GB_T 30224-2013 刚地弓形虫试验临床应用.PDF

Ics 11.100 C 50 弱日 中华人民共和国国家标准 GB/T 30224-20 13 刚地弓形虫试验临床应用 Clinical use of tests for Toxoplasma gondii 20 13-12-3 1发布?2014-12-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会 发布 GB/T 30224-20 13 月U?吕 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准起草单位：北京大学人民医院、首都医科大学友谊医院、首都医科大学附属北京朝阳医院。本标准主要起草人：张正、岳志红、赵晓涛、苏建荣、许淑珍、王清涛。GB/T 30224-2013 刚地弓形虫试验临床应用 范围 本标准规定了刚地弓形虫临床实验室检验方法、标本的采集和处理、安全预防措施和免疫诊断试验的临床应用。本标准适用于开展刚地弓形虫检测的临床实验室。规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。实验室生物安全手册（第三版）世界卫生组织 2004年 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。刚地弓形虫 Toxoplasma gondii 弓形虫是法国Nicolle和Manceaux(1908年）首先从非洲刚地梳趾鼠(Ctenodactylus gondii）体内单核细胞发现的，由于该虫的滋养体似弓形或半月形，故命名为刚地弓形虫。3.2 弓形虫病 toxoplasmosis 由刚地弓形虫引起的一种人畜共患病，通过先天性和获得性两种途径获得感染。4 检验方法 刚地弓形虫病原学检查直接镜检 用于直接观察寄生虫的标本包括分泌物、排泄物、体液和组织。液体标本应2 000 r/min离心10 mmn,取沉淀制成显微镜涂片。经干燥、固定和Giemsa法染色后镜检，以发现速殖子、变性虫体。组织印片 Giemsa法染色可检测到刚地弓形虫包囊，也可以检测到假包囊或速殖子。在少数情况下，确诊弓形虫病依据病原学检查。2 接种和组织培养 将患者组织或体液接种于小鼠或组织培养细胞获得虫体或进行被接种动物的血清学检测。4.1.3 抗原检测一酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)血清或体液中的循环抗原比特异性抗体出现早，是病原体存在的确证。可使用ELISA双抗体夹心 1 IgG啦体晌接血 dj&ect he 血清学检测刚地弓形虫抗体诊，需进行多种抗体联合检妇司 作为确诊依据。刚地弓瑙 4.2.2 刚地弓形虫侧限抗 盔床实验室主要的诊断 翻嗓姗羁象哥从扣 方法中详细注意事项参见附录 霭弧黯袱默 出确可以 戳 4.2.2.1 IgG抗 Feldman染色试验（Sabin-Feldman 地弓形虫 虫抗体，罗钵的细j 8周滴度达到高 ab 薰 兰瓜r伪 果 于难如现的。出定育常一孵啤脂 物考全防护明晦要求，因此 utina IHA试验刚地弓形虫抗和抗原的变化 者血清和寥菊酒翻瞬！胞将凝集。IHA试：但篡鬓检测的 降者体内有红细胞质量 可浮吸虫仲暇原，红阅睡控 处创曹的速殖子孵育。如 瑟4o颗粒反应。口果“呼呢虫IgG抗体筛查。由于非特异 4.2.2.3 IgG抗姻瞬集 直接凝集（direct魏果患者体内有刚地弓形 乳胶凝集（latex agglutin 刚地弓形虫抗体，则发生凝集。