基于网络药理学和分子对接研究蒙药额尔敦-乌日勒对帕金森病的作用机制.pdf

基金项目：国家自然科学基金项目（）；内蒙古自然科学基金（）；年中央引导地方发展基金（）；年内蒙古人才开发基金；内蒙古自治区个体化用药工程技术研究中心开放课题（），包头医学院创新团队（）；内蒙古自治区卫生健康科技计划项目（）；自治区高等学校科学研究项目（）；包头医学院青年科技人才发展计划（）通讯作者：贾小娥，杨志甫【基础医学】基于网络药理学和分子对接研究蒙药额尔敦 乌日勒对帕金森病的作用机制李晓锋，林玉凤，张雅蓓，陈向辉，赵蕊，朱伟，谢雅彬，谢伟，巴德仁贵，姜树原，刘晓蕾，邵国，白海花，贾小娥，杨志甫，（内蒙古科技大学包头医学院，内蒙古 包头 ；包头医学院第一附属医院神经内科；包头医学院神经科学研究所；内蒙古自治区低氧转化医学重点实验室；濮阳油田总医院急诊科；包头医学院基础医学与法医学院；包头医学院公共卫生学院；包头医学院药学院；深圳市龙岗区第三人民医院；内蒙古民族大学附属医院基因检测中心）摘要 目的：基于网络药理学方法挖掘蒙药额尔敦 乌日勒治疗帕金森病的主要活性成分和药物靶点，揭示其潜在的可能作用机制，并运用分子对接研究药物与靶点蛋白结合能力。方法：依据中药系统药理学分析平台（，）挖掘额尔敦 乌日勒的活性成分及对应靶点，以药动参数 生物利用度（，）、类药性（，）为条件进行筛选，运用 、和 数据库筛选出额尔敦 乌日勒活性成分治疗帕金森病的可能靶点，运用 绘制 图，借助 数据库绘制蛋白互作（，）网络图；应用微生信在线软件及 数据库查找蒙药额尔敦 乌日勒潜在的活性成分及治疗帕金森病的潜在作用靶点，并将靶点进行基因本体（，）及京都基因与基因组百科全书（，）富集分析，并将药物小分子和靶点蛋白进行分子对接。结果：蒙药额尔敦 乌日勒中筛选出 及 值好的活性成分 种，预测治疗帕金森病的靶点 个，功能富集分析及 富集分析显示，蒙药额尔敦 乌日勒治疗帕金森病的机制主要涉及 聚合酶启动子转录的正调控、正调控 模板转录和调控基因表达等生物过程，其涉及的通路包括 、等。结论：蒙药额尔敦 乌日勒治疗帕金森病是多成分、多靶点、多通路的作用结果，为蒙药额尔敦 乌日勒治疗帕金森病的进一步研究提供了理论依据。关键词 蒙药；额尔敦 乌日勒；网络药理学；帕金森病；作用机制；分子对接 ：年第 卷第 期 ，（，；，；，；，；，；，；）：，：，）（），（），：，：，；帕金森病（，）又称为震颤麻痹，是一种常见的神经系统变性疾病，临床上特征表现为静止性震颤、运动迟缓、肌强直及姿势步态异常，病理特征是黑质多巴胺能神经元缺失和路易小体形成；目前具体病因不详，可能与环境、遗传、氧化应激、线粒体功能缺陷、免疫、炎症和年龄等均有一定关系 。具有不可逆性和一定的致残性，严重影响患者学习能力和日常生活，对家庭和社会造成极大的负担。多巴胺能药物是目前临床上治疗 的常用药物，但长期使用可能会出现药效下降、剂末现象、开 关现象和异动症等并发症。因此探索更加有效、长久和安全的治疗方法，提升患者生活质量是当前研究的热点问题。民族医药有着悠久的使用历史，具有多靶点、增效减毒等效果，和多巴胺能药物等联合使用可能为更有效、安全地治疗 提供新的方案。蒙药额尔敦 乌日勒寓意“珍贵神奇的药丸”，是蒙医药历史上的瑰宝之一，主要由珍珠、牛黄、犀角、桅子、肉桂、决明子、檀香、沉香、木香、红花、丁香、川谏子、甘草、黑种草子、肉豆寇、草果、土木香和诃子等 味天然 年第 卷第 期 药材配合组成 ，是蒙医治疗“白脉病”（即神经系统疾病）的传统验方 ，但其具体作用机制尚未完全清楚。现代医学研究中，初拉等 通过不同化学萃取的方法检出 种与神经相关的成分。近年来对蒙药额尔敦 乌日勒的基础研究发现其发挥神经保护作用的机制主要包括促进神经营养因子分泌、调控神经相关基因表达，抑制炎症因子、抗凋亡、抗氧化等方面。但其治疗 的具体作用机制及靶点研究尚少。