解淀粉芽孢杆菌OMR1-7菌株对拟石莲花属多肉植物黑腐病的生防效果.pdf

引文格式：刘爽,唐锐,谭丹,等.解淀粉芽孢杆菌 OMR1-7 菌株对拟石莲花属多肉植物黑腐病的生防效果J.云南农业大学学报(自然科学),2024,39(1):5463.DOI:10.12101/j.issn.1004-390X(n).202307024解淀粉芽孢杆菌 OMR1-7 菌株对拟石莲花属多肉植物黑腐病的生防效果*刘爽，唐锐，谭丹，薛治峰，李梦杰，张廷萍，秦世雯*(云南大学农学院/资源植物研究院，云南昆明650500)摘要:【目的】明确解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)对拟石莲花属(Echeveria)多肉植物黑腐病病原菌尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的生防效果。【方法】从小粒野生稻(Oryza minuta)根部分离和鉴定了 1 株内生解淀粉芽孢杆菌 OMR1-7 菌株，测定其对拟石莲花属多肉植物品种血色罗密欧黑腐病菌 F.oxysporumKMEARM-2 菌株和静夜黑腐病菌 F.oxysporumKMJY6 菌株的拮抗效果、产铁载体和生物膜能力、定殖能力以及温室防效。【结果】OMR1-7 菌株对 2 种黑腐病菌菌丝抑制率分别为 57.15%和 74.29%，菌体抑制率分别为 84.82%和 86.15%。该菌株可造成 2 种黑腐病菌的侵染结构畸形，产孢量减少。该菌株产铁载体相对量为 80.98%，具有较强的铁元素竞争能力，且能够产生生物膜，在血色罗密欧和静夜植株的根、茎、叶内稳定定殖，预防黑腐病菌的侵入和蔓延。OMR1-7 菌株对血色罗密欧和静夜黑腐病具有良好的生防效果，温室防效分别为 80.08%和 78.89%。【结论】研究结果将为拟石莲花属多肉植物黑腐病的生物防治提供微生物菌种资源，为相关生防菌剂及制剂研发提供参考。关键词:拟石莲花属；多肉植物黑腐病；尖孢镰刀菌；解淀粉芽孢杆菌；生物防治中图分类号:S436.412.1文献标志码:A文章编号:1004390X(2024)01005410Biocontrol Efficiency of Bacillus amyloliquefaciens OMR1-7against Echeveria Black Rot DiseaseLIUShuang，TANGRui，TANDan，XUEZhifeng，LIMengjie，ZHANGTingping，QINShiwen(CollegeofAgriculture/InstituteofResourcePlants,YunnanUniversity,Kunming650500,China)Abstract:PurposeToclarifythebiocontroleffectsofBacillus amyloliquefaciensOMR1-7aga-instFusarium oxysporumcausingblackrotdiseaseinEcheveriasucculentplants.MethodsTheendophyticbacterialstrainOMR1-7isolatedfromtheroottissuesofOryza minutawasidentifiedasB.amyloliquefaciensinthisstudy.TheantagonisticeffectsofB.amyloliquefaciensOMR1-7againstF.oxysporumKMEARM-2onE.agavoidescv.RomeoandF.oxysporumKMJY6onE.derenber-giicv.Purpus,thepathogenscausingblackrotdiseaseinsucculentplantsofthegenusEcheveria,wasevaluated.Furthermore,itsabilitytoproduceironcarriersandbiofilms,colonizationcapacity,收稿日期：2023-07-18修回日期：2024-01-29网络首发日期：2024-03-05*基金项目：国家自然科学基金项目(32060593)；云南省基础研究计划面上项目(202101AT070021)；云南大学研究生科研创新项目(KC22223012，ZC-22222674)。