急性高原病发生相关SNP位点的筛选及分析_郑凯.pdf

DOI:10.13276/j.issn.2097-1656.2023.03.009临床医学急性高原病发生相关 SNP 位点的筛选及分析郑凯1，2，李晓兰1，王静2，巩丽1，张伟1(1空军军医大学唐都医院病理科，陕西 西安 710038;2解放军联勤保障部队第九六医院消化内科，山东 济南 250031)基金项目:国家自然科学基金(81900467);空军军医大学唐都医院军事医学攻坚项目(2020YXGJ004)作者简介:郑凯，硕士研究生，从事急性高原病影响因素研究，Tel:[phone]，E-mail:通信作者:张伟，Tel:[phone]，E-mail:zhwlyh ;巩丽，Tel:[phone]，E-mail:glzwd16 网络首发:https:/ 目的筛选并确定与急性高原病(AMS)发生相关的单核苷酸多态性(SNP)位点，在遗传学水平为 AMS 发生的风险评估和预警提供理论依据手段。方法对久居中国西北地区急进西藏阿里地区 395 名人员进行血样采集和基因组 DNA 提取，并根据 AMS 路易斯湖评分标准进行评分分组:总分 3 分为病例组，认为其发生 AMS;总分3 分为对照组，认为其未发生 AMS。然后通过 MASSAAY 飞行质谱法进行候选 SNP 位点检测。最后，应用 软件中的 O 值评估单个位点与疾病的相关性，并在共显性、显性、隐性三种基因模型上分析。结果rs479200、rs12406290、rs2790859、rs480902 和 rs3025030 位点等位基因频率在病例组与对照组的比较中差异显著，具有统计学意义(P 0.05)。结论AMS 的发生可能与特殊的 SNP 位点相关。利用 MASSAAY 飞行质谱法筛查 AMS 相关 SNP 位点是一种准确、高效的方法。本研究可为下一步更广区域、更多样本量筛查验证SNP 位点提供基础，并为建立以特定基因为基础的表达网络，为准确预警 AMS 的发生风险提供理论依据。关键词 急性高原病;单核苷酸多态性;MASSAAY 中图分类号 594.3 文献标志码 AScreening and analysis of SNP loci related to acute mountain sicknessZHENG Kai1，2，LI Xiaolan1，WANG Jing2，GONG Li1，ZHANG Wei11Department of Pathology，Tangdu Hospital，Air Force Medical University，Xian 710038，China;2Department ofGastroenterology，960th Hospital of the PLA Joint Logistics Support Force，Jinan 250031，China Abstract ObjectiveTo screen and identify single nucleotide polymorphism(SNP)loci associated with theoccurrence of acute mountain sickness(AMS)，so as to provide a theoretical basis for risk assessment and early warning ofAMS occurrence at the genetic level.MethodsBlood samples were collected and genomic DNA was extracted from 395people who lived in northwest China for a long time and rushed to Ngari，Tibet.They were scored and grouped according toLake Louise Score for AMS，with a total score 3 as the case group，which was considered to have AMS，and a total score3 as the control group，which was considered not to have AMS.Then the candidate SNP loci were detected byMASSAAY.Finally，the O value in software was used to evaluate the correlation between a single locus and thedisease and analyze on co-dominant，dominant，and recessive