网络药理学是基于系统生物学理论，从药物、靶点与疾病间相互作用的整体性和系统性出发，通过采用复杂生物网络模型，揭示药物、基因、靶点、疾病之间复杂的整体生物网络关系，在此基础上分析、预测药物的药理学作用机制 。中药方剂成分多，化学成分复杂，作用机制的研究较为困难。网络药理学的出现为中药的机制探究提供了新的方法，为中药寻找治疗靶点，并可能在分析中发现药物新的治疗作用，极大地促进了中医中药的发展。本研究利用网络药理学和分子对接的方法筛选蒙药额尔敦 乌日勒治疗缓解 的有关活性成分及可能靶点，进一步发现其潜在的作用机制，为后续实验验证和临床应用提供有力的理论依据。资料与方法 蒙药额尔敦 乌日勒活性成分及靶点的收集通过中药系统药理学分析平台（，）（：）及相关文献收集蒙药额尔敦 乌日勒主要药物的化学成分，以口服利用度（，）阈值 和化合物的类药性（，）阈值 为依据进行筛选，并通过 平台筛选出蒙药额尔敦 乌日勒的活性成分的作用靶点，通过 数据库把相关靶点基因转化为“”的标准基因名称，用软件 绘制药物活性成分 靶点图。药物活性成分与 的共同靶点在人类基因 疾病相关的数据库（）（：）、人类基因和遗传紊乱的数据库（，）（：）和治疗目标 数据库（：），以“”为检索词进行检索，获取 疾病靶点，删除重复靶点，用微生信在线（：）将蒙药额尔敦 乌日勒活性成分相关靶点和疾病靶点进行匹配映射，绘制韦恩图（），以获得蒙药额尔敦 乌日勒活性成分治疗 的潜在作用靶点。共同靶点的蛋白互作（，）网络构建 平台（：）是蛋白质之间相互作用的数据库，可搜索已知蛋白之间和预测蛋白质之间相互作用。将蒙药额尔敦 乌日勒和 共同靶点输入到 数据库，将研究物种选择为人类（“”），设置置信度，标准为 ，并勾选 和 ，绘制蛋白互作图，并将 中下载的 文件用 进行处理，将蛋白互作图进行可视化分析，根据度值（）绘制网络图，得到前 个 核心基因靶点。基因本体（，）、京都基因和基因百科全书（，）功能富集分析将 获得的 个核心基因靶点应用 数据库（：）及微生信平台（）进行 和 富集分析，将前 个结果进行可视化。药物活性成分 靶点蛋白分子对接先利用 软件对蒙药额尔敦 乌日勒中的有效活性成分进行筛选，得到度值最高的 种小分子化合物，分别为槲皮素、山奈酚、谷甾醇、豆甾醇和木樨草素，然后在 数据库中下载小分子的 格式文件。在 上对其进行加氢和旋转键设置后导出为 格式文件。选取预测靶点度值前 位的靶点蛋白，然后在 数据库（：）及相关文献中查找合适的 年第 卷第 期 靶点蛋白的 文件，运用 及 分别进行去除水和溶剂分子、配体、加氢操作后导出为 文件。在 中运行 和 后，获得 格式的对接结果文件及对接能大小等信息。最后在 软件上对对接结果进行可视化处理，并将其对接能绘制成热图。结果 蒙药额尔敦 乌日勒的活性成分及预测靶点通过 平台以 和 为依据，筛选蒙药额尔敦 乌日勒主要成分（荜茇、丁香、诃子、川楝子、栀子、红花、肉豆蔻、决明子、草果、木香、降香、沉香、海金沙、人工牛黄）的活性成分。筛选后各成分以中文名字的首字母进行命名，其主要化学成分命名为首字母加数字，如荜茇的部分活性成分命名为 、等，其中各药物的重复化学成分共有 种，分别命名为 、，并继续在此平台上筛选出每种药物活性成分的靶点，通过筛选共获得 个预测靶点（图 ），蒙药额尔敦 乌日勒 个作用靶点与 有关。蒙药额尔敦 乌日勒的同一活性成分可以作用于不同的靶点，同一靶点又可以受不同的活性成分作用，体现了蒙药额尔敦 乌日勒治疗 的多成分、多靶点的特点。图 蒙药额尔敦 乌日勒的活性成分及预测靶点：其中青色正方形为蒙药额尔敦 乌日勒的主要成分，环绕药物周围的圆形为其主要化合物成分，五边形代表不同中药里含有的共同化合物成分，菱形为活性成分对应的靶点 药物活性成分与 的共同靶点在 、和 数据库以“”进行检索，获取 疾病靶点，整合到一起，删除重复靶点，得到 的靶点 个。