作者简介：刘爽(1998)，女，湖北黄冈人，在读硕士研究生，主要从事植物病害生物防治研究。E-mail：*通信作者 Correspondingauthor：秦世雯(1988)，女，贵州贵阳人，博士，副教授，主要从事植物病原物致病机制研究。E-mail：网络首发地址：https:/ oxysporum;Bacillus amyloli-quefaciens;biologicalcontrol多肉植物是一类营养器官肥厚的观赏植物，品种繁多，易栽培，深受全球消费者喜爱1。多肉植物是中国云南省“云花”产业的重要组成部分，截至 2021 年，云南多肉植物生产面积超 67hm2，产量超 3000 万盆2。景天科(Crassulaceae)拟石莲属(Echeveria)是近年来热门的多肉植物种类，具有莲花状桩型，品种繁多，叶色和花色美丽，被广泛应用于室内盆栽、城市绿化及园林景观中。黑腐病是多肉植物生产和家庭种植过程中的主要病害之一，在全球多肉种植地均有发生，给多肉植物产业造成了一定的损失3。该病引起多肉植物的水层组织和维管束组织腐烂和萎蔫，造成叶片出现透明水渍状病斑并脱落，茎部呈黑腐症状，最终导致植株枯萎死亡4。研究发现：拟石莲属黑腐病的病原菌为尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)，能够危害血色罗密欧(E.agavoidescv.Romeo)5、静夜(E.derenbergiicv.Purpus)6、彩虹(Echeveriacv.Rainbow)7、东云(E.agavoides)8和紫珍珠(Echeveriacv.PerlevonNrnberg)9等品种。尖孢镰刀菌作为全球防控难度最大的土传病原真菌之一，能够在无寄主的情况下长期存活于土壤中，而现有的化学药剂和农业防治手段无法将其根除3。多肉植物黑腐病的防治主要采取化学防治手段，由于多肉植物多用于家庭种植，对其化学药剂的毒性有较高要求。生物防治是使用生物拮抗剂(细菌、真菌等)，通过“以菌治菌”达到防病和促进寄主生长的目标10。生防菌剂具有绿色、环保、对人体安全等特点，是理想的多肉植物黑腐病防治手段。然而，多肉黑腐病的生物防治研究目前还处于空白。本研究从小粒野生稻(Oryza minuta)根部分离鉴定了 1 株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)OMR1-7 菌株，通过测定其拮抗效果、产铁载体和生物膜能力、定殖能力和温室防效，以期明确其对拟石莲属多肉品种血色罗密欧和静夜的生防效果，为多肉植物黑腐病的生物防治提供菌种资源。1 材料与方法1.1供试材料供试植物品种：小粒野生稻，由农业农村部多年生稻生物学与种质创新重点实验室提供；拟石莲属多肉植物血色罗密欧和静夜购于云南昆明一多肉植物商业大棚。供试病原菌：血色罗密欧黑腐病菌 F.oxys-porumKMEARM-25和静夜黑腐病菌 F.oxyspor-umKMJY66均由云南大学农学院植物病理学研究室鉴定和提供。供试载体：GFP 标记解淀粉芽孢杆菌 OMR1-7 菌株所用遗传转化载体 pGFP4412 由中国农业大学王埼教授惠赠。1.2生防细菌的分离采用组织分离法11，从健康的小粒野生稻上剪取根部组织，无菌水冲洗干净表面污渍后用滤纸吸干表面水分。根部组织经 75%酒精浸泡 5min、无菌水漂洗 1 次、2.5%次氯酸钠浸泡 3min、无菌水漂洗 3 次后，用无菌滤纸吸干表面水分。将根部组织放入无菌研钵中，加入适量无菌水，研第1期刘爽，等：解淀粉芽孢杆菌 OMR1-7 菌株对拟石莲花属多肉植物黑腐病的生防效果55磨后对研磨液进行梯度稀释，吸取组织液 100L涂布于 LB 固体培养基12上；同时吸取第 3 次漂洗液 100L 涂布于 LB 固体培养基，若无细菌生长表明根部表面已彻底消毒。将以上平板置于37黑暗培养 13d 直至有菌落长出，挑取形态不同的细菌菌落进行纯化和保藏。1.3生防菌株的鉴定1.3.1形态学鉴定将OMR1-7 菌株划线培养于LB 培养基，37培养 24h 后观察其单菌落形态，随后进行革兰氏染色并观察其菌体形态特征。