改性镁基水滑石制备及其对金黄色葡萄球菌的活性抑制研究.pdf

改性镁基水滑石制备及其对金黄色葡萄球菌的活性抑制研究孙丽杰1）高学伟1）闫东鹏2）王心蕊1）（1）北京工商大学化学与材料工程学院，中国轻工业化妆品重点实验室，北京；2）北京师范大学化学学院，北京）摘要利用成核晶化法制备了镁基水滑石（MAL），天门冬氨酸（ASP）负载水滑石（MALA）及 ASP、Ag+共同负载的水滑石（MALAA），通过 X 射线衍射和透射电子显微镜等手段对其结构和形貌进行表征，ASP 和 Ag+均成功负载到MAL 上且形貌发生变化.采用菌落计数法测试质量浓度对不同材料抑制金黄色葡萄球菌（S.aureus）生长的影响，结果表明，当质量浓度为 4mgmL1时，MAL 对 S.aureus 的抑制率仅为 5.8%，而 MALAA 的抑菌率达到 99.7%.通过电感耦合等离子体和紫外可见分光光度计等技术分析改性镁基水滑石的抑菌机制.改性镁基水滑石 MALA 通过改变其形貌、增大与细菌的接触面积并利用静电作用吸附在带负电的 S.aureus 上.Ag+的引入进一步增加二者的电势差，促进 S.aureus 细胞膜破裂，细菌细胞膜的完整性下降，导致细胞外的金属离子（K+、Ca2+、Mg2+）含量、蛋白质含量均有显著提升，MALAA 具有更好的抑菌效果.该类材料有望应用于对微生物安全要求较高的食品、化妆品等包装领域.关键词表面改性；镁基水滑石；金黄色葡萄球菌；抑菌机制中图分类号O69DOI：10.12202/j.0476-0301.20232110引言金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus）在生活中无处不在.作为常见的食源性致病菌1，我国由致病细菌引起的食物中毒事件中金黄色葡萄球菌位居前列.美国因此菌引起的医疗损失高达 15 亿美元23.目前市售食品中经常会添加防腐剂49（有机、无机和天然产物抑菌剂）抑制金黄色葡萄球菌的生长1011.由于有机抑菌剂会引起不良副作用及多重耐药性1213，而天然抑菌剂存在抑菌活性较低1416等不足，因此无机抑菌剂逐渐成为人们的研究热点.无机纳米复合材料1718在抑菌领域的应用愈发受人关注.青海盐湖资源作为我国的战略资源，其镁盐总储量超过 30 亿 t.但其镁资源开发仅限于氢氧化镁、氧化镁、金属镁等产品.如何开发新产品、提高产品附加值，促进产业发展并对其基础理论体系进行研究显得尤为必要.镁基水滑石（MAL）因其安全性、稳定性已被应用于药品中，同时作为层状双羟基复合金属氢氧化物1721的一种，其独特的二维层状纳米结构，也赋予该类材料更多的可调变空间和新的复合性能.本课题组前期的工作表明，水滑石类材料对革兰氏阳性菌有很好的抑制作用22.随层板元素种类和组成的不同其抑菌性能有着明显的差异：锌铝水滑石的抑菌效果最为显著，钙铝水滑石、镁铝水滑石和镁铁铝水滑石的抑菌效果相对较差.本研究在前期工作基础上，对镁基水滑石进行表面改性.通过负载天门冬氨酸和银离子，构筑无机-有机超分子结构，大大提高了镁基复合材料的抑菌性能，在低质量浓度下即可达到 99.7%的抑菌率，采用电感耦合等离子体和紫外分光光度计等技术研究其抑菌机制，充分表明这种安全稳定的改性镁基复合材料可广泛用于食品及化妆品等领域.1实验材料与方法1.1试剂与仪器六水合硝酸镁（Mg（NO3）26H2O）、九 水 合 硝 酸 铝（Al（NO3）39H2O）、无 水 碳 酸 钠（Na2CO3）、氢氧化钠（NaOH）、天门冬氨酸（C4H7O4N，ASP）、硝酸银（AgNO3）等物质均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司生产.X 射线粉末衍射仪（Phaser-BrukerD，测试条件为Cu 靶，K 辐射，30kV，10mA，扫描速度 10（）min1，扫描范围 570，=1.5406m）；X 射线光电子能谱通信作者：王心蕊（1982），副教授，博士.