DB32_T 3451-2018栽培稻种中杂草稻混杂检测规程.pdf

ICS 65.020.20 B 22 备案号：DB32 江苏省地方标准 DB32/T 34512018 栽培稻种中杂草稻检测规程 Testing regulations of Weedy Rice in Cultivated Rices Seed 2018-09-06 发布 2018-09-30 实施 江苏省质量技术监督局 发 布 目 次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 检测前准备工作.2 5 操作步骤.2 6 结果统计.3 附录 A（规范性附录）普通 PCR 方法.6 前 言 本标准按照 GB/T 1.12009标准化工作导则第 1 部分：标准的结构和编写的规则起草。本标准由南京农业大学提出并归口。本标准起草单位：南京农业大学。本标准主要起草人：强胜、戴伟民、宋小玲。栽培稻种中杂草稻检测规程 1 范围 本标准规定了杂草稻的术语和定义、试剂配制、仪器和用具、照明要求、样品制备、操作步骤、结果计算等方面的内容。本标准适用于栽培稻稻种中杂草稻的检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 5491 粮食、油料检验扦样、分样法 GB/T 22505 粮油检验 感官检验环境照明 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 杂草稻 weedy rice 杂草稻(weedy rice)是指在水稻田中可以自我繁衍具有杂草特性的水稻（Oryza sativa L.）物种。3.2 纯合体的杂草稻 homozygotic weedy rice 栽培稻种子中具有红果皮的杂草稻。3.3 杂合体的杂草稻 heterozygous weedy rice 杂草稻的花粉飘逸到栽培稻柱头上发生杂交，产生的栽培稻种子（2n=24条染色体）中含有杂草稻的一半染色体（n=12条染色体），但果皮色依然表现为白色。称为杂草稻杂合体。其种植到田里开花结果，就会产生性状分离，产生具有红色果皮的杂草稻种子。3.4 Rc 基因 Rc gene Rc 基因是水稻果皮原花色素积累途径中最重要的调节基因之一,位于第染色体上,全长约6.4kb,包含有8个外显子,产物为一个具有碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)元件的调节蛋白。Rc基因具有比rc基因多14 bp插入/缺失，从而设计特异性14 bp插入/缺失引物进行PCR扩增，以检测杂合体杂草稻。4 检测前准备工作 4.1 试剂配制 聚丙烯酰胺母液（40%）：按 19:1 的比例将 38 g 丙烯酰胺和 2 g 甲叉双丙烯酰胺加入 100 ml 去离子水中，待溶解后定容，于 4 冰箱中储存备用。5 x TBE 电泳缓冲液 1 L（母液）：54 g Tris base，27.5 g 硼酸，20 ml 0.5M EDTA（pH8.0），加蒸馏水至 1L。10%过硫酸铵：1 g 过硫酸铵溶于 10 ml 蒸馏水中，4 冰箱中保存 1 周左右。400 mL NaOH 溶液：6 g 氢氧化钠，0.076 g 四硼酸钠，1.6 ml 甲醛(甲醛应放入冰箱中，易变性),加蒸馏水至 400 ml，现配现用。0.1%AgNO3：取 0.1 g AgNO3 溶解于100ml 蒸馏水中，现配现用。4.2 仪器和用具 稻谷检验出糙机、电动研磨机、PCR 扩增仪、电泳槽、电泳仪、照相机。4.3 照明要求 操作过程中照明条件应符合 GB/T 22505 的要求。4.4 样品制备 纯合体杂草稻检测取样按 GB 5491-1985 执行。上述纯合体杂草稻检测后，去除红色糙米，然后将白色糙米按 GB 5491-1985 中 3.1 的规定混匀。将样品倒在光滑平坦的桌面上或玻璃板上，用两块分样板将样品摊成正方形，然后从样品左右两边铲起样品约 10 cm 高，对准中心同时倒落，再换一个方向同样操作(中心点不变)，如此反复混合 4 次5 次，将样品摊成等厚的正方形。取 50 份，每份 200 粒糙米。5 操作步骤 5.1 纯合体杂草稻检测 使用稻谷检验出糙机脱壳，查看糙米的颜色，分别计数糙米总数（m）和红色糙米数（m1）。5.2 杂合体杂草稻检测 5.2.1 磨粉 用电动研磨机将 200 粒白色糙米碾磨成粉，混合均匀，取 4 份，各 30 mg。5.2.2 DNA 提取 采用适于提取水稻及其产品 DNA 的试剂盒方法，进行 DNA 提取。制备 DNA 模板时设置不加任何试样的空白对照。5.2.3 DNA 溶液纯度测定和保存 将DNA溶液适当稀释，测定并记录其在260 nm和280 nm的紫外光吸收率，OD 260值应该在0.051 的区间内，OD260 nm/OD280 nm 比值应介于 1.4 2.0 之间，根据 OD260 值计算 DNA 浓度。依据测得的浓度将 DNA 溶液稀释到 25 ng/uL，-20 保存备用。5.2.4 PCR 反应和跑胶 见附录 A。记录杂合条带的胶孔数（n）。6 结果统计 6.1 纯合体杂草稻检验结果计算 纯合体杂草稻含量（M）以质量分数（%）表示，按式（1）计算：M=（m1/m）x 100 (1)式中：m1-糙米中红色糙米的粒数，单位为粒 m -糙米的总粒数，单位为粒。