gene models.esultsrs479200，rs12406290，rs2790859，rs480902 and rs3025030 allele frequencies were significantly different between the case group and the control group(P 0.05)ConclusionThe occurrence of AMS may be associated with special SNP loci.MASSAAY is an accurateand efficient method for screening AMS-related SNP loci.This study can provide a basis for further screening and validatingSNP loci in a wider region and with a larger sample size，and provide a theoretical basis for establishing a specific gene-based expression network and a more accurate risk warning for the occurrence of AMS.Key words acute mountain sickness;single nucleotide polymorphism;MASSAAY932空军军医大学学报2023 年 3 月第 44 卷第 3 期http:急性高原病(acute mountain sickness，AMS)是指平原人快速进驻海拔 3 000 m 以上高原时，因缺氧发生头昏、头痛、恶心、呕吐、心慌、气短、食欲减退和乏力，甚至出现肺水肿、脑水肿等一系列症状的综合征1。AMS 的危害在病理生理上主要是缺氧对身体各系统的损伤，静脉血栓的形成在其发生和发展过程中起着不可替代的作用2。AMS 按临床症状由轻到重可分为急性高原反应、高原肺水肿、高原脑水肿。急性高原反应发病率最高，尽管高原肺水肿、高原脑水肿发病率相对较低，但一旦发生，危害巨大3。AMS 的发生受多种因素的影响，包括海拔高度、季节、运输方式、年龄、心理、睡眠、运动、药物、既往暴露情况、基因多态性等4 9。近年来，大量研究表明 AMS 具有遗传易感性，其可能与血管紧张素转换酶基因、血管紧张素原基因、内皮一氧化氮合酶基因、低氧诱导因子基因、血管内皮生长因子基因等相关，但 研 究 结 果 不 一。单 核 苷 酸 多 态 性(singlenucleotide polymorphism，SNP)是指由单个核苷酸的变异所引起的 DNA 序列多态性，其研究领域涉及肿瘤学、人类罕见病、生物信息工程等10。目前，国内外对 SNP 与 AMS 相关性的研究多采用凝胶电泳、分子杂交、实时荧光 PC 等，存在工作量大、分析的样本量少且位点单一化的问题。MASSAAAY 飞行质谱检测系统是一种将多重聚合酶链式反应(polymerasechain reaction，PC)与基质辅助激光解吸电离 飞行时间质谱分析(matrix-assisted laser desorption/ionizationtime-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)相结合，能够定量分析多个样品基因表达差异、分子量差异的方法，具有准确、灵敏和高通量的特点。本研究在前期通过文献筛选 96 个与 AMS 发生可能相关的SNP 位点的基础上，应用 MASSAAY 飞行质谱检测系统对 395 名久居中国西北地区急进西藏阿里地区的健康男性行 SNP 分型及验证分析，筛选出显著差异的SNP 位点，为今后 AMS 发生的风险评估和基因预警的建立提供理论依据。1对象与方法1.1对象采用回顾性研究的方法，经空军军医大学唐都医院伦理委员会批准(TDLL第 202212-01 号)，收集2020 年1 月至2020 年9 月急进西藏阿里地区健康男性395 名，纳入标准:符合久居中国西北地区健康男性急进高原要求，既往无高地旅居史;自愿配合问卷及采样，条理清晰，填写内容完整;身心健康，既往无 AMS 相似或相关循环系统、呼吸系统、神经系统、消化系统等疾病、遗传病史及家族史;研究对象急进高原的高度、运输方式、药物预防、运动情况等大体在同一水平;符合急性高原病路易斯湖评判标准。排除标准:受试者不符合中国西北地区健康男性的人群、地域要求;患有精神类疾病等原因无法配合问卷调查;患有偏头痛等与 AMS 相似或相关循环系统、呼吸系统、神经系统、消化系统疾病、遗传病史及家族史;受试者已服药或接受过干预;问卷填写内容缺失等不满足急性高原病路易斯湖评判标准。