用微生信在线（：）软件将蒙药额尔敦 乌日勒活性成分相关的 个靶点和 个疾病靶点进行匹配映射，绘制 图，获得蒙药额尔敦 乌日勒的活 年第 卷第 期 性成分的潜在治疗 的作用靶点共 个（图）。图 图 网络构建与分析将 获得的蒙药额尔敦 乌日勒活性成分的潜在治疗 作用的 个靶点，输入到 数据库（：），获得蒙药额尔敦 乌日勒与 的 网络，图中阶段之间的连线表示两者之间存在相互作用，颜色不同则相互作用类型不同，连线越多则作用越密切。节点数为 ，边数为 ，平均节点度为 ，平均局部聚类系数为 （图 ）。将图 中下载的 文件用软件 将 图网络分析图进行可视化分析，根据度值制圆形，通过圆形的大小及颜色深浅可更直观地看出各节点所链接节点数的多少，圆形越大，颜色越深则该节点在网络中的作用越关键，得到前 个 核心基因靶点，其中关联度值最高的前 个节点依次为 、（图 ），表明了这些基因可能是蒙药额尔敦 乌日勒治疗 的潜在靶点。图 图示蒙药额尔敦 乌日勒与 的 网络；图为 图网络分析图可视化分析 、功能富集分析应用 数据库（：）和微生信平台（）对 获 得 的 靶 点 进 行 、富集分析。富集分析结果表明，蒙药额尔敦 乌日勒治疗 的作用机制主要涉及 聚合酶启动子转录的正调控、正调控 模板转录和正调控基因表达等生物过程（图 ）。绘制 富集气泡图，横坐标为基因比例（），纵坐标为化合物分子发挥功能的通路，气泡大小表示富集的显著性（即 的数值大小），越小越接近红色，富集程度越高。富集分析结果表明，共富集到 条通路。根据度值筛选到 条关键通路，其中与治疗 相关的包括与脂质动脉硬化、信号通路、信号通路、信号通路等（图 ）。以上结果表示，蒙药额尔敦 乌日勒通过多通路协同作用治疗 。分子对接将蒙药额尔敦 乌日勒中度值最高的 种化合物槲皮素、山奈酚、谷甾醇、豆甾 年第 卷第 期 醇和木樨草素和靶点蛋白中度值最高的前 位靶点蛋白分子 （）、（）、（）、（）、（）分别进行分子对接，获得其结合能的大小，将其绘制成热图（图 ），并分别对每个靶点蛋白结合能最低的小分子化合物进行可视化。共进行 次分子对接，结果显示结合能均小于 ，对接结果良好（图 ）。图 富集分析图 气泡图：蒙药额尔敦 乌日勒治疗 相关的通路 讨论蒙药额尔敦 乌日勒中有效成分为黄酮类化合物、木犀草素、栀子苷、桂皮醇等 。其中黄酮类化合物具有调节炎症和细胞生存相关的 表达的特性；木犀草素可通过降低表皮生长因子图 分子对接：图示结合能大小；图示对接结果的可视化（，）的 表达，抑制 介导氧化磷酸化、和 信号通路激活，从而增强脑内神经胶质细胞稳定性 。栀子苷可以提高损伤神经细胞活力，减轻神经细胞凋亡，对 小鼠模型具有调节 代谢和神经保护作用，改善 小鼠的睡眠障碍 。体外实验表明桂皮醇可减轻 刺激下大鼠脑微血管内皮细胞炎症因子 和 的释放 。大量研究表明，蒙药额尔敦 乌日勒通过多种机制发挥脑源性营养作用和神经保护作用 。本研究发现，蒙药额尔敦 乌日勒中含有 个活性成分可与和 相关的 个靶点发挥作用，这些活性成分发挥抗 作用的主要靶点是 、等。应用 数据库和微生信平台对蒙药额尔敦 乌日勒潜在作用于 的靶点进行 分析，结果显示蒙药额尔敦 乌日勒治疗 的作用机制主要涉及 聚合酶启动子转录的正调控、正调控 模板转录和正调控基因表达等生物过程。这些通路在细胞代谢、增殖、细胞存活、生 年第 卷第 期 长和血管生成等方面发挥作用，额尔敦 乌日勒的治疗作用可能与促进这些生命活动的进行有关。是一种丝氨酸 苏氨酸激酶，是 信号转导途径的重要中间分子，在细胞内信号通路中起重要作用，调节许多过程，包括代谢、增殖、细胞存活、生长和血管生成。李筱媛 通过病例对照对我国北方地区汉族中散发 患者进行研究发现，和 基因多态性均与中国北方汉族散发性 的人群具有风险关联。研究表明，和动脉粥样硬化在发病机制上有很多相同和相似之处，发病机制都涉及血管内皮功能紊乱、炎症反应等过程 。