生物指示物专业知识讲座省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx

背景介绍一切生命体都会被它们环境中的物理或化学物质所影响人们可以根据一系列未知环境中的生命体来预测该自然界中的土壤、水硬度、气候甚至地理位置等等环境因子。地理学家们可以根据一些特殊的指示植物种群等信息去进行地面植物勘探，绘制该处的地质形成，定位矿藏。根据生命体可以被物理化学因子影响的特性，人们不仅可以在此基础上确定某种物质的存在与否，还能了解其在环境中存在的水平。第1页背景介绍生物易被环境中过量污染物或自然物质影响，这些影响可能表现在以下几个方面：1）生物群落中种群结构或者优势种群改变；2）群落中种群多样化改变；3）生物群体中死亡率增加，尤其是早期发育敏感期如卵和幼虫阶段；4）个体生理和行为改变；5）个体形态学和组织学出现问题；6）个体组织中积累污染物或者代谢物。第2页背景介绍生物指示物（Bioindicators）自上世纪70年代污染生态学中出现并一直沿用至今。最初只是将耐污生物物种成为指示生物（Indicator species 或Bioindicators），伴随污染生态学野外研究和试验室毒性试验阶段，逐步将生物指示物应用范围扩大至污染生态学不一样生物学组织层次，小至分子水平，大至生态系统结构与功效，包含发生在分子、生物化学、生理、病理组织、生物个体、种群、群落和生态系统等不一样生物学组织水平上生物学效应。第3页背景介绍生物监测技术诞生于20世纪初，由Cairns和Schalie最先提出“生物监测革命”口号，指出了其与农业“绿色革命”含有等同战略意义。伴随伴随生产和科学技术发展，人类逐步认识到监测常规环境指标已经不足以全方面说明环境问题，更无法客观地反应环境质量情况，而生物监测含有理化监测所不能替换作用和所不具备特点，如能直接反应出环境质量对生态系统影响；能综合反应环境质量情况；含有连续监测功效，所以，日益受到人们广泛重视。第4页生物监测定义生物环境协同进化相互依存生物监测（biological monitoring）在不一样文件资料中，定义略有区分。联合国环境规划署（UNEP）将其定义为测量活着生物体对人为压力灵敏度。美国国家环境保护局（EPA）则定义为使用活着生物体来测定环境影响。能够将生物监测定义为测量活着生物体对人为压力灵敏度。这类敏感度能够由各种形式表现出来，包括细胞生物化学、生理、生长或健康状况等改变，个体及大规模发育与繁殖改变，种群数量、群落及生态系统改变等。第5页生物监测特点一生物监测表明外源性化学物质影响生物物种或生物调控过程的细微变化，而这些变化可能被常规的物化分析所错过；二在环境中，生物接触的污染物不止一种，而几种污染物混合起来可能发生协同作用使污染加剧，生物监测能较好的反映出环境污染对生物产生的综合效应；三生物监测具有灵敏性，能对进入环境的低浓度甚至痕量污染物迅速做出反应，显示出可见症状。因此，可以在早期发现污染，及时预报；四对那些剂量小、长期作用产生的慢性毒性效应，用理化方法很难进行测定，而生物监测却可以做到；五生物监测克服了理化监测的局限性和连续取样的繁琐性；六不需要繁琐的仪器保养和维修工作，可以做到大面积的连续布点，甚至是在边远地区也可以做到，因此生物监测的费用较理化监测大大减少。第6页惯用监测技术方法Diversity indicesSimilarity indicesSpecies abundance patternsMultivariate analyses群落结构法（Monitoring community structure）Biotic indicesPollutant mappingMorphological and histological indicatorsDetector an sentinel organismsComparative methods指示生物法（Bioindicator methods）第7页生物监测技术在水环境监测中应用第8页生物指数法生物指数是利用筛选的指示生物（indicator organism）或生物类群与水体质量的相关性，特别是考虑它们与污染物之间的关系，从而划分不同污染程度的水体。长期以来，水生态系统中生物的结构组成以及它们在种群、数量及丰度随水污染程度而变化，这一现象受到人们的极大关注。很多研究致力于使这种变化数量化，并与水体质量建立联系，从而有效地评价和监测水污染状况。第9页种类多样性指数法种类多样性指数法是应用数理统计法求得表示生物群落种类和个体数量数值，用以评价环境质量。