1.2方法1.2.1目的位点获得综合国内外相关文献，筛选与 AMS 相关的 SNP 位点，最终确定 96 个 SNP 位点并合成相应引物。1.2.2DNA 提取经受试者同意，每人抽取 5 mL静脉血，于冰箱 80 冻存，用于提取基因组 DNA。采用血液基因组 DNA 提取试剂盒(天根公司，中国)行外 周 血 全 基 因 组 DNA 提 取。采 用 美 国 热 电ND2000 紫外分光光度仪，测量 DNA 浓度与纯度。每个样本测量 2 次，取平均值。如果两次测量误差大于10%则测量第 3 次，取相近 DNA 浓度的平均值。将DNA 样本于冰箱 20 冻存备用。1.2.3SNP 位点检测应用美国 Agena Bioscience 公司的 MASSAAY 核酸质谱分析系统，对所有样本行SNP 位点检测。将稀释后的 DNA 样本吸取至 96 孔板中，在 PC 仪上依次进行扩增反应、虾碱性磷酸酶消化反应、延伸反应，经样本脱盐，点样到芯片，使用MALDI-TOF MS 质谱仪获得数据信息。1.2.4质量控制病例组和对照组中所有检测 SNP位点都需遵循哈迪温伯格定律(Hardy WeinbergEquilibrium，HWE)，次要等位基因频率大于 0.05。1.2.5统计学分析关联研究是目前评价疾病基因易感性研究的常用方法。本研究中单个位点与 AMS的相关关系，采用 O 值来评估。应用 SPSS 26.0 对一般资料进行统计描述和分析，数据以!x s 表示，采用 t 检验，应用 4.03 进行 SNP 关联分析，采用共显性模型:杂合型/野生型，纯和型/野生型;显性模型:杂合型+纯和型/野生型;隐性模型:纯和型/杂合型+野生型三种模型进行数据分析，计数资料以n(%)表示。042http:J Air Force Med UnivVol.44 No.320232结果2.1一般资料本研究纳入 395 名研究对象，年龄 18 35(平均23.57 3.55)岁，身高 162 193(平均 173.66 5.10)cm，体质量 50 95(平均 66.09 8.04)kg。根据 AMS 路易斯湖评分标准，定义为近期抵达高原，出现头痛及以下至少 1 种症状:胃肠道症状(食欲不振、恶心或呕吐)，疲乏或虚弱无力，头晕或头昏眼花、睡眠障碍，各种症状按轻、中、重依次记为 1、2、3 分，总分 3 分为 AMS11，分为病例组 186 例(总分 3 分，认为其发生 AMS)，对照组 209 例(总分3 分，认为其未发生 AMS)。两组研究对象在年龄、身高、体质量上差异无统计学意义(表1)。表 1两组一般资料比较(x s)组别n年龄/岁身高/cm体质量/kg对照组20923.31 3.39173.37 5.0166.06 7.97病例组18623.87 3.71174.00 5.1966.12 8.152.2基因质量控制病例组和对照组差异显著位点 rs479200、rs12406290、rs2790859、rs480902 和 rs3025030 经2检验，均满足P 0.05，可认为样本人群位点信息服从 HWE。位点次要等位基因频率依次为 38.0%、43.4%、49.0%、39.6%和 17.3%，均满足次要等位基因频率大于 0.05(表 2)。表 2基因质量控制位点主要等位次要等位主要等位基因频率/%HWE 的 P 值样本病例组对照组rs479200AG62.00.087 90.246 00.323 0rs12406290AG56.60.682 10.876 40.580 4rs2790859CT51.00.920 01.000 00.676 4rs480902CT60.40.916 21.000 00.779 6rs3025030GC82.71.000 00.115 10.053 3HWE:哈迪 温伯格定律。2.3SNP 位点聚类图经 MASSAAY 飞行质谱检测系统检测，以设计完成的点样版为标准，根据待测位点的碱基分布，在电脑屏中显示的聚类图见图 1。以 rs479200(n=93)为例，三条虚线代表三个方向，三种象限代表三种不同的基因型，分别是野生型、杂合型、突变型。蓝色代表野生型，绿色代表杂合型，褐色代表突变型。No call(1)，Other(1)代表质控，1 说明在原点。G(18)代表碱基对为 GG 有 18，GA(40)代表碱基对为 GA 有 40，A(35)碱基对为 AA 有 35。依此获得待测碱基的频数。2.4与 AMS 发生密切相关的 SNP 位点分析应用 软件，所有检测的 96 个位点中，rs479200在共显性和显性模型上，rs12406290 在共显性、显性和隐性模型上，rs2790859 在共显性、显性和隐性模型上，rs480902 在显性模型上，rs3025030 位点在共显性和显性模型上显示显著关联，差异有统计学意义(P 0.05，表 3)。