1.3.2分子序列特征鉴定利用 TIANGEN 细菌基因组 DNA 提取试剂盒提取 OMR1-7 菌株的 DNA；利用 16SrDNA 引物27F(5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3)和1492-R(5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3)以及 gyrA 基因引物 gyrAF(5-CAGTCAGGAAATGCGTACGTC-CTT-3)和 gyrAR(5-CAAGGTAATGCTCCAGGC-ATTGCT-3)进行 PCR 扩增；扩增片段经电泳和测序检测后，在 NCBI 数据库进行 Blastn 比对分析，并提交至国家生物信息中心 Genbase 数据库(https:/ MEGA11.0软件以邻接法构建 16SrDNA 和 gyrA 系统发育树，Bootstrap 值设为 1000。1.4拮抗效果的测定1.4.1菌丝抑制率的测定采用平板对峙法，将 5mm2黑腐病菌 KMJ-Y6 和 KMEARM-2 菌块分别接种于 PDA 平板13中央，将 OMR1-7 菌株划线培养于 LB 固体培养基，37 培养 24h 后，挑取单菌落接种至 LB液体培养基，28、180r/min 振荡培养 12h，制成 1108CFU/mL 的菌悬液。将 OMR1-7 菌悬液划线接种于病原菌菌块两侧 2.5cm 处，设 3 次重复试验。以仅接种病原菌菌块的 PDA 平板为对照。将 PDA 平板置于 28 恒温培养箱中培养 6d，待对照组菌丝长满平板后，按公式计算OMR1-7 菌株对黑腐病菌的菌丝抑制率：抑制率=(对照菌落直径处理菌落直径)/对照菌落直径100%。1.4.2菌体抑制率的测定将 OMR1-7 菌悬液与融化、冷却至约 40 的PDA 培养基按体积比 110 混合，制成 OMR1-7毒板，将 5mm2黑腐病菌 KMJY6 和 KMEARM-2 菌块接入毒板中心，设 3 次重复试验。以 PDA平板为对照。将毒板和 PDA 平板置于 28 恒温培养 57d，然后计算 OMR1-7 菌株对黑腐病菌的菌体生长抑制率，计算公式同 1.4.1 节。1.5生防菌株产铁载体能力测定1.5.1产铁载体定性分析采用滤纸片法，将生防菌株接种于 CAS 培养基14上，28 倒置培养 23d 后观察是否有透明圈，以 LB 培养基为对照。透明圈和菌落圈直径的比值即为菌株产铁载体能力。1.5.2产铁载体定量分析取 OMR1-7 菌悬液 100L 接种于 1mLCAS培养液，28C、180r/min 振荡培养 48h，离心后取上清液 300L 置于 96 孔板中，每个处理 3 个重复，用酶标仪(MolecularDevicesSpectraMaxi3，中国)检测 630nm 处的吸光度值(As)；另取 LB培养基与 CAS 培养液等体积混匀，以其 630nm处的吸光度值(Ar)作为参比值，根据公式 SU=1As/Ar 计算菌株产铁载体的相对含量(SU)。1.6生防菌株产微生物膜能力的测定1.6.1产微生物膜定性分析将 OMR1-7 菌株接种于 LB 培养基培养 24h，离心后弃上清，用 MSgg 培养基15重悬菌体。在 24孔细胞培养板的培养孔中加入MSgg 培养基 2mL，然后加入OMR1-7 菌液 5L，设置 3 个重复，于37 静置培养 72h。以 MSgg 培养基中加入 LB培养基 5L 为对照，观察 OMR1-7 菌株的成膜情况。1.6.2产微生物膜定量分析将 OMR1-7 菌株接种于 LB 培养基，28、180r/min 培养 48h 取出，每组设 3 个重复。吸取取出后的菌液 4mL 室温静止培养 24h，弃培养液后用去离子水清洗，用 1%结晶紫染色 2min，弃结晶紫溶液，水洗、风干后用 1%结晶紫染色。吸出多余结晶紫，用蒸馏水漂洗，待风干后加入洗膜缓冲液16，振荡 1015min 后稀释 10倍，用紫外分光光度计(岛津UV2600，日本)测定 570nm 处的吸光度值。1.7GFP 标记 OMR1-7 菌株的构建将 OMR1-7 菌株接种于 30mLGM 液体培养基17中，28、180r/min 培养 16h 制成种子液。取种子液 1mL 接种于 100mLGM 液体培养基中，28、180r/min 培养至 600nm 处的吸光度56云南农业大学学报第39卷值为 0.7。取 GM 培养液 1mL加至灭菌的 1.5mL离心管中，冰浴 10min，4、8000r/min 离心10min，弃上清液。沉淀用 200L 预冷的 ETM18漂洗 2 次，制成 OMR1-7 菌株感受态细胞。