研究方向：超分子纳米材料的组装与性能.E-mail：收稿日期：2023-10-092024-04北京师范大学学报（自然科学版）60（2）JournalofBeijingNormalUniversity（NaturalScience）195（ThermoFisher，Massachusetts，America）；扫描电子显微镜（JSM6700F，日本电子株式会社）；透射电子显微镜（JEM-2100，日本电子公司）等.1.2实验方法1.2.1原料制备1）镁铝水滑石 MAL 的制备.采用成核晶化法制 备 MAL23，按 镁 铝 物 质 的 量 比 21 称 取 2.05gMg（NO3）26H2O、1.50gAl（NO3）39H2O 于去离子水中溶解配制成盐溶液，再取 5.30gNa2CO3加去离子水溶解，倒入三口烧瓶后剧烈搅拌；配制 2molL1NaOH 碱溶液；采用恒压滴液漏斗将盐溶液和碱溶液双滴到三口烧瓶，调 pH 至 11，充分混合后转移至反应釜，110C 晶化 9h 后冷却至室温，8000rmin1离心 5min，用去离子水洗涤至中性，弃其上清液，60C烘干至恒质量，研磨，标记备用.2）天门冬氨酸负载镁铝水滑石 MALA 的制备.将上述MAL 称取1g 分散于去离子水，75C 搅拌30min，加入 3g 天门冬氨酸并用 2molL1NaOH 使得 pH调至 11，反应 12h 后离心洗涤至中性，弃其上清液，干燥并研磨后标记.3）银负载天门冬氨酸-镁铝水滑石 MALAA 的制备.分别称取 1.5gMALA 和 0.85gAgNO3分散到去离子水中，将 MALA 溶液倒入三口烧瓶，75C 搅拌30min 后加入 AgNO3溶液，用氨水调 pH 约为 9，反应2h.离心，洗涤，干燥.1.2.2菌株活化及菌悬液的制备取 50L 原菌液接种于 25mL 营养肉汤后置于 37C110rmin1恒温振荡连续培养 12h，得到活化菌悬液.离心洗涤，去其上清液并用 PBS 稀释，利用紫外分光光度计调节D600nm=1.0（菌液浓度为 1109CFUmL1）备用.1.2.3抑 菌 性 能 研 究 分 别 配 制 质 量 浓 度 为 2 和4mgmL1的ASP、MAL、MALA、AgNO3和MALAA.样品组添加 100L 菌液，100L 样品及 300LPBS；对照组添加 100L菌液和 400LPBS，置于培养箱作用 30min.再用 PBS 将 2 组别稀释至 105倍后涂板并置于恒温培养箱 24h.统计培养皿上的菌落数 N，计算抑菌率2425.抑菌率=(N0Ni)/N0100%,（1）式中：N0为 0 号板的菌落数；Ni为 i 板的菌落数.1.2.4金黄色葡萄球菌生长曲线绘制根据 1.2.2 方法制备菌悬液.将配制好的 MALAA 溶液分别取 0、50、100、200、400L 于 4mL 液体培养基中并加入100L 的菌悬液（光密度 D600nm=1.0），37110rmin1恒温振动连续培养 24h，每隔 3h 测定 D600nm.每次测量设置 3 个平行，取平均值得出结果.1.2.5金黄色葡萄球菌胞外金属离子含量及蛋白质含量的测定取 3mL 配制好的样品并加入 100L 菌悬液，培养 15h 后离心，量取上清液 1mL 于 50mL 容量瓶中后定容.利用 ICPE-9000 型等离子发射光谱仪测定金属离子含量.以离子浓度为横坐标（x）、信号强度为纵坐标（y）绘制标准曲线，K+、Ca2+、Mg2+的标准曲线方程分别为y=0.0081x6.8664（R2=0.9996），y=0.0001x0.5335（R2=0.9983），y=0.0006x0.5409（R2=0.9999）.另根据 BCA 法测定胞外蛋白质含量.1.2.6金黄色葡萄球菌吸附作用将 0.5mL 样品液和 3.5mLPBS 混匀后加入 1.0mL 菌液（D600nm=1.0），空白对照组为 4.0mLPBS 添加 1.0mL 菌液，37 恒温振动连续培养 30min 后，4000rmin1离心 5min，取上清液测定 D600nm.2结果与讨论2.1MAL、MALA 和 MALAA 的结构表征CO232.1.1MAL、MALA 和 MALAA 的 XRD 表征及 XPS表征首先对合成的系列水滑石进行结构表征.XRD谱图（图 1-a）显示 MAL 的特征衍射峰主要有（003）、（006）和（009）2628，对应的 2 值分别为 11.66、23.51和 35.54.