它是定量反应生物群落结构（种类、数量）及群落中各种类组成百分比改变信息。惯用方法包含香农（Shangnog）-韦弗（Weaver）多样性指数，马吉莱夫（Margalef）多样性指数和连续比较指数。第10页生态毒理性试验生态毒理性试验又称生物测试，它是利用生物受到污染物质毒害所产生生理机能等改变测试污染情况方法，分为静水式生物测试和流水式生物测试。生物测试法主要应用于对污染源监测，采取此方法能够反应很多主要信息，如有害物质进入周围环境时其毒性怎样或能否发生改变，接收系统受影响程度怎样，何种有害物质致毒性最大以及在何条件下毒性最强，对生物生活史能产生什么影响。第11页生物残毒测定生物残毒测定又称水生生物法，它是利用生物含污量进行水体监测和评价。水体中重金属、有机农药和放射性物质有时含量较低，采取常规理化法分析比较困难，而许多水生生物往往对它们有较强富集能力。所以，依据污染物在生物体内残留量可推断出水体污染程度。第12页微型生物群落监测方法（PFU）PFU（polyurethane foam unit）法是应用泡沫塑料块作为人工基质来搜集水体中微型生物群落，测定该群落结构与功效各种参数，以评价水质。用室内毒性试验方法，预报工业废水和化学品对受纳水体中微型生物群落毒性强度，为制订其安全浓度和最高允许浓度提出群落级别水平基准。适合用于采取原生动物、藻类对水质进行监测，是群落水平上、连续生物监测。第13页硝化细菌测试法硝化细菌为专性化学能自养型细菌，它包含氨氧化菌和亚硝酸氧化菌两个亚群。硝化过程：氨氧化菌将氨氧化为亚硝酸；亚硝酸氧化为硝酸。鉴于硝化细菌对各种化学物质比较敏感，经过测定化学物质对硝化细菌硝化作用强度影响，来表明化学物质毒性大小和对自然界中氮循环功效影响程度，该方法检测污染物毒性含有简便、敏感、快速、廉价和定量等特征。第14页幼虫变态试验近年来对于以海洋无脊椎动物胚胎和幼虫期毒性试验研究较为广泛，相关研究表明，浮游幼虫变态比现有生物个体水平毒性试验指标更为敏感。海洋底栖无脊椎动物幼虫变态期是生活史关键阶段，变态期幼体对污染物敏感性要高于其它阶段，胚胎发生和幼虫发育不受影响污染物浓度会妨碍其变态。幼虫变态过程易于观察，易受环境污染干扰。与死亡率比较，能否在附着基表面顺利变态是监测污染物毒性更为敏感指标。第15页发光细菌毒性检测法发光细菌试验是环境样品毒性检测生物测试技术，并已被列入德国国家标准（DIN38412）和国际标准（ISO11348）。毒性是一项综合生物学参数，它是衡量样品对活性生物体所产生影响，不能以化学分析方法进行测定。发光细菌测试使用了含有发光特征天然微生物，而毒性物质则将抑制发光，且毒性越强，光抑制越显著。发光细菌本身没有危害性，这一方法经研究被证实含有快速、简便特点，同时有很好灵敏度和可靠性。第16页生态毒理学方法细胞分裂时染色体要进行复制，在复制过程中假如受到外界诱变因子作用，会产生一些游离染色体片段或染色单体，形成包膜，变成大小不等小球体，这就是微核。1982年，Hooftman等最早将微核试验用于鱼类，并首次证实了化学诱变剂甲基磺酸乙酯（EMS）能够诱导泥荫鱼（Umbrapygman）外周血红细胞微核形成。近年来，微核试验被许多国内外学者用于化合物遗传毒性评定和环境监测。第17页单细胞凝胶电泳法（SCGE）单细胞凝胶电泳法（SCGE），即彗星试验5，是一个经过监测DNA链损伤来判别遗传毒性技术。SCGE法比微核试验更有益，因为环境中遗传毒物浓度普通很低，而彗星试验检测低浓度遗传毒物含有高度灵敏性，所研究细胞不需要处于有丝分裂期，且需要细胞量少。当前它已被用于检测哺乳动物、蚯蚓、一些高等植物、鱼类、两栖动物以及海洋无脊椎动物细胞。用彗星试验检测DNA损伤能够监测水体中PCP污染。第18页SOS显色法SOS显色法是国内在20世纪80年代发展起来一个遗传毒性检测新方法，含有快速、准确、灵敏及假阳性率低特点，被广泛用于遗传毒性测定中。其原理是：在DNA分子受到外因引发大范围损伤、其复制又受到抑制情况下，会造成一个轻易发生错误修复。全部这些在遗传毒物处理后大肠杆菌中出现一系列反应统称为SOS应答。第19页生物标志物法生物标志物：在亚个体和个体水平上既能够测定污染物暴露珠平，也能够测定污染物效应生理和生化指标。生物标志物是生物体受到严重损害之前，在不一样生物学水平（分子、细胞、个体等）上因受环境污染物影响而异常化信号指标。它能够对严重毒性伤害提供早期警报。