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ICS 65.020 B 16 DB32 江苏省地方标准 DB 32/T 37882020 梨枯梢病监测与检测技术规程 Technical specification for monitoring and detection of Shoot Blight of Asian pear 2020-04-08 发布 2020-05-15 实施 江苏省市场监督管理局 发 布 I 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由江苏省农业科学院提出并归口。本标准起草单位：江苏省农业科学院。本标准主要起草人：刘凤权、徐会永、赵杨扬、赵延存、孙伟波。1 梨枯梢病监测与检测技术规程 1 范围 本标准规定了梨枯梢病监测与检测的原理、试剂与材料、仪器与用具、监测技术、检测技术、结果判定和报告、样品、菌种保藏和无害化处理、疫情处置等要求。本标准适用于梨枯梢病田间监测以及苗木、砧木、接穗和果实上传带的梨枯梢病菌的检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 2292 亚洲梨火疫病监测技术规范 SN/T 1157 进出境植物苗木检疫规程 SN/T 1193 基因分析检测实验室技术要求 3 原理 梨枯梢病，病原为亚洲梨火疫病菌（Erwinia pyrifoliae Kim et al.），是为害梨树的重要细菌病害之一，属我国规定的检疫性有害生物。可以根据田间症状、菌落形态和培养特征、致病性、免疫学反应和分子生物学特征等进行监测与检测。4 试剂与材料 检测中所需的所有试剂与培养基，参见附录A。除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。试验用水应符合GB/T 6682中一级水的规格。5 仪器与用具 超净工作台、电子天平、磁力搅拌器、高压灭菌锅、培养箱、水浴锅、显微镜、高速台式离心机、电泳仪、常规PCR仪、凝胶成像系统、冰箱、超低温冰箱、超纯水器、恒温干燥箱、恒温摇床、微量移液器、制冰机等。6 监测技术 6.1 监测植物 梨，主要监测亚洲梨。2 6.2 监测区域 重点监测亚洲梨集中种植区、引种繁育基地、苗木集散地等疫情发生高风险区。6.3 监测方法 6.3.1 苗木监测 对从疫情发生区调运的苗木或疫区市场销售的苗木，按照SN/T 1157要求进行抽样，并对样品进行室内检测。6.3.2 田间监测 从梨树开花期开始，对当地农技员、果农等相关人员进行访问调查，并选择有代表性的梨园进行踏查。重点观察田间有无梨枯梢病典型症状（见附录B），如发现可疑病株立刻进行标记、拍照并取样，样品送实验室进行进一步检测鉴定。对梨园中梨枯梢疑似症状及其发生地点、发生时间、危害情况等信息进行记录（见附录C）。在疫情发生区，选择有代表性的梨园进行定点监测。从梨树开花期开始，每隔7 d调查一次。采用5点取样法，每点随机调查5株，统计或计算病株率和病梢率，并做好相关记录。监测过程中病梢的选取按照NY/T 2292中的规定执行。7 检测技术 7.1 样品处理 选择表现典型症状并带有菌脓的植物部位如花朵、嫩梢、幼枝、叶片或幼果等，在无菌条件下切取病健交界处组织约（3 mm5 mm）（3 mm5 mm），表面消毒和清洗后，在装有适量无菌水的离心管中轻轻挤压，浸泡10 min30 min后制成样品悬浮液。或者直接挑取菌脓并用无菌水清洗后制成样品悬浮液。悬浮液可用于其后的形态观察、免疫学和分子生物学检测等。7.2 检测方法 7.2.1 显微镜检查 对于疑似症状的植物组织，切取病健交界处20 mm2，平放在载玻片的水滴中，加盖玻片后，在低倍显微镜下观察有无喷菌现象。