微泡菌QZHA1褐藻胶裂解酶MAAL1的酶学性质研究.pdf

第 卷 第 期应 用 海 洋 学 学 报，年 月 ，微泡菌 褐藻胶裂解酶 的酶学性质研究闫康路，邵宗泽，王万鹏，谢珍玉，周梅先 收稿日期：资助项目：国家自然科学基金（）；中国大洋协会资助项目（）作者简介：闫康路（），男，硕士研究生；：通讯作者：周梅先（），女，副研究员；：；谢珍玉（），男，教授；：（海南大学海洋生物与水产学院，海南 海口；自然资源部第三海洋研究所、自然资源部海洋生物遗传资源重点实验室，福建 厦门）摘要：为探究 褐藻胶裂解（）酶 的酶学性质，将褐藻胶裂解酶基因 构建至 表达载体并利用大肠杆菌（）进行异源表达。研究发现：重组酶 与来源于 菌株的褐藻胶裂解酶（）同源性最高，为，且与 家族蛋白聚为一支；重组酶 最适温度为 ，最适 为，在 为 范围内保存 仍能保持 以上的酶活力；具备良好的耐有机溶剂特性，在测试的 种有机溶剂中，除异丙醇外，其他有机溶剂在添加量达到（体积分数）后，酶活力依然保持在 以上；重组酶 最适条件下酶活力为 ，米氏常数（）值为，最大反应速率（）为 （），催化常数（）值为 ；重组酶 对聚 甘露糖醛酸（，）具有底物特异性，对聚 古罗糖醛酸（，）无降解能力；薄层层析分析显示，降解海藻酸钠的主要终产物是单糖、二糖和三糖，降解 的主要终产物是二糖和三糖，降解 杂合片段（，）的主要终产物为单糖和二糖，故 是一种内切型聚甘露糖醛酸裂解酶。重组酶 具有良好的 和有机溶剂耐受性，对 具有底物特异性且不降解，该特性褐藻胶裂解酶首次在微泡菌属中被发现，该酶可为制备甘露糖醛酸寡糖（，）提供新的候选用酶。关键词：海洋生物学；微泡菌属；褐藻胶裂解酶；克隆表达；聚甘露糖醛酸；耐有机溶剂：中图分类号：文献标识码：文章编号：（）褐藻胶是广泛存在于各种褐藻中的一类多糖物质，具有分子量大、高聚合度和高纤维性等特点，以致不利于机体对其吸收利用，而褐藻寡糖（，）的特性弥补了褐藻胶的不足且在抗氧化、抗炎及提高植物抗胁迫能力等方面优于褐藻胶。据报道，的制备方法主要有物理、化学和生物酶解 种方法，其中，生物酶解法相较于其他两种方法，具有效率高、无污染以及专一性强等优点，故在制备 方面受到越来越多的关注。褐藻胶裂解酶在自然环境中的分布较为广泛，褐藻胶裂解酶可将褐藻胶降解为褐藻寡糖。产褐藻胶裂解酶的细菌主要有假交替单胞菌属（）、弧菌属（）及微泡菌属（）等，这些细菌主要分离自褐藻及以褐藻为食的软体动物中。到目前为止，褐藻胶裂解酶已被归类到 数据库中 个不同的多糖裂解酶家族，包括、和（：）。不同底物特异性的褐藻胶裂解酶降解褐藻胶生成的 在结构上存在一定差异，而寡糖的结构又 期闫康路，等：微泡菌 褐藻胶裂解酶 的酶学性质研究 与其自身的生物活性密切相关。具有严格底物特异性的褐藻胶裂解酶降解褐藻胶产生的寡糖在结构上比较容易确定，基于 结构与功能的关系，筛选出具有底物特异性的褐藻胶裂解酶，对明确 的功能及实际应用具有积极作用。目前褐藻胶裂解酶的研究大都集中在提高稳定性和催化效率上，对褐藻胶裂解酶底物降解模式研究较少。一般有甘露糖醛酸寡糖（，）、古罗糖醛酸寡糖（，）和杂合的甘露糖醛酸和古罗糖醛酸寡糖（，）种类型，基于目前多数褐藻胶裂解酶对聚 甘露糖醛酸（，）和聚 古罗糖醛酸（，）都有活性，所以当前在理论研究和实践应用中使用的 基本上是这 种类型的混合物，其具有不同的 比、聚合度（，）及空间结构。上述杂合 的结构相比其他类型的寡糖更为复杂，不利于对寡糖功能的研究与利用。