第20页组织层次效 应标志物功效时间尺度分子分子效应指示暴露s细胞器/细胞细胞效应指示效应min组织/器官生理、健康和疾病效应个体受损生殖能力,死亡指示生态改变h种群生殖力下降个体数降低近亲繁殖种群衰退遗传变异降低month群落可能灭绝指示进化改变a生态系统生物多样性降低生物标志物体系生物标志物体系引自：王海黎，1999第21页水体重金属污染水体重金属污染较关注生较关注生物标识物标识 乙酰胆碱酯酶（乙酰胆碱酯酶（AChEAChE）抗氧化防御系统抗氧化防御系统 腺苷三磷酸（腺苷三磷酸（ATPaseATPase）DNADNA损伤损伤 金属硫蛋白（金属硫蛋白（MTsMTs）诱导）诱导第22页 遗传毒物 修饰类型 机制 物理因子 紫外线 胸腺嘧啶二聚体 紫外线UV-B照射引发嘧啶二聚作用 电离辐射 链断裂 电离辐射形成-OH自由基化学因子 烷化剂 加合物 遗传毒物共价连接至DNA链上 碱基改变 现有碱基化学修饰 脱碱基位点 化学性质不稳定加合物或损坏碱基脱落 断链 自由基和脱碱基位点形成造成磷酸二酯键断裂 甲基化DNA 干扰DNA复制 碱基类似物、修饰剂 突变 感染DNA修复由遗传毒物引发由遗传毒物引发DNA修饰修饰译自：SHUGART.L.R,当前主要检测伎俩有：DNA断链检测（彗星试验、碱性解链试验、非程序DNA合成试验）、微核试验、DNA加合物试验、DNA甲基化水平等。第23页生物标志物一些测定方法32P-后标识法 该方法是分析DNA加合物方法。主要包含以下几个步骤：1）DNA酶解成脱氧核苷-3-磷酸；2）加入核酸酶，使正常单核苷酸3端去磷酸化，而加合单核苷酸可抑制该作用；3）用32PATP和多聚核苷酸酶标识加合物核苷酸；4）分别经过高分辨率薄层层析进行分离分析，使加合物和正常核酸分离，并用放射自显影绘制加合物显影图。优点：灵敏度高，需要DNA少，且不需要事先知道结合物组成。第24页抗原-抗体芯片 主要分为重组抗原芯片和天然抗原芯片。1）重组抗原芯片是将一些特定蛋白固定在芯片表面，与待测标本孵育，捕捉本身抗体，再与已经标识二抗结合。2）天然芯片是指经过固定在芯片上蛋白为天然抗原，即经过裂解细胞后将蛋白用2-DE分离，再将液相转变为固相作为芯片。生物标志物一些测定方法第25页生物标志物一些测定方法色谱/质谱法 质谱与毛细管气相色谱（CGC）联用是当前灵敏度最高技术之一。然而多数被修饰碱基、核苷酸沸点较高，采取CGC法时必须先将其衍生化。另外，近年来采取快原子轰击（FAB）法将DNA加合物离子化，并将质谱与液相色谱分离技术结合使用，同时毛细管区带电泳（CZE）与质谱联用检测DNA加合物技术也得到了发展。第26页免疫学方法 酶免疫监测（enzyme immunoassay,EIA）是依据抗原抗体反应含有高度特异性，以酶作为标识物，与已知抗体结合，但不影响其免疫学特征，然后将酶标识物抗体作为标准试剂来判定未知抗原。酶联免疫吸附测试（enzyme linked immunosorbent assay,ELIAS）是当前最惯用监测方法。它是依据EIA原理而发展一个固相免疫技术，其试剂盒基于竞争吸附方法，可分别供试验室和野外测试。生物标志物一些测定方法第27页间接ELISA操作步骤及原理固相抗原酶标底物（二抗）一抗包被抗原包被抗原洗涤洗涤加被检标本加被检标本加入酶结合物加入酶结合物洗涤洗涤加显色剂和终止剂加显色剂和终止剂第28页PCR技术PCR技术即聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction），是在体外合成特异性DNA片段方法，能够快速扩增目标基因DNA或RNA片段，是对基因克隆，分子杂交和序列分析等分子生物学方法丰富和发展。其当前在环境监测中应用主要有以下几个方面：1）环境中病原微生物检测；2）进入自然环境中基因工程菌检测；3）环境微生物基因克隆中PCR技术应用等。第29页PCR技术应用原理在污染压力下DNA序列损伤或基因变异污染压力下某生物DNA对目标基因设计引物PCR琼脂糖凝胶检测污染压力下某生物DNA随机引物PCR琼脂糖凝胶检测第30页细胞凋亡检测法细胞凋亡也称为程序性细胞死亡（programmed cell death,PCD），细胞凋亡是组成生命体细胞生理反应一个基本现象，它在生物体防御内外伤害、内稳态维持以及胚胎发育过程中起着举足轻重作用。环境水体中外来污染物可能会对细胞凋亡产生影响。细胞凋亡判定方法：见DNA LADDER试剂盒说明书第31页细胞凋亡是在生理一些弱刺激下造成受基因调控主动连续程式化反应，它含有形态和生化方面特征性改变。其形态方面改变主要表现为细胞体积缩小，核质浓缩，细胞核裂解，核膜内陷形成凋亡小体，凋亡细胞周围无炎症特征；在生化方面改变主要为细胞DNA有序降解，DNA发生有规律断裂，在琼脂糖凝胶电泳中展现连续阶梯状条带。第32页谢谢第33页