛生乳中的细菌多样性 中国乳品工业，（）：，（），（）：陈惠娴，于海静，谢四梅，等 肉芽肿性乳腺炎棒状杆菌检测对临床用药的指导意义 中华内分泌外科杂志，（）：刘 恒，张宏伟，丁松涛，等 肉芽肿性乳腺炎的临床特征分析 中国全科医学，（）：，（）：赵中华，高 丹，程丽萍，等 细菌感染在肉芽肿性小叶性乳腺炎发病中的作用及病原菌分布和药敏性分析 中国妇幼健康研究，（）：，（）：黄汉扬，贾卫娟，黄静吟，等 激素联合手术治疗肉芽肿性乳腺炎疗效观察 海南医学，（）：，：，（）：（收稿日期：修回日期：）（上接第 页），（）：，：，（）：，（）：牛广林，程昌盛，潘卫珍，等 铁蛋白与肝脏疾病关系的研究进展 吉林医学，（）：，（）：，（）：，（）：，：（收稿日期：修回日期：），