取pGFP4412 质粒 1g 加至 100L 感受态细胞中，温和混合后置于电击杯；将电击杯放入 Gene-PulserXcell 电击仪(Bio-Rad，美国)进行电击(电压 1.8kV，电阻 200)，随后加入 RM 培养基191mL，并转移至灭菌的 1.5mL 离心管，28、200r/min 培养 4h；取 100L 涂布于 LB 固体培养基(含 100g/L 新霉素)，28 倒置培养 24h，待长出转化子后，挑取转化子单菌落进行 PCR 检测。检测引物为 gfp-F(5-GCCTCTAGAATGAG-TAAAGGAGAAGAACTTTTC-3)和 gfp-R(5-GC-CAAGCTTTTATTTGTATAGTTCATCCATGCC-3)。1.8OMR1-7 菌株在多肉植物体内定殖的观察采用灌根接种法，将 GFP 标记的 OMR1-7 菌株单菌落接种至 LB 液体培养基 28、180r/min振荡培养，制成 1108CFU/mL 的 OMR1-7-GFP菌悬液；取 25mL 分别接种于血色罗密欧和静夜植株，5d 后接种黑腐病菌孢子悬浮液 40mL。每个处理设置 10 株植株，重复 3 次。28d 后取多肉植物的根、茎和叶进行冷冻切片，置于激光共聚焦显微镜(OlympusFV3000，日本)下观察，激发光波长设置为 488nm，发射光波长为 510nm。1.9多肉黑腐病温室防效测定将黑腐病菌接种于 Bilais 培养基20中，28、180r/min 振荡培养 5d；用 4 层无菌纱布过滤菌丝，制备成密度为 1106mL1的孢子悬浮液。将OMR1-7 菌液接种于 LB 液体培养基中，28、180r/min 振荡培养 12h，制备成 1108CFU/mL 的OMR1-7 菌悬液。分别选取大小一致的健康多肉品种血色罗密欧和静夜，采用灌根接种法，设置以下 3 个处理：清水对照；接种黑腐病菌孢子悬浮液40mL；先接种 OMR1-7 菌液 25mL，5d 后接种黑腐病菌孢子悬浮液 40mL。每个处理接种植株 10 盆，每个处理重复 3 次。接种后的植株放置于温度为 25、湿度为 50%的温室中，每天观察黑腐病发病症状，28d 后统计发病率和生防效果。发病率=发病植株数/调查总株数100%；生防效果=(处理发病植株数处理发病植株数)/处理发病植株数100%。2 结果与分析2.1OMR1-7 菌株的鉴定OMR1-7 菌株在 LB 固体培养基培养 1d 后单菌落呈圆形，淡黄色，半透明，边缘整齐，突起形状平展，表面湿润且有黏稠感(图 1a)。革兰氏染色发现该菌为短杆状革兰氏阳性菌(图 1b)。分子序列鉴定发现：OMR1-7 菌株 16SrDNA 基因(GenBaseNo.：C_AA009084.1)与从栽培稻品种金刚 30 中分离的 Bacillus amyloliquefaciensLx-11菌株(GenBankNo.：HQ179100.1)相似性最高，为99.93%；OMR1-7 菌株 gyrA 基因(GenBaseNo.：C_AA016452.1)与从番茄根际土壤中分离的 B.am-yloliquefaciensRNB-92 菌株(GenBankNo.：LC09-6069.1)相似性最高，为 100.00%。通过构建 16SrDNA 和 gyrA 基因系统发育树(图 1c 和 1d)发现：OMR1-7 菌株与 B.amyloliquefaciens 聚在同一分支。结合形态学和分子序列鉴定结果可知：OM-R1-7 菌株鉴定为解淀粉芽孢杆菌(B.amylolique-faciens)。2.2OMR1-7 对多肉黑腐病原菌的抑制效果OMR1-7 菌株与血色罗密欧黑腐病原菌 KM-EARM-2 菌株、静夜黑腐病原菌 KMJY6 菌株之间均形成了明显的抑菌带(图 2a)，并且造成了黑腐病菌菌丝末端膨大(图 2b)。OMR1-7 菌株对KMEARM-2 和 KMJY6 菌株的菌丝生长抑制率分别为57.15%和74.29%(图2c)。KMEARM-2 和K-MJY6 菌株在 OMR1-7 菌株制成的毒板上生长受到抑制，OMR1-7 菌株对 2 个病原菌菌体抑制率分别为 84.82%和 86.15%(图 2d)，同时造成 2 个病原菌孢子产量减少(图 2e)。以上结果说明解淀粉芽孢杆菌 OMR1-7 菌株对血色罗密欧和静夜黑腐病菌的菌丝和孢子生长具有显著抑制效果，且造成病原菌侵染结构畸形。2.3OMR1-7 菌株产铁载体能力OMR1-7 在 CAS 培养基上其菌落周围形成了橙黄色透明圈(图 3)，且 OMR1-7 菌株产铁载体的透明圈和菌落圈直径的比值为 4.430.17。