A:原始真实图像;B:均一化生成图像。图 1rs479200 位点聚类图(n=93)142空军军医大学学报2023 年 3 月第 44 卷第 3 期http:表 3两组显著 SNP 位点数据比较n(%)组别rs479200共显性A/AG/AG/G显性A/AG/A-G/G隐性A/A-G/AG/G病例组87(46.8)a75(40.3)a24(12.9)a87(46.8)a99(53.2)a162(87.1)24(12.9)对照组73(34.9)95(45.5)41(19.6)73(34.9)136(65.1)168(80.4)41(19.6)组别rs12406290共显性A/AA/GG/G显性A/AA/G-G/G隐性A/A-A/GG/G病例组70(37.6)a90(48.4)a26(14.0)a70(37.6)a116(62.4)a160(86.0)a26(14.0)a对照组54(25.8)109(52.2)46(22.0)54(25.8)155(74.2)163(78.0)46(22.0)组别rs2790859共显性C/CT/CT/T显性C/CT/C-T/T隐性C/C-T/CT/T病例组59(31.7)a91(48.9)a36(19.4)a59(31.7)a127(68.3)a150(80.6)a36(19.4)a对照组43(20.6)108(51.7)58(27.8)43(20.6)166(79.4)151(72.2)58(27.8)组别rs480920共显性C/CT/CT/T显性C/CT/C-T/T隐性C/C-T/CT/T病例组77(41.4)86(46.2)23(12.4)77(41.4)a109(58.6)a163(87.6)23(12.4)对照组66(31.6)105(50.2)38(18.2)66(31.6)143(68.4)171(81.8)38(18.2)组别rs3025030共显性G/GG/CC/C显性G/GG/C-C/C隐性G/G-G/CC/C病例组114(61.3)a68(36.6)a4(2.2)a114(61.3)a72(38.7)a182(97.8)4(2.2)对照组156(74.6)45(21.5)8(3.8)156(74.6)53(25.4)201(96.2)8(3.8)aP 0.05 vs 对照组。3讨论随着我国的发展，高原地区如西藏、青海等城市在旅游、经济、军事方面的价值体现，因各种原因急进高原地区的人员越来越多。因此，AMS 的发生增多。AMS 的发生是环境因素、自身因素、遗传因素等综合作用的结果。其中，海拔高度及上升速度在 AMS发生中影响巨大12。患者主要表现为进入高原的6 12 h 出现头痛、头晕、胃肠道不适、疲劳等症状。目前，AMS 的诊断多采用的是路易斯湖评分标准。遗传因素在 AMS 的发生具有重要作用，因此阐明 AMS的基因易感性及风险预警对预防疾病及降低伤害具有重要意义。在已有的研究中，AMS 相关候选基因及位点的研究大多通过智能数字化科技、全基因组关联研究、缺氧通路分析、meta 分析等获得13。但都存在一定的局限性，位点范围广且无法满足针对特定人群的位点筛查。MASSAAY 飞行质谱检测系统是基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术原理，通过 PC 扩增目标序列，加入 SNP 序列特异延伸引物，在 SNP 位点上延伸一个碱基。将制备的样品分析物与芯片基质共结晶后在质谱仪的真空管经强激光激发，核酸分子分解吸附为单电荷离子，电场中离子飞行时间与离子质量成反比，通过检测核酸分子在真空管中的飞行时间而获得样品分析物的精确分子量，从而检测 SNP 位点信息14。该技术分析准确，且可同时分析数十上百个SNP 位点。本研究中，我们采用该方法对候选的 96 个SNP 位点进行进一步筛选和验证，结果显示中国西北地区健康男性人群 AMS 的发生与 rs479200、rs12406290、rs2790859、rs480902、rs3025030 位点高度关联。其中，rs479200、rs12406290、rs2790859 和 rs480902 位 于egl-9 家 族 低 氧 诱 导 因 子 1(egl-9 family hypoxia-242http:J Air Force Med UnivVol.44 No.32023inducible factor 1，EGLN1)基因。EGLN1 基因，又称PHD2，是脯氨酸羟化酶家族的一个成员，是细胞的“氧 感 受 器”。EGLN1 能 够 调 控 HIF-1 的 降 解，EGLN1 功能降低可引起 HIF-1 在组织中蓄积，使得HIF-1 升高，而诱导一系列低氧反应基因的转录，对缺氧反应的细胞进行调控，如促进红细胞、血管生成，诱导一氧化氮合酶和糖酵解等，从而提高细胞对缺氧环境的耐受15。