其中（003）、（006）和（009）特征衍射峰呈现出良好的倍数关系，半峰宽较窄，表明前驱体 MAL 晶型较好.此外，（003）处衍射峰位对应的水滑石的层间距为 0.78nm，推测层间离子为.进一步对 MALA（负载 ASP）及 MALAA（负载 ASP 和 Ag+）进行表征，其均具有典型的水滑石衍射峰，说明 ASP 和 Ag+的负载并没有改变水滑石层状结构.MALA 的（003）衍射峰并没有向小角度移动，说明 ASP 并没有插入层间，而是利用静电作用吸附于水滑石层板表面.值得注意的是，相对于MAL 和MALA，MALAA 的（003）、（006）和（009）衍射峰均出现宽化，（003）衍射峰略向小角度移动，可能是由于 Ag+负载后占用层板部分空间，使少量 ASP 进入层间.图 1-b 为 MAL、MALA、MALAA 的 XPS 全谱图.从图 1-b 中可以看出，与 MAL 相比，由于 ASP 的加入，MALA 在 400eV 出现明显的 N1s 信号2930，N1s精细谱（图 1-c）在 399.4 和 401.2eV 的 2 个组分分别归属于 CN 和 NH 键.与 MALA 相比，由于 Ag+的加入，MALAA 在 369eV 附近出现 Ag3d 信号，图 1-dMALAA 的 Ag3d 高分辨谱图可分为 2 个峰 368.1eV（Ag3d5/2）和 374.1eV（Ag3d3/2）31.这充分证明 ASP 和Ag 已成功地负载到水滑石上.2.1.2MAL、MALA 和 MALAA 的形貌表征利用196北京师范大学学报（自然科学版）第 60 卷扫描电子显微镜和透射电子显微镜技术观察材料的微观形态.在图 2-a、d 中可以看出，MAL 呈现出由小片层聚集形成的类圆形颗粒状，且尺寸相对均一，粒径尺寸约为 200nm，比表面积较小.加入天门冬氨酸后，增大了 MAL 的分散性，变成竖立的薄片状（图 2-b、e），使其比表面积相对增加，这种形貌更有利于材料通过静电作用吸附细菌.负载 Ag+后，材料仍然保持竖立片层结构32（图 2-c），且分散程度更加明显，与金黄色葡萄球菌的接触面积更大.在 TEM 图（图 2-f）中也可以看到材料表面存在均匀分散的黑色 Ag 颗粒，intensityintensity102030402/()binding energy/eVbinding energy/eVbinding energy/eV5060704064044024003983963943783763743723703683623643661 2001 0008006004002000(003)(006)(009)MALAAMALAAO 1sAg 3dAl 2pC 1sN 1sN 1sAg 3drawfittedbackgroundCNNHrawfittedbackgroundAg 3d5/2Ag 3d3/2Mg 1sMALAMALAMALMALabcda.MAL、MALA、MALAA 的 XRD 图；b.MAL、MALA、MALAA 的 XPS 全谱图；c.MALA 的N1s 高分辨谱图；d.MALAA 的 Ag3d 高分辨谱图图1MAL、MALA 和 MALAA 的结构表征abcdef500 nm500 nm500 nm200 nm200 nm100 nmMAL（a）、MALA（b）、MALAA（c）的 SEM 图；MAL（d）、MALA（e）、MALAA（f）的 TEM 图图2MAL、MALA 和 MALAA 的形貌表征第 2 期孙丽杰等：改性镁基水滑石制备及其对金黄色葡萄球菌的活性抑制研究197由于水滑石层板的定位效应使得银高度分散并沉积在水滑石层板，暴露了更多的有效活性位点.可以预测，高度分散的银更有利于发挥抑菌性能.2.2抑菌活性2.2.1无机纳米复合材料的抑菌活性为更直观、量化地探索不同材料对金黄色葡萄球菌的抑制作用，采用菌落计数法对其进行抑菌性能的测试.不同质量浓度下的材料对金黄色葡萄球菌的菌落数（表 1）、抑菌活性图及抑菌率（图 3）有着显著差异.