通过定量测定，OMR1-7 菌株产生铁载体的相对含量为 80.98%。以上结果说明该菌株具有较强的铁载体分泌能力，能够与植物病原真菌竞争铁元素进而抑制病原菌。第1期刘爽，等：解淀粉芽孢杆菌 OMR1-7 菌株对拟石莲花属多肉植物黑腐病的生防效果572.4OMR1-7 菌株产微生物膜能力OMR1-7 菌株在 MSgg 培养基中形成了密集褶皱的生物膜(图 4)。OMR1-7 菌株产生的生物膜在 570nm 处的吸光度值为 1.600.38，说明其具有较强的能力，有利于菌株适应环境以及提高在寄主中定殖和抗菌的活性。2.5OMR1-7 菌株在拟石莲花属多肉植物中的定殖OMR1-7-GFP 菌株能成功定殖于血色罗密欧和静夜的根、茎和叶部(图 5)。相较于叶部，OM-R1-7-GFP 菌株在寄主根部和茎部数量较多。说明 OMR1-7 菌株具有内生特性，占据了拟石莲属多肉植物体根、茎和叶内生态位，有效阻止了黑腐病菌的侵入和扩增。2.6OMR1-7 菌株对拟石莲花属黑腐病的生防效果接种黑腐病菌 28d 后，血色罗密欧和静夜植株叶部和茎部出现了黑腐症状(图 6ab)，发病率分别为 83.33%和 100.00%；而先接种 OMR1-7菌株 5d 后再接种病原菌的植株发病率分别为16.67%和 33.33%(图 6c)；OMR1-7 菌株对血色罗密欧和静夜黑腐病的盆栽防效分别达到 80.08%和 78.89%(图 6d)。说明解淀粉芽孢杆菌 OMR1-7 菌株对拟石莲属多肉植物黑腐病具有显著的生防效果。3 讨论解淀粉芽孢杆菌是目前应用最为广泛的生防细菌之一，具有广谱抗菌活性和较强的抗逆能力，能够促进多种植物生长21。解淀粉芽孢杆菌对尖孢镰刀菌(F.oxysporum)、灰葡萄孢(Botryt-is cinerea)、稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)、灰绿青霉(Penicillium glaucum)、叶霉病菌(Clado-sporium fulvum)等植物病原真菌具有显著的抑菌效果22-23。研究表明：解淀粉芽孢杆菌可产生抑菌次生代谢物(表面活性素、大环内酯 H、芽孢素、丰原素、地非西丁、杆菌溶素等)以及水解酶类(几丁质酶和蛋白酶)，抑制植物病原真菌的生长24-25。本研究发现：解淀粉芽孢杆菌 OMR1-7菌株与拟石莲属多肉植物黑腐病菌 F.oxys-porum 拮抗互作时，两者之间形成了明显的抑菌带，病原菌菌丝出现畸形且产孢量降低。说明OMR1-7 菌株能够产生抑菌物质影响拟石莲属多肉植物黑腐病菌侵染结构和无性繁殖体的形成，进而影响病原菌的侵入和扩繁。深入挖掘和鉴定a)b)c)5 mm5 m0.050.05100100100100418099951001009086d)Bacillus amyloliquefaciens strain Lx-11(HQ179100.1)Bacillus amyloliquefaciens strain GMU239(OP364987.1)Bacillus amyloliquefaciens strain QT-162(MT081100.1)Bacillus amyloliquefaciens strain JE7(MWO82822.1)Bacillus licheniformis strain J-41(OQ135133.1)Bacillus pumilus strain ES4(FJ032017.1)Bacillus altitudinis strain KA15(MK874318.1)Bacillus aerius strain S28(OP782620.1)Bacillus coagulans JC14(LC337958.1)Bacillus megaterium strain TA-4(MT007280.1)Clostridium sporogenes strain NIBE-V1(MH229531.1)Bacillus amyloliquefaciens strain OMR1-7(CAA016452.1)Bacillus amyloliquefaciens strain T144(JQ746589.1)Bacillus amyloliquefaciens strain SZMC 6161J(JX683905.1)Bacillus amyloliquefaciens strain RNB-92(LCO96069.1)Bacillus