基于网络药理学和分子对接技术探讨蒙药新黑苏嘎乌日勒治疗脑缺血再灌注损伤机制.pdf

基金项目：内蒙古自然科学基金项目（）通讯作者：赵志英【基础医学】基于网络药理学和分子对接技术探讨蒙药新黑苏嘎乌日勒治疗脑缺血再灌注损伤机制高呼日叉，郭无瑕，陈红，刘梦宇，李晓旭，赵志英（包头医学院，内蒙古 包头 ；巴彦淖尔市医院；包头医学院人体解剖学教研室）摘要 目的：探究蒙药新黑苏嘎乌日勒治疗脑缺血再灌注损伤的作用机制。方法：通过 、和 等数据库分别对药物及疾病靶点进行预测。利用 得到其共同靶点，并使用 软件构建 网络。运用 数据库开展 生物及 通路富集研究，并利用 软件构建活性成分 关键靶点 重要通路网络。最后，利用 等软件展开分子对接。结果：获得蒙药新黑苏嘎乌日勒治疗脑缺血再灌注损伤的关键靶点 个，重要生物过程 条，核心 通路 条和主要活性成分 个。分子对接结果显示，主要活性成分与关键靶点结合能力值 。结论：网络药理学分析表明，蒙药新黑苏嘎乌日勒主要通过 胡萝卜素、黄芩素、胡椒碱、金合欢素等有效成分作用于雌激素受体 （，）、核因子 （，）、肿瘤蛋白 （，）和蛋白激酶 （，）等靶点，调节细胞凋亡、肿瘤坏死因子（，）、低氧诱导因子 （，）、磷脂酰肌醇 激酶（，）、雌激素等信号通路，参与细胞凋亡的正负调控、炎症反应、血管生成、缺氧反应等生物过程，从而达到治疗脑缺血再灌注损伤的作用。关键词 新黑苏嘎乌日勒；脑缺血再灌注损伤；网络药理学；分子对接 ：，（，；，）：年第 卷第 期 ，：，：（），（），（）（），（），（），（），；缺血性脑卒中是卒中的一种典型表现形式，是影响我国患病率和死亡率的重要因素之一 。缺血性脑卒中是指因为脑部血液供应缺失而导致的脑缺血、低氧性坏死，以及相关的神经系统功能损害所引发的一种现代临床综合征 。临床上对脑缺血处理方法主要是恢复血液，但在有些情形下会加剧损害，称为脑缺血 再灌注损伤（，）。尽管对脑缺血级联反应已取得巨大的进展，但减少脑缺血和 损伤的有效保护神经疗法仍未实现。蒙医学是指蒙古族人民拥有一整套系统和科学理论体系的少数民族医学，是我国传统医学的一个部分。现代蒙医学中，突发性脑血管疾病统称为“萨病”，属于白脉（白脉指神经）疾病范畴，是因气血瘀滞导致黑脉（黑脉指血管）堵塞，继而引起“白脉之海”，使大脑失去功能而致病，临床中蒙药用于治疗缺血性脑卒中有一定的历史且在预防和治疗方面有独到之处 。蒙药新黑苏嘎乌日勒是根据 蒙医金贵 经典组方黑苏嘎 味丸制成的治疗缺血性脑卒中的有效方剂 ，由 单味药组成，即石决明、红花、诃子、豆蔻、肉豆蔻、丁香、檀香、人工麝香、荜茇、木香、肉桂、黑种草子、川楝子、栀子、螃蟹、地锦草、海金沙、土木香，具有改善气血运行，调节白脉功能，促进微循环作用，主要治疗脑血管病、动脉硬化、风湿性关节炎等。新黑苏嘎乌日勒在临床 治疗中具有良好的治疗效果 ，目前也已通过动物实验验证了其效果，但其作用机制尚不完善，还需要进一步全面和系统地研究。网络药理学是一项通过计算机辅助算法设计和构建的虚拟模式分析药物与疾病靶点相互之间“多成分、多靶位、多路径”协同效应关系的新技术，适用于复杂中成药方剂新靶点的发现。蒙药同中药治疗复方剂一样具多组分及多成分的特性 。本研究利用网络药理学方式，探讨蒙药新黑苏嘎乌日勒治疗 的主要作用机制。材料与方法 蒙药新黑苏嘎乌日勒相关靶点预测利用 数据库（：）为主，筛选大部分单味中药的生物活性成分，设定口服生物利用率（）、血脑屏障（）、类药性（）为主要筛选标准，进一步通过 年第 卷第 期 预测靶点蛋白。