相对于空白对照组，2 种浓度下的 ASP、MAL 的菌落数没有明显减少，抑菌率都为 5%；MALA 的菌落数略有减少，抑菌率为 20%左右；同质量浓度的 AgNO3作用后菌落数减少，抑菌率达到 40%.而 ASP 和 Ag+共同负载后，MALAA 在质量浓度为 2mgmL1时，存活的菌落数量显著降低，抑菌率达到 83%，质量浓度为 4mgmL1时，几乎没有细菌存活，抑菌率达到 99.7%.表1添加不同质量浓度材料后的金黄色葡萄球菌的菌落数质量浓度/（mgmL1）对照ASPMALMALAAgNO3MALAA239012356935912347122117645436613353112808204612120对照100804020ASPMALMALAAgNO3MALAAASPMALMALA AgNO3MALAA2 mgmL14 mgmL12/(mgmL1)40抑菌率/%图35 种材料在不同质量浓度下对于金黄色葡萄球菌的抑菌活性图及抑菌率2.3抑菌机制研究2.3.1MALAA 的不同添加量下对金黄色葡萄球菌生长曲线的影响由图 4 观察到：在未添加 MALAA 的条件下，细菌能够正常生长且有迟缓期、对数期、稳定期以及衰亡期的典型微生物生长阶段；有少量MALAA存在时，金黄色葡萄球菌生长速度减慢，在培养 6h后，实验组与对照组相比 D600nm值明显较低，说明此时细菌的对数期被抑制；当添加量为 200L 时，培养15h 后，金黄色葡萄球菌稳定期缩短，细菌数量逐渐减少，进入衰亡期；直到添加量达到 400L 后，随着时间的推移并没有观察到细菌生长.因此可以得到结论，此时的细菌全部衰亡.2.3.2MALAA 的吸附作用对抑制金黄色葡萄球菌生长的影响由上文可知，负载后 MALAA 多为片层竖立蜂窝状，聚集程度明显得到了减轻，通过物理吸附使其与细菌的接触面积增大，更利于阻断细菌营养通道从而加速死亡.由图 5-a 可以明显看出：随着材料与细菌作用时间的增加，其接触更加紧密，30min 即可有效快速杀菌；0min 时二者均匀混合并高速离心后，取上清液所测得波长为 600nm 时的吸光度较高，说明材料与细菌没有明显的吸附作用；随着作用时间增加，实验组上清液的吸光度逐渐下降，直至 30min时实验组的 D600nm显著降低至 0.023，说明有越来越多的菌体与材料结合后通过高速离心沉到比色管底部，细菌与材料的结合愈发紧密33.由于银离子载入后无机纳米复合物与细菌的 zeta电位产生巨大差异，从而静电吸附作用显著增强，通过化学吸附使得二者紧密接触迫使细菌灭亡.据图 5-b显示，MALAA 的 zeta 电位为 10.6mV（正电），细菌电位为12.3mV（负电）.MALAA 的 zeta 电位与金黄色葡萄球菌之间存在明显差异，从而导致其能够更好地作用在细菌表面，使得其对于细菌具有强吸收.相反，因其表面电位较低的 MAL（5.3mV）和 MALA（6.7mV）抑菌效果不如 MALAA.而其较高电势主要归因于 Ag+的引入，增加了材料的表面电势从而静电吸附作用增强，并通过负载改变了材料形貌而增加了与细0.8050100200400S.aureus0.60.40.20510t/h1520250D600 nm图4材料的不同添加量对金黄色葡萄球菌生长曲线的影响198北京师范大学学报（自然科学版）第 60 卷菌的接触面积，从而与细菌结合能力更强，来阻断其营 养 通 道 加 速 死 亡，显 著 提 高 了 抑 菌 效 率.2.3.3MALAA 对金黄色葡萄球菌胞外金属离子质量浓度和蛋白质的影响MALAA 载入银离子后其呈高度均匀分散的状态，在与细菌作用时通过缓慢释放，改变了细胞膜的通透性，加速了细菌的衰亡.如图 6 所示，由不同材料处理并作用于细菌 15h 后，其细胞外的 K+（图 6-a）、Ca2+（图 6-b）、Mg2+（图 6-c）质量浓度均有显著的升高.实验组中经 MALAA 处理后的细菌胞外金属离子中 K+质量浓度与对照组相比增加了 0.55 倍，Mg2+增加了 4.07 倍，而 Ca2+与对照组相比差异最大，达到对照组的 4.19 倍；并且在培养 24h 后的胞外蛋白质 D562nm（图 6-d）与对照组相比增加了0.23 倍.