基于上述问题，本研究通过筛选并表征出具有严格底物特异性的褐藻胶裂解酶，为制备特定类型 提供一种新的候选用酶，在揭示 结构与功能的关系以及促进特定类型 的开发与应用方面具有重要意义。材料与方法 实验材料、试剂与仪器 菌株、载体和培养基产褐藻胶裂解酶菌株 分离自福建泉州洛阳江红树林沉积物样品，已保藏在中国海洋微生物菌种保藏管理中心，编号为 ；大肠杆菌（）（克隆宿主）和大肠杆菌（）菌株及质粒 均为笔者所在实验室保存。培养基：酵母粉 ，胰蛋白胨 ，高温高压灭菌 （固体培养基需要额外添加质量分数为的琼脂粉）。试剂、和限制性内切酶购自北京全式金生物技术股份有限公司；试剂盒、试剂盒和 纯化试剂盒均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；基因组提取试剂盒和 聚合酶购自福州瑞真生物技术有限公司；购自厦门浩禾生物科技有限公司；海藻酸钠、杂合片段（，）及一系列 标准样品均购自青岛博智汇力生物科技有限公司。仪器本研究所用仪器包括恒温摇床（上海知楚仪器有限公司）、恒温水浴锅和恒温培养箱（上海精宏实验设备有限公司）、凝胶成像仪（上海天能科技有限公司）、仪和多功能酶标仪赛默飞世尔科技（中国）有限公司、冷冻离心机（公司）、超声波细胞破碎仪（南京舜玛仪器设备有限公司）。方法 褐藻胶裂解酶的序列分析基于美国国家生物技术信息中心（）提供的大量生物信息和在线数据资源，利用其线上检索工具 对 褐藻胶裂解酶 进行相似蛋白检索，利用线上软件 进行信号肽预测，利用 预测蛋白分子量及等电点，利用 软件通过邻接法对 进行系统发育分析。表达载体的构建按照菌株 的褐藻胶裂解酶 基因序列设计并合成 引物，引物序列如下：正向引物（）和反向引物（），以微泡菌 基因组 为模板扩增 基因片段。体系（）：基因组 ，引物 ，引物 ，聚合酶 ，。程序设定为：（预变性）；（变性），（退火），（延伸），循环 次；（最终延伸）；于 条件下保存。完成之后，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测并纯化回收备用。利用限制性内切酶 和 对表达载体 进行双酶切，酶切完成后对线性化质粒进行纯化，以无缝克隆连接酶于 水浴进行连接反应，将连接产物转化入大肠杆菌 中，用灭菌牙签挑取单菌落进行菌落 验证，将验证结果符合预期的克隆子活化并提取重组质粒，对提取完成的质粒利用 和 限制性内切酶进行双酶切和测序验证，以便筛选出正确的阳性克隆子。应 用 海 洋 学 学 报 卷 重组酶 的诱导表达及纯化将重组质粒 转化入表达宿主大肠杆菌（）化学感受态细胞中，挑取单菌落接种于 含有 的卡那霉素的 培养基中，、过夜活化；次日，取 菌液接种至 的 培养基（含有 的卡那霉素）中，、培养至 达到范围内，停止震荡培养并将恒温摇床温度调至；待摇床温度降至 ，取出三角培养瓶加入（终 浓 度 为 ）；最 后 于 、条件下培养 。将诱导完成后的发酵液于 、条件下离心 收集菌体，加入 磷酸缓冲液（）漂洗菌体，用结合缓冲液（，为 ，咪唑）重悬菌体，超声破碎（超声功率 ，工作、间隙时间分别为、），破碎完成后，在 、条件下离心，离心完成后用离心管分别收集破碎上清和沉淀，利用琼脂糖亲和层析介质 对破碎上清中的重组酶 进行结合纯化，纯化完成后将上述收集的样品进行 分析。酶活力测定及酶动力学分析还原糖含量的测定采用 显色法。反应体系为在 （质量分数）海藻酸钠底物溶液中加入 稀释后的酶液，混匀后在 的水浴中反应，再加入 ，煮沸 显色，然后立即转至冰水浴中冷却，经过短暂高速离心之后，测定。