咒 lut翻肠on,DA)：血清经2-琉基乙醇处理，与经 Lr伙脸躁作简便价廉，可用于,LA几 之生凝集。DA试验操作简便、GB/T 30224-2013 法检测。4.1.4 核酸检测 为确定是否感染，可应用PCR技术检测虫体DNA。靶基因从Bi基因和AF146527序列等选取。血液、尿液、脑脊液、羊水、眼部体液和支气管灌洗液刚地弓形虫DNA检测阳性是活动性感染的有力证据，但虫体DNA阴性并不能排除弓形虫病。4.2 刚地弓形虫抗体检测 4.2.1 概述 性1gM反应，可出现少量假阳性。?一 鉴别凝集（differential agglutination,AC/HS)：比较丙酮处理（AC）速殖子和甲醛处理（HS)速殖子的凝集反应有助于区别急性和慢性感染。急性感染患者血清标本可使AC和HS虫体悬液均凝集；慢性感染患者血清标本HS高滴度凝集，AC低滴度凝集或阴性。4.2.2.4 IgG抗体一f接荧光抗体试验（indirect fluorescent antibody test,IFA IFA试验采用甲醛固定完整速殖子涂片，经空气干燥作为抗原。患者血清与抗原涂片孵育，加人荧光素标记抗人免疫球蛋白抗体。IFA已替代DT广泛应用。抗核抗体阳性患者可出现假阳性反应。对于每周筛查少于10份血清标本的临床实验室，IFA试验是理想的测定方法。.5 IgG抗体一ELISA ELISA是刚地弓形虫IgG抗体筛查应用最广泛的试验。可溶性抗原包被于固相载体；患者血清与 多数患者感染后1周内滴度升 物察到类风湿因子弓起假 th理括本以降低这些干扰因素 由争茱去除血清标本中IgG,IF万侧闭引起假阴性，敏感性较差。建议检 阳性和刚地弓形虫 影响。?，4.2.3.2 I 体月瓦ISA ELIS 虫感染的！至18个月 4_2_3.3 1gM-感染的诊检测到Ig 4.2.4 刚地 和间接。急性 妇感染 体一免疫吸附凝集试验(imif-1gM和寡LISA-IgM更敏 器筑二 咐竺衅I汾瞪法比ELIS攫法兀 天性刚地弓形抗体，最长可 同时采用了ELISA中1gM捕获步骤和DA试验中完整虫体抗原 验用于先天性的感染时间内 刚地弓形贞加gA节琳检测是判断新生儿感染的一个附加方法。所有t 同时检测血清Ig月协Ig助七体，先天性感染的新生儿IgA抗体比1gM 降毛声性感染的新生儿应更A现。4.2.5 刚地弓形虫Ig顶位体检 4.2.3.1 1gM抗体一IFA IFA-IgM试验和IFA:高，6个月一9个月转为喻 GB/T 30224-20 13 抗原、酶标记抗人抗体（结合物）和底物孵育；分光光度计读取颜色变化。与DT和IFA试验结果比较，敏感性高。有些ELISA试剂盒，血清热灭活可导致假阳性反应。4.2.2.6 IgG抗体一IgG亲合力 ELISA-IgG检测经改变测定模式或改良后可用于确定刚地弓形虫IgG抗体结合抗原的亲合力，并已发现是一个判断慢性感染的最有用的指标，可排除急性感染。方法为同时检测双份血清标本，其中一份经尿素处理分离低亲合力抗体。计算两个终点滴度比值，以百分数表示。4.2.3 刚地弓形虫1gM抗体检测 刚地弓形虫gE抗体御业韧眨急性感染的辅助指标。蜜声喘体可持续数月，阴性结果并不 能排除急性感染。?，肠?户口口尸 5 标本采集和处理 大多数实验室使用商品诊断试剂盒检测刚地弓形虫抗体。诊断试剂盒制造商必须明确检测的标本类型。血清、血浆、脑脊液和眼部体液标本都可用于抗体和抗原检测。脑脊液和眼部体液应与同一时间采集的血清标本平行检测。建议操作者遵循制造商的试剂说明书。标本4可储存数天，冷冻可储存时间更长。除非运送时间超过1周或温度极高，标本可在常温下运送。