未满足 数据库的单味药物通过 数据库（：）、数 据 库（：）、数据库（：）以及知网文献搜索分别查找，利用 数据库（：）下载以上搜索到的化合物 格式的 结构图后，以 同样考虑口服生物利用率、类药性、血脑屏障筛选条件，运用 数据库（：）收集符合条件的有效成分并进行靶点蛋白预测，并获取 等于 或者前 的数值。其中螃蟹成分与脑缺血再灌注研究甚少，因此现暂不考虑纳入此研究。最后，在 数据库（：）中实现基因标准化和去重汇总。疾病相关靶点筛选从 数据库系统（：）和 数据库系统（：）中输入“”检查相关靶点，将两种数据库数值结合后删除重复得到靶点蛋白。蒙药新黑苏嘎乌日勒治疗 疾病潜在作用靶点的获取将药物和疾病的靶点分别录入 软件（：）在线作图平台上得到潜在作用靶点图。蛋白质相互作用（）网络构建及分析将经上述方法筛选得到的靶点基因，输入 数据库中（：），将最低作用阈值设定为“”，从而得到蛋白相互作用（，）信息。将得到的参数上传至 软件进行拓扑分析，选择节点连接度（值）高的核心靶点进行分析。分析及 通路富集分析利用 数据库（：）对潜在靶点蛋白通过基因本体（，）功能分析及京都基因和基因组百科全书（，）通路加以研究，筛选条件为“”，用微生信在线平台（：）实现信息可视化管理。“活性成分 关键靶点 重要通路”网络构建及拓扑分析为进一步阐释药效成分、关键靶点、重要通路间的关系，利用 软件绘制可视化关系图并进行进一步深入分析。分子对接分别在 数据库系统（：）和 数据库系统中下载靶点“”格式及成分“”格式结构。使用 软件对大分子进行分离配体、去水等方法，运用 软件进行小分子格式转换，进一步将活性成分和靶点蛋白导入 软件进行对接。最后，再次通过 软件实现分子对接可视化管理。结果 蒙药新黑苏嘎乌日勒相关靶点获取通过检索 、数据库以及知网文献检索 共筛选出 个有效化合物（表 ）和 个成分靶点。相关靶点筛选 将从 和 数据库中获取的靶点数据，经过对基因名 的标准化，并通过整理和删除数据后共得到了 个。基因集韦恩（）图的建立将药物靶点与疾病靶点，均导入 平台中，获得 个共有交集，即蒙药新黑苏嘎乌日勒为治疗 的潜在关键靶点（图 ）。图 “疾病 药物”交集靶点韦恩图 年第 卷第 期 表 蒙药新黑苏嘎乌日勒活性成分 单味药活性成分数据库 单味药活性成分数据库红花 荜茇，红花 荜茇 红花 荜茇 红花 荜茇（，）（，）（），红花 荜茇 （，），红花 肉豆蔻 红花 肉豆蔻 红花 肉豆蔻 栀子 肉豆蔻（）栀子 肉豆蔻 栀子 肉豆蔻 栀子 肉豆蔻 栀子 肉豆蔻 栀子 木香 栀子 （）木香 栀子 木香 豆蔻（）木香 豆蔻，黑种草子 豆蔻，黑种草子 豆蔻 黑种草子 豆蔻 黑种草子 豆蔻 黑种草子 豆蔻 檀香 豆蔻 檀香 丁香 檀香 丁香 檀香 丁香 檀香 丁香 檀香 地锦草 檀香 地锦草（，），（），檀香 地锦草 土木香，地锦草 ，土木香 川楝子 土木香 川楝子 土木香 川楝子 土木香 川楝子 土木香 海金沙 肉桂 海金沙 肉桂 海金沙 （）肉桂 海金沙 肉桂 海金沙 肉桂 诃子 肉桂 诃子 肉桂 诃子 肉桂 诃子（）（）（，）肉桂 诃子 肉桂 荜茇 肉桂 荜茇 肉桂 荜茇 石决明 文献 荜茇 人工麝香 文献 荜茇 人工麝香 文献 荜茇（，）人工麝香 文献 荜茇 人工麝香 文献 荜茇 人工麝香 文献 年第 卷第 期 网络构建分析及获取关键靶点基因将蒙药新黑苏嘎乌日勒作用于 的共有靶点导入 数据库，根据本研究设定条件得到 网络。运用 导入节点信息，根据 筛选排序，将分值高于 倍平均 的基因作为关键靶点展示（图 ）。