7.2.2 培养特征检测 将样品悬浮液在YPDA培养基平板上划线或稀释分离，28倒置培养24 h72 h。在YPDA培养基平板上观察分离得到的细菌单菌落的形状、大小、颜色、光泽、隆起的形状、粘稠度、透明度、边缘特征以及质地、水溶性色素等特征，观察并进行记录（参见附录B）。7.2.3 形态特征检测 按照常规染色方法，在显微镜下观察细菌菌体的形状、大小及排列情况、有无鞭毛及鞭毛着生的位置和数目、是否产生荚膜和芽胞、芽胞着生的部位和形状、细胞内含物等特征。7.2.4 致病性测定 3 取梨幼果（直径大约3 cm5 cm）洗净晾干，用灭菌刀片横切果实，置于垫有湿润的灭菌滤纸的培养皿中。用无菌接种针蘸取培养24 h36 h的菌落，针刺接种于幼果果肉组织，一个横切面接种3个4个点。接种后26保湿培养，24 h后观察并记录接种部位有无坏死症状发生和菌脓形成。以无菌水为对照。7.2.5 ELISA 检测 挑取少量分离到的病原菌配制成108CFU/mL悬浮液进行ELISA检测，检测程序参见附录D。如采用商品化ELISA方法进行检测，按照说明书进行操作及结果判定。7.2.6 PCR 检测 挑取少量分离到的病原菌配制成108CFU/mL悬浮液，1 mL菌悬液提取DNA后进行PCR检测，检测程序见附录E。如采用市售的试剂盒，按说明操作。检测过程中防污染措施按照SN/T 1193中的规定执行。8 结果判定和报告 8.1 结果判定 8.1.1 症状识别判定 田间梨树发病症状符合附录B描述的梨枯梢病典型症状，判断为梨枯梢病。8.1.2 常规检测结果判定 镜检有菌溢现象；分离物形态特征和培养特性与梨枯梢病菌相符（参见附录B）；致病性测定可在接种部位产生高度隆起的乳白色菌脓，最后组织变褐坏死，但不发臭；能再次从接种发病部位分离到目标病原菌，确定病原菌为梨枯梢病菌。8.1.3 ELISA 检测结果判定 在阴性对照OD值0.1，且阳性对照OD值大于阴性对照OD值2倍的前提下，样品孔OD值大于阴性对照OD值2倍时，判定为阳性反应，即样品带有梨枯梢病菌；否则判定为阴性反应，即样品不带梨枯梢病菌。8.1.4 PCR 检测结果判定 观察电泳结果，阳性对照在476 bp处有条带出现，且阴性对照无条带，待测样品在476 bp处有条带出现，判断样品中含有梨枯梢病菌；否则判定为阴性反应，即样品中不带梨枯梢病菌。8.2 结果报告 8.2.1 监测报告 记录监测结果并填写疫情监测记录表（见附录C）。对监测结果进行整理汇总，形成监测报告。8.2.2 检测报告 将实验室检测鉴定结果填入植物有害生物样本检测报告（见附录F）。4 9 样品、菌种保藏和无害化处理 9.1 样品保藏 未发现梨枯梢病的样品保藏6个月，发现梨枯梢病的样品保藏1年，有贸易纠纷的样品保藏至少1年，以备复验，如涉及到贸易纠纷则应保藏到纠纷解决完毕。保藏样品要标明样品编号、样品名称、保藏人、保藏日期和到期日期。样品保藏期满后，需经灭活销毁处理。9.2 菌种保藏 分离得到的梨枯梢病菌菌株应妥善保存，防止扩散。9.3 无害化处理 监测和检测过程中使用过的有关材料和用具，在使用完毕后须及时进行灭活销毁处理。10 疫情处置 经监测或室内检测发现梨枯梢病，应指导生产、销售和个人实施检疫处治及病害防治。5 A A 附 录 A（资料性附录）试剂及培养基的配制方法 A.1 ELISA检测 A.1.1 包被液 Na2HCO3 2.93 g、NaCl 1.59 g，用蒸馏水溶解，调整pH值到9.6，定容至1000 mL。A.1.2 洗涤液 Na2HPO4 12H2O 3.58 g、KCl 0.2 g、KH2PO4 0.27 g、NaCl 8.01 g、吐温-20 0.5 g，用蒸馏水溶解，调整pH值到7.4，定容至1000 mL。