核因子 通路激活是 神经元死亡的主要原因之一。研究发现，在与 淋巴细胞共培养或添加 后，多能干细胞衍生的 中脑神经元在 受体（）上调和 激活的驱动下，导致神经元死亡增加，而阻断 或 ，或添加 批准的抗 抗体 ，可有效挽救神经元的死亡。上述研究表明，产生 的 淋巴细胞在散发性 中起着关键作用 。信号通路可促进细胞代谢、增殖、存活、生长，参与癌症的发生、化疗耐药和血管生成的调控。等 应用 （神经生长因子）治疗 诱导的 细胞 模型，发现其有保护作用，且这种保护作用可被 的特异性抑制剂 所削弱，认为 可能通过 信号通路起到对 的治疗作用。刘晓芳 研究发现，钙释放激活钙通道调节分子 的表达下降可通过 信号通路影响神经炎症，从而使多巴胺能神经元含量下降，参与 发展。是细胞内的丝氨酸 苏氨酸蛋白激酶，已被证实参与多种细胞生理活动，通过逐步激活将细胞外信号传导至细胞内，进而调整细胞的生长、分化、凋亡、炎症等生理及病理过程。家族主要包括 、氨基末端激酶和细胞外信号调节激酶 。在多项研究中发现，突触核蛋白异常蓄积激活 可促进神经元死亡，进而参与多种神经退行性疾病的致病进程 。在伴有认知功能障碍 小鼠的相关研究中也发现了 的异常激活；而抑制 可改善 小鼠突触可塑性，改善其认知功能；该项研究认为，异常激活可损伤突触的可塑性，是 认知功能障碍的发病机制之一 。本研究经 富集发现，蒙药额尔敦 乌日勒治疗 的主要作用通路包括与脂质动脉硬化相关通路、信号通路、信号通路、信号通路等。我们认为，蒙药额尔敦 乌日勒通过多通路协同作用治疗 。综上所述，本研究基于网络药理学对蒙药额尔敦 乌日勒的主要成分进行研究，预测了蒙药额尔敦 乌日勒治疗 的主要靶点及作用机制，初步诠释了蒙药额尔敦 乌日勒可通过多靶点、多通路治疗 ，为进一步理论研究、实验设计和临床应用指明了方向。参考文献 陈生弟中国帕金森病治疗指南（第三版）江西省第七次中西医结合神经科学术交流会 江西：南昌，宝莉莉，宋福顺，都格尔，等蒙药额尔敦 乌日勒的研究进展 中国民族民间医药，（）：其布日额尔敦 乌日勒的活性成分分析及其对小胶质细胞基因调控作用的研究 呼和浩特：内蒙古大学，王洪亮，敖其尔，特木其乐彻彻热乎病（帕金森病）蒙医西医诊治进展 中国民族医药杂志，（）：小梅，特木其乐，初拉，等基于蒙医白脉理论探析帕金森病 世界科学技术 中医药现代化，（）：初拉额尔敦乌日勒提取物对神经细胞的保护作用及其促进神经细胞突起生长作用的研究 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中国中医药信息杂志，（）：（收稿日期：櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂）（上接第 页）郭建友，杨元霄，赵保胜，等桂皮醇对 刺激脑微血管内皮细胞 活性及 释放的影响 中国药学杂志，（）：莲花额尔敦乌日勒对 损伤大鼠海马及皮质神经营养因子的影响 北京：北京中医药大学，萨仁高娃额尔敦乌日勒有效成分的分析及其对脑神经细胞基因表达调控的研究 北京：北京中医药大学，李筱媛 介导 信号通路基因多态性与汉族散发性帕金森病的关系 青岛：青岛大学，陈锋，朱明慧，韩燕银，等帕金森病与动脉粥样硬化的相关性研究 世界最新医学信息文摘，（）：高肞，陈王璐，陈奕奕，等针灸对帕金森病小鼠黑质白细胞介素 受体 核因子 信号通路的影响 世界中医药，（）：，（）：，：，（）：刘晓芳 介导 信号通路在帕金森病中调控神经炎症的研究 太原：山西医科大学，曹媛媛，孙灵芝帕金森病和丝裂原活化蛋白激酶信号通路的相关性及中医药干预作用 实用心脑肺血管病杂志：陈家隆 在 聚集诱导的线粒体和溶酶体功能异常的机制研究 广州：南方医科大学，何建影 在 认知障碍中作用的实验研究 昆明：昆明医科大学，（收稿日期：）年第 卷第 期