图 药物疾病靶点 网络注：节点大小、颜色深浅反映 值，节点越大、颜色越深表明与某个蛋白具有相互作用的蛋白的数量越多 和 富集分析结果通过 数据库的研究结果，以 为条件共收集到 个生物过程（）、个分子功能（）、个细胞组分（）及其 条 通路，将 功能富集（图 ）排名前 生物过程、前 分子功能和细胞组分及前 的 通路（图 ）绘图从数据库导出。主要涉及缺氧反应（）、和 级联的正调节（）、凋亡过程的正 负调控（）、炎症反应（）等；细胞组成（）主要涉及质膜（）、胞质（）、膜筏（）、小窝（）、细胞外间隙（）等；分子功能（）主要涉及酶结合（）、药物结合（）、蛋白质结合（）、转录因子结合（）、蛋白激酶结合（）等。相关主要涉及通路为细胞凋亡（）、肿瘤坏死因子信号通路（）、缺氧诱导因子 信号通路（）、信号通路（）、雌激素信号通路（）等。图 共同靶点 分析点线图注：其中条形表示 值大小，条越长，表示 值越小；点表示基因数，点越大，表示基因数越多图 共同靶点 分析气泡图注：轴代表关联基因数与信号通路上总基因数的差值，轴代表通路名称，气泡越大，关联基因数越多；颜色越蓝，值越小 “活性成分 关键靶点 重要通路”网络展示按照结果 中研究 中前 关键靶点以及结果 中筛选到条重要通路，据此绘出“活性成分 关键靶点 重要通路”的网络图（图 ），其中类 年第 卷第 期 正方形节点代表核心靶位，六边节点代表活性成分，类三角形节点则代表关键通路。通过拓扑分析计算度值（）并提取 值的活性成分作为重要活性成分，从高到低依次分别为 胡萝卜素（）、黄芩素（）、胡椒碱（）、金合欢素（）、玫瑰树碱（）、谷甾醇（）、伞菌素（）、脱氢二异丁香酚（）、芝麻素（）、异愈创木酚（）。同样方法得到 值的关键靶点，见表 。图 “活性成分 关键靶点 重要通路”多维网络关系图注：红色六边形 活性成分；蓝色类三角形 通路；黄色长方形 靶点蛋白表 关键靶点（值）靶点 值 分子对接结果符合结果 网络中前 的关键靶点，与结果 “活性成分 关键靶点 重要通路”网络中前 关键靶点取交集，获得靶点蛋白 、作为核心靶点。反向与 “活性成分 关键靶点 重要通路”网络中前个重要活性成分进行结合能力预测。结果表明关键靶点与药效成分 胡萝卜素、黄芩素、胡椒碱、金合欢素发生较好的结合效应，见表 ，将黄芩素与个靶点蛋白分子对接图展示见图 。表 关键靶点与活性成分分子对接结果有效成分结合能量（）图 黄芩素与靶点蛋白 （）、（）、（）、（）的分子对接图 讨论运用网络药理学筛选出蒙药新黑苏嘎乌日勒有效成分共计 个，作用靶点 个，其中与 共有靶点 个，同时构建“活性成分 关键靶点 重要通路”网络，分析结果表明其核心成分有 胡萝卜素、黄芩素、胡椒碱、金合欢素等。胡萝卜素作为抗氧化剂，通过减轻内皮型一氧化氮合酶（，）脱偶联和硝化应激损伤可以治疗 。黄芩素是黄芩中含量最多的黄酮类物质之一，对预防与治疗缺血性脑卒中具有积极作用，具体表现在减少神经炎症、抑制细胞凋亡和自噬等方面 。胡椒碱是一种生物碱，可通过线粒体损伤的调节抗缺血性脑损伤 。金合欢素是一种具有抗氧化和抗炎特性的黄酮类化合物，研究提示金合欢素抑制小胶质细胞的炎症反应和核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白（，）信号通路，对脑缺血再灌注损伤具有保护作用 。联合 网络和“活性成分 关键靶点 重要通路”多维网络分析，筛选出 、和 可能是本研究的关键基因。是一类抑癌蛋白转录因子，涉及细胞周期调控、细胞存活衰老、修复和细胞凋亡等 。卒中后，在缺血脑组织中迅速积聚，通过转录依赖和非依赖凋亡程序激活神经元凋亡 。