A.1.3 样品提取液 Na2HPO4 12H2O 3.58 g、KCl 0.2 g、KH2PO4 0.27 g、NaCl 8.01 g，用蒸馏水溶解，调整pH值到7.4，定容至1000 mL。A.1.4 封闭液 脱脂奶粉5 g，溶解于100 mL样品提取液。A.1.5 抗体稀释液 脱脂奶粉2.5 g，溶解于100 mL洗涤液。A.1.6 TMB显色液 A.1.6.1 底物缓冲液 Na2HPO4 12H2O 2.375 g、柠檬酸 1.1675 g，用蒸馏水溶解，调整pH值到5.0，定容至250 mL。A.1.6.2 TMB母液 10 mg TMB溶于1 mL二甲亚砜（DMSO）中，4保存。A.1.6.3 0.75%H2O2 取25 L 30%H2O2用超纯水定容到1 mL，4避光保存。A.1.6.4 显色液 配置：在10 mL底物缓冲液加入100 L TMB母液和32 L 0.75%H2O2混匀后使用，需要现配现用。A.1.7 终止液 浓硫酸 11.1 mL，用蒸馏水定容到100 mL。6 A.2 PCR检测 A.2.1 电泳缓冲液TBE Tris碱 54 g、硼酸27.5 g、0.5 M EDTA（pH8.0）20 mL，用蒸馏水溶解定容至1000 mL。使用时利用蒸馏水10倍稀释，即为0.5 TBE。A.2.2 琼脂糖凝胶 在0.5 TBE工作液中加入1%(w/v)的琼脂糖，加热融化，冷却至60倒入插入梳子的制胶槽中，冷却凝固后点样电泳。A.2.3 上样缓冲液 溴百里酚蓝0.025 g，乙二醇3 g，溶解于10 mL蒸馏水。A.3 YPDA培养基 A液：聚蛋白胨20 g，酵母提取物10 g，溶解于850 mL水中，121湿热灭菌20 min；B液：葡萄糖20 g，溶解于100 mL水中，115湿热灭菌15 min；C液：腺嘌呤硫酸盐20 mg，溶解于10 mL水中，115湿热灭菌15 min；将A、B、C三种溶液混合，用无菌水定容至1000 mL。如制作平板，在A溶液中加入15 g琼脂粉。7 B B 附 录 B（资料性附录）梨枯梢病基本信息 B.1 分类地位 梨枯梢病菌（Erwinia pyrifoliae Kim et al.）属于细菌界（Bacteria）、变形菌门（Proteobacteria），-变形菌纲（Gammaproteobacteria）、肠杆菌目（Enterobacteriales）、肠杆菌科（Enterobacteriaceae），欧文氏菌属（Erwinia），在亚洲梨（Nashi pear，Pyrus pyrifolia）引起梨枯梢病，为亚洲梨树上的重要检疫性病害。B.2 形态特征 革兰氏阴性菌，周生鞭毛，短杆状，兼性厌氧。菌体大小为0.8 m（1.0 m3.0m），以单个、成对或短链形式存在。B.3 生物学特性 病菌最适生长温度2527.5。在YPDA培养基上28培养48 h后，菌落大小直径为2 mm，呈圆形、白色、凸起、不透明。B.4 发病规律 病原菌在病树上越冬。翌年春天在潮湿环境中，病原菌活跃繁殖，可以通过蜜蜂、蚂蚁等昆虫粘带传播，也可以通过雨水飞溅传播。病原菌通过花器、自然孔口（皮孔、气孔）或伤口侵入，在嫩枝中的胞间或者导管中扩散。B.5 田间症状特征 B.5.1 花簇与嫩枝 花簇上的症状一般在花瓣脱落 1 周2 周后表现。花器被害后呈萎蔫状，深褐色，并向下蔓延至花柄，使花柄呈水渍状，然后皱缩变成黑褐色，脱落或干枯后仍悬挂在树枝上，花梗上有橘红色菌脓渗出。嫩枝的症状与花期相似，但病害发展更快。嫩枝尖可迅速枯萎形成“牧羊鞭”状。感病叶片常发黑沿中脉扩展至完全坏死。许多患病的嫩芽、梢和树叶，使一棵树看似被烧焦，枯萎。B.5.2 树干与枝条 新枝皮色变黑，水渍状，枝尖萎蔫下弯，呈“牧羊鞭”状；多年生枝中部皮层凹陷向前向后蔓延，造成大枝、中心干整枝或整株死亡；枝条、骨干枝和主干表皮流出锈红色液体；拨开皮层韧皮、木质部组织呈黄褐色。