除抗体检测之外，其他试验采集标本前应与实验室联系以确保标本正确的采集和处理。6 安全预防措施 因不确定临床标本是否含有感染性物质，所以，所有标本都应当作有感染性对待，依据实验室生物 3 GB/T 30224-2013 安全手册处理。7 免疫诊断试验的临床应用 7.1 确定抗体状况 筛查一份血清标本的IgG抗体，IFA或ELISA即可。试验结果阴性表明患者未受感染。任何程度 阳性均表明已感染了刚地弓形虫。以下情况应确定血清中是否存在刚地弓形虫抗体：育龄妇女妊娠前；免疫抑制（特别是T细胞抑制）治疗开始前；首次HIV阳性确诊后；器官移植供者捐赠前。7.2 急性获得性感染的诊断 刚地弓形虫血清学结果的临床意义见表1,IFA-IgG或ELISA-IgG结果阴性基本上可排除近期刚地弓形虫感染诊断。采用同一试验检测间隔数周时间采集的标本，血清学从阴性到阳性转变或滴度升高超过4倍，可明确诊断。IgG抗体阳性时，ELISA-IgM和IgG亲合力检测结果能够提供额外的证据支持或否定近期感染。1gM阴性基本上可排除最近几个月感染。1gM和IgG均阳性可提示近期感染；但是，一些患者初始感染后可检测到1gM抗体长达18个月。孕妇感染应进行IgG亲合力检测。妊娠12周一16周IgG高亲合力基本上可排除妊娠期间获得感染。怀疑孕妇近期感染，采取干预措施之前应将标本送至有诊断弓形虫病经验的实验室比对。表1 刚地弓形虫血清学结果的临床意义 IgG结果 1gM结果 临床意义及处理 无刚地弓形虫感染的血清学证据。如果症状持续存在，3周后重新采集标本检测 士 可能早期急性感染或1gM假阳性。3周后重新采集标本检测IgG和1gM。如果两份结果相同，患者可能未感染刚地弓形虫+近期急性感染或1gM假阳性。3周后重新采集标本检测IgG和1gM。如果两份结果相同，1gM反应可能是假阳性 士 不确定：重新采集标本检测或采用不同方法重新检测此标本IgG 士 士 不确定：重新采集标本检测IgG和1gM 土 十 可能近期急性刚地弓形虫感染。3周后重新采集标本检测IgG和1gM。如果两份结果相同或IgG阳性，两份标本送至有弓形虫病诊断经验的实验室进一步检测+通常刚地弓形虫感染超过6个月+士 刚地弓形虫感染，但1gM结果可能由于近期感染或1gM假阳性。3周后重新采集标本检测。如果两份结果相同，两份标本送至有弓形虫病诊断经验的实验室进一步检测+可能近期感染。标本送至有弓形虫病诊断经验的实验室进一步检测 GB/T 30224-2013 7.3 先天性感染的诊断 先天性弓形虫病诊断包括孕妇近期感染诊断和证明胎儿感染。先天性弓形虫病可由母婴传播发生。女性妊娠前IgG抗体阳性有免疫力，很少有机会将感染传给胎儿。尽管血清学阴性女性视为易感人群，但孕妇是否需要进行筛查应由专科医师根据具体临床情况决定。妊娠后第1次检测IgG抗体阳性，则应检测1gM。如果1gM阳性，应进行亲合力检测来确定是否妊娠期间感染。如果孕妇确诊近期弓形虫病，可进行治疗并检测胎儿是否受感染。推荐选择妊娠18周羊水PCR作为宫内诊断先天性弓形虫病的试验。另外，胎儿出生前应每2周一4周进行B超检查，以寻找更多非特异性感染体征。如果采集胎儿血液标本，应进行病原学检查、刚地弓形虫IgG.1gM和IgA抗体检测。结合非特异性感染指标检测进行分析以明确先天性感染的诊断。7.4 新生儿感染的诊断 根据病原学检查及血清抗体检测可做出新生儿刚地弓形虫感染诊断。如果尚未确诊，应尝试从胎盘、羊水和脐带血液分离刚地弓形虫。此外，怀疑患有先天性弓形虫病的新生儿还应进行眼科学检查和头部计算机断层扫描。最终确诊前，临床医师可依据早期体征、症状和血清学试验结果进行治疗。