是一种蛋白激酶，在 通路中起着关键蛋白的作用 。通路广 年第 卷第 期 泛参与细胞活动，涉及细胞存活、增殖、代谢和肿瘤进展等，是典型的抗凋亡信号通路 。中，通过激活 通路刺激下游凋亡蛋白使细胞凋亡，还能够通过活化 信号通道刺激炎症反应，从而启动多种生存途径 。是雌激素受体蛋白，黄芪异黄酮通过激活雌激素受体 信号通路协同减轻脑缺血再灌注损伤 。（的一个亚基）是中间转录因子，在炎症反应、免疫和细胞存活中发挥关键作用 。先前研究发现，通过神经炎症、氧化应激等机制参与脑缺血再灌注损伤 。通路分析结果显示，蒙药新黑苏嘎乌日勒通过多条信号通路作用治疗 ，其中细胞凋亡、肿瘤坏死因子信号通路、信号通路、信号通路和雌激素信号通路相关研究较多。细胞凋亡是细胞生物体中常见的细胞死亡模式，在缺血后的卒中神经元中可以观察到胞质凝聚、核膜破裂和凋亡小体形成等凋亡的特征 。是一类能够引发炎症反应的细胞因子，当缺血性脑卒中时，它激活白细胞的组织因子和黏附分子，促进白细胞介素 （，）、一氧化氮（，）和凝血因子的释放，介导微血管功能障碍，加重脑组织的炎症反应。在缺血环境中稳定表达，并且在人体几乎全部的神经细胞中都能检测到，其中 可高效控制神经细胞凋亡，从而增加神经元细胞在轻度缺血条件下的存活率，对脑组织产生保护效果 。关于 功能富集方面，将重点聚焦于凋亡过程的正 负调控、炎症反应、缺氧反应、血管生成等方面，上述生物学过程体现在复方药物活性成分调节对应靶点和具体通路过程中。结合能力越小，配体与受体蛋白两者发生相互作用的亲和力就越大，因此通常认为结合能力值 的分子与靶点具有很好的结合功能 。分子对接结果表明，蒙药新黑苏嘎乌日勒的主要活性成分 胡萝卜素、黄芩素、胡椒碱、金合欢素与核心靶点 、有较好的结合活性，进一步验证了这些活性成分治疗脑缺血再灌注损伤的可能性。综上所述，蒙药新黑苏嘎乌日勒主要通过 胡萝卜素、黄芩素、胡椒碱、金合欢素等有效成分作用于 、等靶点，调节细胞凋亡、雌激素等信号通路，参与细胞凋亡的正负调控、炎症反应、血管生成、缺氧反应等生物过程，从而达到治疗脑缺血再灌注损伤的作用。本研究为临床治疗提供了依据，也为探讨新的治疗方法奠定了思路。参考文献 ，：，（）：，：吴海玉，财吉拉胡，赵福全蒙医学辨证施治萨病的研究进展 中国民族医药杂志，（）：乌兰图雅，特格喜白音，玉兰，等蒙药新黑苏嘎乌日勒对脑中动脉阻塞 再灌注损伤模型大鼠神经功能损伤的改善作用及机制研究 中国药房，（）：，：蒋且英，罗云，谭婷，等气质联用和化学计量学比较不同品种和产地麝香挥发性成分组成 中国实验方剂学杂志，（）：于娟不同麝香的气相色谱指纹图谱 中国实验方剂学杂志，（）：姜威，李晶峰，高久堂，等石决明的化学成分及药理作用 吉林中医药，（）：吴德康，吴启南，叶冠，等石决明成分与结构的分析研究 中草药，（）：天然抗氧化物经由抗硝化应激机制介导缺血性脑损伤保护作用研究 杭州：浙江大学，：（下转第 页）年第 卷第 期 ，：，：，（），（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，：（收稿日期：櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂櫂）（上接第 页），：，：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，：，：，：，：，：，：，：，（）：，：赖庆来，梁爱武，何妙仪，等化湿败毒方治疗新型冠状病毒肺炎的药理学机制探讨和网络药理学研究 天然产物研究与开发，（）：（收稿日期：）年第 卷第 期