个酶活力单位（）定义如下：在 条件下 内裂解海藻酸钠底物生成 还原糖所需要的酶量。分别配制不同浓度（、）的海藻酸钠底物溶液，测定 在不同浓度底物条件下的酶活力。以 为横坐标，为纵坐标采用 双倒数作图法对底物浓度与反应速率间的关系进行绘图，计算出重组酶 的最大反应速率（）、米氏常数（）值及催化常数（）值。酶学性质研究不同温度对重组酶活力及其温度稳定性的影响。在 温度范围内，的体系中测定重组酶 酶活力，以最适反应条件下的酶活力为；重组酶在 保温 后，测定其酶活力，检测重组酶的温度稳定性。不同 对重组酶活力及其 稳定性的影响。在不同 缓冲液 醋酸缓冲液（为 ），磷酸缓冲液（为 ），缓冲液（为），甘氨酸氢氧化钠缓冲液（为 ）中，在最适温度条件下测定其酶活力，以最适反应条件下的酶活力为；重组酶在 为 范围内于 放置 后，在最适反应条件下测定其酶活力，检测重组酶的 稳定性。不同金属离子及表面活性剂对重组酶活力的影响。在 海藻酸钠反应体系中分别加入、（终浓度）的金属离子及表面活性剂，于最适条件下反应 ，测定其对 酶活力的影响。不同有机溶剂对重组酶活力的影响。在海藻酸钠反应体系中加入、及（体积分数，下同）的有机溶剂，在最适条件下反应 ，测定不同浓度的有机溶剂对重组酶活力的影响。重组酶底物特异性测定。分别以质量分数为的海藻酸钠、和 为底物，于最适反应条件下检测重组酶活力，并以海藻酸钠为底物条件下的酶活力为 来测定 降解不同底物的相对酶活力。重组酶降解产物分析采取薄层层析法（）对 降解产物进行分析。将在最适条件下反应得到的酶解产物在 条件下将重组酶进行灭活，然后 离心 ，取上清，用 滤膜过滤。取 处理后的样品点样于层析板，用展层剂（正丁醇 甲酸 水 ，体积比）展开样品，展层结束后吹干层析板，喷涂显色剂（体积分数为 硫酸乙醇），最后于 烘箱显色。结果与分析 褐藻胶裂解酶 序列分析 基因全长为 ，编码 个氨基酸，在蛋白的 端是一个由 个氨基酸残基组成的信号肽。蛋白理论分子量为 ，理论等电点为。将 与已报道的其他褐藻胶裂解酶序列进行比对，发现 与来源于 菌株的褐藻胶裂解酶（）同源性最高，为，且与 家族蛋白聚为一支（图），推测 属于 家族成员。重组酶 的载体构建及其诱导表达对菌落 验证正确的克隆子进行活化并提 期闫康路，等：微泡菌 褐藻胶裂解酶 的酶学性质研究 取质粒，质粒提取完成后进行 和 双酶切验证，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，获得大小约为 和 的两条条带图（），条带大小与表达载体及目的基因片段大小基本一致，且后续测序结果也与目的基因序列一致，表明重组质粒 构建成功，可进行后续诱导表达实验。经 诱导表达后，样品中出现一条对应于重组 的蛋白条带，而诱导前样品未出现该条带，表明 在大肠杆菌中表达成功。破碎上清经 纯化后得到与预测分子量一致的重组 蛋白条带图（）。图 褐藻胶裂解酶 的系统进化分析 图 重组酶 表达载体构建与表达 （）为重组质粒 的双酶切验证，为 ；（）为重组酶 的纯化，为 。重组酶 酶动力学分析根据酶促动力学双倒数曲线（图）计算出 值为 ，为 （），值为。应 用 海 洋 学 学 报 卷图 重组酶 的 双倒数图 的单位为 ，的单位为 。重组酶 的酶学性质研究 不同温度对重组酶活力及其稳定性的影响 的最适反应温度为 ，在 范围内酶活力较高，其酶活力可以保持在 以上图（）。将重组酶在 范围内保温，测定剩余酶活力，发现该酶在 具有良好的稳定性，在保温 后其酶活力依旧保持在以上图（）。