究其原因可能是该无机纳米材料将均匀分散负载的 Ag+缓慢释放出来，该材料与细菌的细胞膜相接触后影响膜的通透性，使得 S.aureus 的细胞膜被破坏，导致胞内金属离子及生物大分子等物质大量外泄34.因此，无机-有机复合材料 MALAA 具有更高的S.aureus 的抑菌率.3结论改性后的材料 MALAA 对金黄色葡萄球菌的生长有着优异的抑制能力.通过制备 MAL、MALA 及MALAA 复 合 材 料，采 用 XPS 和 TEM 等 手 段 表 明0.06ab1510505105.36.710.61512.3对照MALAAMALMALAMALAAS.aureusS.aureus0.040.020102030D600 nmt/minzeta 电位/mV0图5MALAA 作用金黄色葡萄球菌 30min 内吸光度变化（a）及 MAL、MALA、MALAA 和金黄色葡萄球菌的 zeta 电位（b）5.0对照ASPMALMALAAgNO3MALAA对照ASPMALMALAAgNO3MALAA对照ASPMALMALAAgNO3MALAA对照ASPMALMALAAgNO3MALAA4.54.03.53.02.52.01.51.02.52.01.51.00.502.22.01.81.61.404812t/h1620240.450.400.350.300.250.200.150.100.050(K+)/(mgL1)(Mg2+)/(mgL1)D562 nm(Ca2+)/(mgL1)abcd图6不同材料对金黄色葡萄球菌胞外 K+（a）、Ca2+（b）、Mg2+（c）质量浓度及蛋白质（d）D562nm的影响第 2 期孙丽杰等：改性镁基水滑石制备及其对金黄色葡萄球菌的活性抑制研究199ASP 和 Ag+成功负载到镁基水滑石表面.利用菌落计数法探究其抑菌活性，结果表明 MALAA 在质量浓度为 4mgmL1时，几乎没有细菌存活，其抑菌率高达99.7%.MALAA 的抑菌能力并不是 MAL、ASP 和 Ag+三者的简单加和.金黄色葡萄球菌属于革兰氏阳性菌，其表面带有负电荷 zeta 电位为12.3mV，无机纳米材料中由于有 Ag+引入使 MALAA 带有大量正电荷，电位为 10.6mV，二者产生了带电量的巨大差异.改性镁基水滑石的抑菌活性可能是由于 MAL 负载后改变了其材料的形貌，增加了比表面积，通过电荷效应使得材料与细菌充分接触，导致阻塞其生存所需要的养料以及废物通道从而加速细菌衰亡；此外可能与 S.aureus 的细胞结构被破坏有关.通过 MALAA中 Ag+的缓慢释放，与细菌相结合从而破坏了细菌的细胞膜，改变其通透性，使得胞内大量营养物质（金属离子、蛋白质等）外泄，导致细菌死亡.本研究为镁资源的利用和金黄色葡萄球菌抑菌剂的开发及应用提供了理论依据，实现了多种渠道协同抑菌，表明该材料在食品包装材料、防腐涂层及化妆品等领域具有潜在的应用价值.4参考文献HEXX，LIYH，HEDG，etal.Aptamer-fluorescentsilicananoparticlesbioconjugatesbaseddual-colorflowcytometryforspecificdetectionofStaphylococcus aureusJ.JournalofBiomedicalNanotechnology，2014，10（7）：13591刘秀梅.食源性疾病监控技术的研究 J.中国食品卫生杂志，2004，16（1）：32KLEVENS R M，MORRISON M A，NADLE J，et al.Invasive methicillin-resistant Staphylococcus aureus infec-tionsintheUnitedStatesJ.JAMA，2007，298（15）：17633管程程，于美美，高伟，等.金黄色葡萄球菌的致病和耐药机制研究进展 J.实验与检验医学，2017，35（1）：14BANNERMAN D D，PAAPE M J，LEE J W，et al.Escherichia coliandStaphylococcus 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