新生儿是否已受母婴传播感染，应根据各种抗体半衰期，重复检测新生儿血清标本，有助于区分母亲来源的抗体和胎儿产生的抗体。新生儿IgG抗体阳性持续12个月则可确诊先天性感染。通过免疫印迹技术，检测母亲血清和新生儿血清中独特刚地弓形虫抗体，也可以作为先天性感染依据。7.5 眼部感染的诊断 多数刚地弓形虫脉络膜视网膜炎病例是由于先天性感染造成。眼部损伤患者除血清中有刚地弓形虫IgG抗体外，局部产生IgG抗体和房水或玻璃体虫体DNA检测已用于确诊活动性眼部弓形虫病。7.6 免疫功能低下者感染的诊断 各种免疫抑制者经常患有严重的、致命的弓形虫病，最常见的是与潜伏感染复发有关。由于检测不到1gM抗体，IgG抗体阳性可作为潜伏感染提示。弓形虫病可通过组织学或细胞学检查发现虫体在组织中复制，或通过分离或鉴定羊水、脑脊液、支气管灌洗液或胎盘中虫体核酸确诊感染。器官或骨髓移植患者移植前应检测刚地弓形虫IgG抗体，移植前血清学阴性属于易感人群，有急性原发性感染危险，阳性有感染复发危险。急性获得性感染患者常可检测到刚地弓形虫IgG和1gM抗体，而感染复发患者IgG抗体升高或下降，但通常检测不到1gM抗体。血清学阴性受者从血清学阳性供者接受移植，可感染弓形虫病。推荐所有HIV感染者确诊后立即检测刚地弓形虫IgG抗体以发现潜伏感染。大多数弓形虫脑炎的AIDS患者有刚地弓形虫IgG抗体。GB/T 30224-2013 附 录 A（资料性附录）与免疫学检测有关的问题 A.1 试剂盒 按照医疗机构临床实验室管理办法规定，进行临床刚地弓形虫检测的商品试剂盒（国产或进口）必须有国家食品药品监督管理总局（CFDA）的正式批准文号方可使用，以保证试剂盒检测质量。实验室开始刚地弓形虫检测前、改变测定方法或更换试剂批号时，应评估试剂盒。实验室应建立和保存刚地弓形虫阴性和阳性的血清标本库用于将来试验评估。A.2 试验选择 开始进行刚地弓形虫免疫诊断检测或改变测定方法时，应考虑多种因素，如：试验需求量、为什么需要试验、易于操作、适于实验室情况等。如果试验需求量小，实验室可进行免疫荧光试验，IFA-IgG试验比ELISA更高效。乳胶凝集方法经济、操作时间短，但结果阳性需要特异性更强的方法确认。如果试验需求量大，ELISA更适用。有条件实验室可进一步进行抗体亲和力实验和分子生物学实验。HIV阳性患者、移植前、女性妊娠前常规筛查试验，IgG方法足够敏感。如果考虑有孕妇急性感染，进行1gM抗体检测则更有价值。A.3 假阳性反应 有许多原因引起假阳性反应，例如：血清56灭活、抗核抗体、类风湿因子（RF)、同型之间抗原结合位点竞争、体内有天然抗体和许多涉及免疫球蛋白Fe部分的反应。使用吸附剂和（或）捕获步骤（抗 1gM结合到载体）代替间接试验步骤（抗原结合到载体），消除了1gM试验中RF和同型之间竞争结合位点。但还有其他假阳性原因报道，需要引起实验室工作者注意。A.4 质量保证 实验室应常规进行刚地弓形虫检测项目的室内质量控制。开展刚地弓形虫抗体（1gM和IgG）检测的实验室应参加室间质量评价。A.5 参考实验室 因为刚地弓形虫病诊断很困难，建议将IgG和1gM结果显示可能近期感染的患者标本送至有诊断弓形虫病经验的实验室比对。GB/T 30224-2013 参 考 文 献 11 医疗机构临床实验室管理办法 卫医发2006)73号 幻 JS REMINGTON,PHILLPPE THULLIEZ,JG MONTOYA.Recent Development for diag-nosis of toxoplasmosis J.Journal of Clinical Microbiology,2004(42):941-945.