vallismortis strain HSB-2(MT703800.1)Bacillus siamensis strain WM13-1(MW647174.1)Bacillus subtilis strain 9407(KRO71875.1)Bacillus rugosus strain SPB7(MK473855.1)Bacillus spizizenii NRRL B-2304(LC657556.1)Bacillus licheniformis strain MY75(EUO73420.1)Pectobacterium zantedeschiae strain 9M(MH367224.1)Bacillus amyloliquefaciens strain OMR1-7(C_AA009084.1)注：a)LB 培养基上的菌落形态；b)革兰氏染色结果；c)16SrDNA 基因系统发育树；d)gyrA 基因系统发育树。Note:a)colonyofB.amyloliquefaciensOMR1-7onLBmedium;b)cellsofB.amyloliquefaciensOMR1-7basedonGramstaining;c)phylogenetictreefrom16SrDNAsequences;d)phylogenetictreefromgyrAgenes.图 1 解淀粉芽孢杆菌 OMR1-7 菌株的形态特征和分子序列系统发育树Fig.1MorphologicalcharacteristicandmolecularsequencephylogenetictreeofBacillus amyloliquefaciensOMR1-7strain58云南农业大学学报第39卷a)d)c)e)KMJY6OMR1-7+KMJY6OMR1-7毒板+KMJY6KMJY6OMR1-7+KMJY6KMEARM-2OMR1-7+KMEARM-250 m50 m50 m50 mOMR1-7毒板+KMEARM-2KMJY6KMEARM-2KMEARM-2OMR1-7+KMEARM-2b)*KMEARM-2+OMR1-7KMJY6+OMR1-7菌丝抑制率/%mycelial inhibition rates*020406080100020406080100KMEARM-2+OMR1-7KMJY6+OMR1-7菌体抑制率/%colony inhibition rates*00.40.81.21.6KMEARM-2OMR1-7+KMEARM-2KMJY6OMR1-7+KMJY6病原菌孢子数量 108 mL1number of pathogen spore注：a)OMR1-7 菌株对黑腐病菌 KMEARM-2 和 KMJY6 菌株的菌丝生长抑制效果以及菌体生长抑制效果；b)OMR1-7 菌株造成黑腐病菌KMEARM-2 和 KMJY6 菌株菌丝膨大畸形；c)e)“*”表示差异显著(P0.05)，“*”表示差异极显著(P0.01)，下同。Note:a)hyphalandcolonygrowthofFusariumoxysporumKMEARM-2andKMJY6wereinhibitedbyB.amyloliquefaciensOMR1-7;b)F.oxysporumKMEARM-2andKMJY6producedabnormalhyphaeduetotheantagonisticeffectofB.amyloliquefaciensOMR1-7;c)-e)“*”indicatesasignificantdiffer-ences(P0.05),“*”indicatesanextremelysignificantdifferences(P0.01),thesameasbelow.图 2 解淀粉芽孢杆菌 OMR1-7 菌株对拟石莲属多肉植物黑腐病菌的抑制效果Fig.2AntagonisticeffectsofB.amyloliquefaciensOMR1-7againstFusarium oxysporumcausingblackrotonEcheveriasucculentplantsCK4321注：CK.LB 培养基；14.OMR1-7 菌液。Note:CK.LBmedium;1-4.OMR1-7strains.