图 不同温度对 酶活力及其稳定性的影响 （）为不同温度对重组酶 酶活力的影响，（）为重组酶 的热稳定性。不同 对重组酶活力及其稳定性的影响重组酶 最适 为，在 为 范围内酶活力较高，具有较为宽泛的 作用范围图（）。重组酶在常用缓冲液中稳定性良好，在 为 范围内保存 后，其酶活力都能保持在 以上图（）。不同浓度金属离子、表面活性剂及有机溶剂对重组酶活力的影响不同浓度的、和 对重组酶 的活力影响不大，的、以及（体积分数）的 和 对重组酶 活力具有一定的促进作用；随着浓度的提高，除去、外，其余金属离子与 和 对重组酶活力表现出明显的抑制作用；另外该酶对、和 具有很好的耐受性，在浓度达到 时，其酶活力依然都保持在 以上（图）。以上结果显示高浓度的二价金属离子对重组酶普遍具有抑制作用，后期在生产中应避免加入上述金属离子。另外，重组酶对表面活性剂的耐受能力较强，这在后续的工业应用中具备优势。重组酶 对 种有机溶剂耐受性测试实验发现，的乙醇、异丙醇和二甲基亚砜对重组酶活性具有一定的促进作用，其中异丙醇的促进作用最明显，可以提高重组酶 左右的酶活力，其他的有机溶剂对 酶活力影响不大；在 的有机溶剂中，除异丙醇和异戊醇的酶活力下降至 左右，其余有机溶剂对 酶活力影响不明显；在 的有机溶剂中，吐温 和二甲基 期闫康路，等：微泡菌 褐藻胶裂解酶 的酶学性质研究 亚砜对 酶活力影响比较明显，酶活力下降了 左右，而其他有机溶剂影响不明显，酶活力依然都保持在 以上；在 的有机溶剂中，除异丙醇外，重组酶在其余有机溶剂中都能保持 以上的酶活力；在 的有机溶剂中，正丁醇、异戊醇、丙三醇、石油醚、吐温 以及二甲基亚砜都能保持在 以上的酶活力；另外，重组酶对异戊醇、丙三醇及石油醚的耐受能力最强，其体积分数达到时依然能保持 以上的酶活力（图）。以上结果显示重组酶 对上述 种有机溶剂具有良好的耐受性，在后续的工业应用中将具有较为明显的优势。图 不同 对 酶活力及其稳定性的影响 （）为不同 对重组酶 酶活力的影响，（）为重组酶 的 稳定性。图 不同浓度金属离子和表面活性剂对重组酶 活力的影响 图 不同有机溶剂对重组酶 活力的影响 应 用 海 洋 学 学 报 卷 重组酶的底物特异性重组酶 能够降解海藻酸钠、和，且 对 海 藻 酸 钠 降 解 效 果 较 好，但 是 对 降解能力较弱且几乎不能降解，显示该酶是一种对 具有特异性的聚甘露糖醛酸裂解酶（图）。图 重组酶 的底物特异性 重组酶的降解产物分析重组酶 降解海藻酸钠的终产物主要为单糖、二糖和三糖，降解 的终产物主要是二糖和三糖，降解 的终产物主要为单糖和二糖，不能降解，证实该酶是一种具有底物特异性的内切型褐藻胶裂解酶（图）。图 重组酶 的降解产物分析 ：甘露糖醛酸寡糖标准品，：古罗糖醛酸寡糖标准品，：聚合度，：海藻酸钠，：海藻酸钠降解产物，：，：降解产物，：，：降解产物，：，：降解产物。讨论重组酶 对 具有底物特异性，对 无降解能力。对 具有特异性的褐藻胶裂解酶在制备 方面更具优势。有研究表明，在 抑菌试验中，比 抗菌活性更高，这可能是由于 的柔性链结构更有利于其渗透到细胞中发挥功能；在通过调节肠道微生物菌群治疗代谢疾病方面较 具有更加显著的作用；另外，值高的 在免疫调节和抗肿瘤方面更具优势。根据 及 等数据库发现多个多糖裂解酶家族中已有关于对 具有底物特异性且对 无降解能力的褐藻胶裂解酶的报道，其中大都来自于弧菌属和假交替单胞菌属（表）。重组酶 来源于微泡菌属，目前尚未发现微泡菌来源的对 具有底物特异性且不降解 的褐藻胶裂解酶的报道。