8 B.5.3 叶片 沿主脉或沿叶边缘及两脉之间形成黑褐色的病斑。随着变色加深，叶片卷曲萎缩下垂，干枯挂在枝上不脱落，叶柄变黑，叶柄上有桔红色菌浓。B.5.4 果实 未成熟的果实受侵染时出现水渍状，然后呈褐色收缩，逐渐变黑，受侵染果实不易脱落。幼果出现黑色斑点、斑块，局部或整个表皮先变黑，后延伸至果肉，果柄通常有菌脓；果实生长期间一直不断随枝发病萎焉皱缩挂在树上失去商品性。9 C C 附 录 C（规范性附录）疫情监测记录表 调查单位：调查时间：编号 作物品种 调查地点 调查株数 疑似症状表现株数 监测结果 调查人（签字）：10 D D 附 录 D（资料性附录）梨枯梢病菌双抗 ELISA 检测程序 D.1 包被 捕获抗体提前按照市售产品要求用包被液进行稀释，然后每孔加入100 L包被于96孔酶标板上。4孵育12 h16 h后弃去孔中液体，用洗涤液加满每个反应孔，静置1 min2 min后，将洗涤液缓慢倒出，重新加入新的洗涤液，重复上述步骤3次。洗板完成后将酶标板倒置于干净的吸水纸上，吸干反应孔中的水分。D.2 封闭 酶标板中每孔加入200 L封闭液，37封闭1.5 h后弃去封闭液，用洗涤液洗板3次，每次2 min。洗板完成后将酶标板倒置于干净的吸水纸上，吸干反应孔中的水分。D.3 加样 加入梯度稀释的梨枯梢病菌菌液，每孔100 L。室温孵育1 h后弃去孔中液体，用洗涤液洗板4次，每次2 min。洗板完成后将酶标板倒置于干净的吸水纸上，吸干反应孔中的水分。D.4 加酶标检测抗体-HRP复合物 每孔加入100 L检测抗体-HRP复合物，抗体HRP复合物提前按照市售产品要求进行稀释，置于保湿容器中，25孵育1 h。用洗涤液洗板4次，每次2 min。洗板完成后将酶标板倒置于干净的吸水纸上，吸干反应孔中的水分。D.5 显色 提前15 min配好显色液，每孔加入100 L，25避光显色20 min至阳性对照显色。D.6 终止反应 显色后在每孔加入50 L终止液。D.7 测定 在波长450 nm下用酶标仪测量结果，读取各孔溶液的光密度值（OD值），记录结果。11 E E 附 录 E（资料性附录）梨枯梢病菌 PCR 检测程序 E.1 DNA提取 挑取少量分离到的病原菌配制成108CFU/mL悬浮液，1 mL菌悬液按照市售DNA提取试剂盒要求提取DNA。提取后用蛋白/核酸分析仪鉴定DNA质量，当A260/A280比值为1.82.0时，适合于PCR扩增。E.2 引物 上游引物（HrcCF）:5-GACGTTTGCACCTGGAAACCG-3；下游引物（HrcCR）:5-GCGGTAGGTAATCAAGGCCAC-3；扩增产物为476 bp。E.3 反应体系 见表E.1.E.4 反应条件 94变性3 min；进入循环，94变性30 s，62退火30 s，72延伸30 s，30个循环；最后72延伸5 min。如采用市售的试剂盒，按照说明作适当调整。E.5 电泳分析 取5 L PCR扩增产物与1 L的6 上样缓冲液混合均匀，上样于1.5%琼脂糖凝胶中，80 V电泳1 h，溴化乙锭（EB）染色20 min30 min后，凝胶成像系统中观察，记录观察结果。反应组成 体积，L 10 PCR buffer 5 25 mm MgCl2 3 25 mm dNTP 2 引物（20 m）1 5 U/L Taq DNA聚合酶 0.5 模板DNA 2 ddH2O 34 总体积 50 12 F F 附 录 F（规范性附录）植物有害生物样本检测报告 植物名称 品种名称 植物生育期 样品数量 取样部位 样品来源 送检日期 送检人 送检单位 联系电话 检测方法：检测结果：备注：检测人（签名）：审核人（签名）：检测单位盖章：年 月 日 注：本单一式三份，检测单位、受检单位和检疫机构各一份。