SHAMA 等16 利用电泳迁移率测定、液相色谱与串联质谱和超迁移试验解释了rs479200 发挥作用的生物信息基础，证实了等位基因的差异性表达，发现了 rs479200T 的 ho GDP 解离抑制剂 1 和 rs480902C 的低氧调控蛋白 1 结合，对接模拟研究显示 DNA 构象变化。也有研究应用群分化指数通过遗传距离的统计比较汉族和藏族群体发生和未发生 AMS 的人群在 EGLN1 基因上的不同时，发现在rs516651、rs480902 上有显著差异，并认为其发生机制可能是通过心率影响氧饱和度，从而达到对缺氧耐受性的影响17。而国外一项对安第斯土著人生理特性的研究发现在 rs508618、rs1769729 上差异具有显著性，并认为这种差异是 EGLN1 基因变异，最终通过高血红蛋白浓度以达到缺氧耐受的结果18。我们的研究验证了 rs479200、rs480902 位点与 AMS 发生的相关性，同时提示了针对中国西北地区健康男性在 AMS 的易感性筛选上，rs12406290、rs2790859 差异更明显。这种差别的产生可能与人群遗传背景的差异及自然选择相关。rs3025030 位于 VEGFA 基因，VEGFA 基因即血管内皮生长因子基因，在低氧环境下，组织和细胞中血管内皮生长因子的表达显著上升，低氧是刺激血管重塑、改变细胞通透性、血管再生的重要因素。高原环境下 AMS 发病者血浆中 VEGF 表达水平明显上升。有研究评估了 12 个血管内皮生长因子 SNP 与 AMS 发生风险的相关性，发现了 rs3025039 和 rs3025030 与 AMS风险降低相关，并且观察到血液内血管内皮生长因子浓度在发生 AMS 患者中的差异性表达。研究认为rs3025039 和 rs3025030 可能引起转录因子潜在结合位点的改变，从而导致 VEGF 表达异常19。本研究结果为 AMS 的发生与缺氧诱导通路基因及相关酶类的基因表达相关提供了印证。但与血管压力系统相关的基因位点，如血管紧张素原(angiotensinogen，AGT)、EDN1 等并没有被发现。其中，AGT 是肾素血管紧张素 醛固酮系统中的初始底物。国内一项纳入 96 名 AMS 患者与 60 名汉族人的病例对照研究中发现，AGT 基因上 rs699 位点与 AMS 患者的血氧饱和度以及血压显著相关20。EDN1 基因介导 5羟色胺相关生理过程，5羟色胺在肺以及外周血管中具有强烈的收缩血管作用。一项纳入 356 名亚洲健康男性的队列研究，2 h 内将所有受试对象乘飞机由成都到拉萨，在所有发生 AMS 的患者血液中发现血浆色氨酸、血清素水平明显升高，利用总体线性回归分析，认为rs2060799、平均动脉压、血氧饱和度、用力肺活量、色氨酸和血清素是 AMS 发生的独立预测因子21。此外，随着高原地区特殊性和优势的不断体现，高原医学研究的不断深入，AMS 遗传相关因素的研究亦成为热点，甚至已逐步涉及到线粒体和蛋白体等领域。有学者认为线粒体是身体的能量工厂，经氧化磷产生能量，进一步决定三磷酸腺苷的产生效率、热量产生的平衡和活性氧的产生水平。因此，线粒体在缺氧诱导的细胞和组织损伤以及缺氧适应中起着重要作用。在慢性缺氧情况下，线粒体通过其序列的改变，其功能在一定程度上得以恢复就是最好的证明22。总之，AMS 的发生不是单一因素的结果，对遗传因素中 SNP 的探索也具有人群差异。对可能相关的SNP 位点的验证仍需要不断地扩充样本量及重复验证研究。相信随着进入高原人群增多，对高原病遗传因素的不断探究，AMS 相关 SNP 位点或位点组合将不断被发现，结合其他影响因素，建立以特定基因为基础的表达网络，对 AMS 的发生提供较为准确的风险预警，更好地服务于高原经济发展建设的目标一定能够实现。【参考文献】1高钰琪.高原军事学 M.重庆:重庆出版社，2004:250259.2JHA P K，SAHU A，PABHAKA A，et al.Genome-wide expressionanalysis suggests hypoxia-triggered hyper-coagulation leading tovenous thrombosis at high altitudeJ Thromb Haemost，2018，118(7):12791295.3卢娟，苟于强，王涛，等.高原驻训部队急性高原反应流行病学调查 J 西北国防医学杂志，2016，37(4):253255.4李相俊，李平，史连胜，等.健康青年男性进驻更高海拔地区急性高原病分析 J 西北国防医学杂志，2018，39(6):360364.5刘清源，孙振学，谭川江，等.急进高原武警官兵急性高原反应症状与卫勤措施的调查研究 J 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