综上，本研究获得的重组酶 为制备 提供了一种新的候选用酶。重组酶 具有良好的 耐受性。目前对 具有底物特异性且对 无降解能力的褐藻胶裂解酶最适温度大多集中在 ，最适 在 范围内（表）。在 耐受方面，在 为 的范围内保存 后依然能保留 以上的酶活力，相较于表 中的褐藻胶裂解酶，其 耐受能力更好，虽然来源于 的褐藻胶裂解酶 保存时间更久，但 是 的 耐 受 范 围 更 广。因 此 在工业制备 方面更具优势。重组酶 还具备良好的有机溶剂耐受性。在有机溶剂耐受方面，目前仅有一篇褐藻胶裂解酶的相关报道，来源于 的褐藻胶裂解酶 在 的二甲基亚砜和乙醇中保温 后其酶活力明显下降，酶活力仅剩 和，在 的二甲基亚砜和乙醇中其酶活力进一步下降至 和，而 在、的二甲基亚砜与、的乙醇中保温 后其酶活力都保持在 以上，在 的乙醇和 的二甲基亚砜中 依然能保持以上的酶活力；在 的异丙醇和异戊醇中保温 后，酶活下降至 以下，而 在相同条件下酶活力依然保持在 以上，在 的异戊醇中酶活力也能保持在 以上。乙醇作为一种清洁能源可充当石油衍生燃料的替代品，近年来利用工程酵母生产乙醇受到越来越多的关注，利用褐藻胶裂解酶降解褐藻胶产生的不饱和单糖是工程酵母生产乙醇的重要原料。由于使用单一的外切酶生产不饱和单糖的效率较低，因此利用产生单糖的内切酶和外切酶联合降解褐藻胶可 期闫康路，等：微泡菌 褐藻胶裂解酶 的酶学性质研究 以极大地提高生产效率。降解海藻酸钠可产生单糖，在生产方面可与其他外切酶联用生产不饱和单糖。在酿酒酵母生产乙醇的过程中，或许可以将耐受乙醇的褐藻胶裂解酶构建到毕赤酵母中与酿酒酵母联合发酵生产乙醇，以此减少生产成本。综上，可能在生产生物燃料方面具备优势。表 对 具有底物特异性的褐藻胶裂解酶酶学性质 名称来源家族底物特异性最适温度 最适 耐受（保留 酶活力）酶活力（）参考文献 后，为 本研究 后，为（）后，为 后，注：“”表示该酶对 不具有降解能力。结论本研究表征出的重组酶 经系统发育分析是属于 家族的褐藻胶裂解酶，的最适反应温度是 ，最适 为，且具有良好的 稳定性，在 为 条件下保存 依然能保持 以上的酶活力，最适条件下酶活力为 ；另外，该酶还具有良好的有机溶剂耐受性，在 的乙醇中能保留 以上的酶活力；对 具有底物特异性，对 基本不降解，该酶降解海藻酸钠的主要终产物为单糖、二糖和三糖，降解 的主要终产物是二糖和三糖，降解 的主要终产物则为单糖和二糖，表明 是 一 种 内 切 型 聚 甘 露 糖 醛 酸 裂 解 酶。在制备 和生物燃料开发等方面具有应用潜能。参考文献：，：，：栾明鉴，何熹，林荣芳，等 褐藻胶裂解酶研究进展 食品工业，（）：，（）：，：，（）：，（）：虞铭霞，张怡，张宾 海藻糖和褐藻胶寡糖对冻藏紫贻贝品质的影响 现代食品科技，（）：，（），（）：刘海超，张健，王共明，等 褐藻胶的降解方法及其产物生物活性研究进展 食品工业科技，（）：，（）：应 用 海 洋 学 学 报 卷 ，：，（）：，：，（）：，：，：，：，（）：廖祥兵，陈晓明，肖伟，等 法定量测定还原糖的波长选择 中国农学通报，（）：，（）：，：（），：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：孙家霞，王海楠，傅政，等 海洋细菌 中新型褐藻胶裂解酶 的研究 中国海洋药物，（）：，（）：期闫康路，等：微泡菌 褐藻胶裂解酶 的酶学性质研究 ，（，；，）：，（）（）（），（），（），（），（），（），：；：（，）（责任编辑：方建勇）