在重复性条件下，获得的四次独立测试结果，求其平均值，即为测试结果。测试结果保留到小数点后 5位。6.2 杂合体杂草稻检验结果计算 杂合体杂草稻含量（N）以质量分数（%）表示，按式（2）计算：N=（n1/200）x 100 (2)式中：n1-杂合条带的胶孔数，单位为个。在重复性条件下，获得的四次独立测试结果，求其平均值，即为测试结果。测试结果保留到小数点后 5位。6.3 杂草稻总混杂率检验结果计算 杂草稻总混杂率（T）以质量分数（%）表示，按式（3）计算：T=M+N (3)A A B 附 录 A（规范性附录）普通 PCR 方法 A.1 引物 引物序列见表A.1，用TE缓冲液（pH8.0）或双蒸水分别将表A.1引物稀释到10 mol/L。表 A.1 PCR 引物序列 A.2 PCR检测 A.2.1 PCR反应 A.2.1.1 试样PCR反应 在PCR反应管中按表A.2依次加入反应试剂，轻轻混匀，再加约5 L石蜡油。10000 rpm离心10 s后，将PCR管插入PCR仪中。反应程序为：94 预变性5 min;94 变性45 s,55退火45 s,72延伸l min,30个循环;72延伸8 min。反应结束后取出PCR反应管，对PCR反应产物进行电泳检测或在4下保存待用。表 A.2 PCR 反应体系 成分 体积(l)2 PCR Mix 4.0 ddH2O 4.5 Primer forward(10mol/L)0.25 Primer reverse(10mol/L)0.25 模板 DNA(10-20ng/l)1 检测基因 引物 引物序列(5-3)PCR 产物大小(bp)Rc Primer1 Primer2 RED4-For:TTACAGGGGAGCAGAAACA RED4-Rev:TCTTCTCCTCTCTTTCAGCAC 118 rc Primer1 Primer2 RED4-For:TTACAGGGGAGCAGAAACA RED4-Rev:TCTTCTCCTCTCTTTCAGCAC 104 注：2 PCR Mix成分为dNTP 0.2 mmol L1、KCl 100 mmol L1、Tris-HCl(pH 8.5)20 mmol L1、Taq Polymerase 5 U/100L、MgCl2 3.0 mmol L1。A.2.1.2 对照PCR反应 在试样PCR反应的同时，应设置阴性对照、阳性对照和空白对照。阴性对照是指水稻日本晴品种中提取的DNA作为PCR反应体系的模板；阳性对照，用杂草稻作为PCR反应体系的模板；空白对照，用无菌水空白对照作为PCR反应体系的模板。上述各对照PCR反应体系中，除模板外其余组分及PCR反应条件与A.2.1.1相同。A.2.2 PCR产物电泳检测 A.2.2.1 6%聚丙烯酰胺凝胶的制作 a)制作底座：在桌面上铺上报纸，用于摆放制胶用长短板，在长短板左右分别夹上两片1 mm厚薄塑料片，用于间隔长短玻璃板，将胶灌入，用大夹子，用于固定玻璃板。按照1：100的比例配制琼脂糖凝胶溶液，在微波炉中加热，沸腾2-3次至溶液澄清后倒入底座槽中，倒至槽子1/3处即可。将已摆放好的长短制胶板（中间夹有薄塑料片）插入底座槽，用准备好的大夹子将其固定在制胶架上。虹吸作用会使琼脂糖进入长短板之间，室温冷却后，即可把板子下端封闭。b)6%聚丙烯酰胺凝胶配制：5 TBE 5 ml,40%丙烯酰胺 3.75 ml，去离子水16.25 ml，混匀后加入250 ul 10%过硫酸铵和12 ul TEMED。搅拌后迅速进行灌胶。c)灌胶：将混合液沿短板的一端慢慢灌入两板间的缝隙至上端开口处，再将胶孔梳插入两板之间，加入少许混合液将缝隙完全灌满。注意灌胶过程中不可气泡，可以通过震荡板子将气泡赶出。d)聚丙烯酰胺凝胶的凝固：室温下，聚丙烯酰胺凝胶经过15-20分钟将完全凝固，在此期间可以根据液面的下降不时用剩余聚丙烯酰胺混合液补足。e)聚丙烯酰胺凝胶板的安装：待凝胶彻底凝固后将板子拆下，放入盛有去离子水的盆中，利用水的推力将胶孔梳取下，并剥离封口用的制胶槽和琼脂糖，在去离子水中清洗制胶板和加样孔，然后，将其安装在加有1 TBE电泳缓冲液的电泳槽上，准备加样、电泳。A.2.2.2 电泳 吸取2 L的PCR产物与1 ul加样缓冲液混合后加入点样孔中，在其中一个点样孔中加入1 ul 100 bp Marker，用于判断产物的长度。电泳时电压设置为120V，电泳时间设置为1小时。A.2.2.3 AgNO3银染与显色：电泳后，采用银染方法对凝胶结果进行显色，具体步骤：电泳完成后，将胶板取下，用去离子水清洗之后，轻轻撬开制胶板，将凝胶从板上剥离下来。再用去离子水清洗两遍，沥干；配制400 ml 0.1%AgNO3溶液，倒入盛有凝胶的盆中，将盆放在摇床上，盖上盖子避光漂染，转速60 r/min，染15 min。之后沥干AgNO3溶液，并在去离子水中洗涤两次；将400 mL NaOH溶液倒入盛有凝胶的盆中，在摇床上保持上一步骤转速（60 r/min），漂染10 min。显色完全后，将NaOH溶液沥干，用自来水充分洗净，用玻璃板捞出，平展整齐，在室温下风干至无水流出，然后将胶放于灯箱上，用数码相机拍照记录。特异标记特异标记 WR4 检测结果检测结果 注：M为100 bp Marker；1为日本晴(水稻)；3为珍汕97B(水稻)；5为9311(水稻)；2，4，617为纯合体的杂草稻；10为杂合体的杂草稻 _