图 3 解淀粉芽孢杆菌 OMR1-7 菌株在CAS 平板上的产铁载体情况Fig.3SiderophoreproducedbyB.amyloliquefaciensOMR1-7onCASplatesb)a)注：a)LB 培养基接种在 MSgg 液态培养基 72h 后的情况；b)OMR1-7 菌株接种在 MSgg 液态培养基 72h 后形成生物膜的情况。Note:a)LBmediumwasinoculatedinMsggliquidmediumafter72h;b)B.amyloliquefaciensOMR1-7producedbiofilmsinMsggliquidmediumafter72h.图 4 解淀粉芽孢杆菌 OMR1-7 菌株在Msgg 液态培养基中形成生物膜Fig.4BiofilmsproducedbyB.amyloliquefaciensOMR1-7inMsggliquidmedium第1期刘爽，等：解淀粉芽孢杆菌 OMR1-7 菌株对拟石莲花属多肉植物黑腐病的生防效果59OMR1-7 菌株的抗菌物质，有助于开发拟石莲属多肉植物黑腐病的生物农药。高产铁载体的生防细菌通过竞争土壤中的铁元素从而抑制植物病原菌的生长，促进寄主植物健康26。已有研究报道不同种的芽孢杆菌均具有高产铁载体特性27-29。黄瓜根际土壤中分离的 B.amyloliquefaciensB2 菌株能够产铁载体，抑制黄瓜枯萎病菌(F.oxysporumf.sp.cucumerinum)，促进轮作环境下的黄瓜生长30。本研究发现：OM-R1-7 菌株铁载体产量高达 80.98%，说明其与土传性拟石莲花属多肉植物黑腐病菌 F.oxyspor-um 拮抗互作时，具有强铁素竞争能力，能够有效抑制病原菌入侵。解淀粉芽孢杆菌寄主范围广泛，可稳定定殖于寄主植物根际、叶际和体内31。B.amylolique-faciensX5 和 BQA2 菌株在番茄根际有较强的定殖能力32；B.amyloliquefaciensJt84 菌株能够在水稻叶表长期有效定殖33；B.amyloliquefaciensCC09 菌株在小麦根内、根表和根际均能定殖，且不影响根组织细胞结构34。本研究从小粒野生稻中分离到的 B.amyloliquefaciensOMR1-7 菌株可在非寄主植物拟石莲属多肉植物的根、茎和叶部有效定殖。OMR1-7 菌株在拟石莲属多肉植物的根和茎部大量定殖，可有效阻止土传性黑腐病菌 F.oxysporum 从根部侵入，继而向维管束蔓延，说明 OMR1-7 菌株具有与黑腐病菌进行空间竞争的能力。此外，B.amyloliquefaciens 占据寄主植物根际生态位后，还能招募有益微生物群促进植物生长35。细菌生物膜是细菌群体聚集形成的膜状物，帮助其黏附寄主，提高环境适应性36。生物膜被认为是 B.amyloliquefaciens 在寄主环境定殖并与植物病原菌进行空间竞争的重要物质之一37-39，它还能在逆境条件下维持 B.amyloliquefaciens 的营养供给，减少逆境伤害40。本研究也发现：OM-R1-7 菌株能够产生生物膜，可以帮助其高效定殖于寄主，提高在土壤和寄主中长期存活的能力。解淀粉芽孢杆菌对多种植物真菌病害具有良好的生防潜力，目前研究报道该菌对 F.oxyspor-um 引起病害的生防效果可达 60%以上21。如：分离自土壤的 B.amyloliquefaciensB6 菌株对 F.ox-ysporumf.sp.lycopersicis 引起的番茄枯萎病防效为 64.35%41；B.amyloliquefaciensY-4 菌株对 F.oxysporumf.sp.cubense 引起的香蕉枯萎病防效为 67.9%42；B.amyloliquefaciensHD-5 菌株对 F.oxysporum 引起的草莓根腐病防效达 77.78%43；根部roots茎部stems200 m200 m200 m200 m200 m200 m叶部leaves图 5 解淀粉芽孢杆菌 OMR1-7 菌株在拟石莲属多肉植物血色罗密欧(上)和静夜(下)中的定殖Fig.5ColonizationofB.amyloliquefaciensOMR1-7inE.agavoidescv.Romeo(above)andE.derenbergiicv.Purpus(below)60云南农业大学学报第39卷喷施解淀粉芽孢杆菌微生物叶面肥悬浮剂对葡萄白粉病的防治效果达 65%以上44。本研究分离的 B.amyloliquefaciensOMR1-7 菌株对拟石莲属多肉植物黑腐病的生防效果为 78.89%80.08%，且该菌株对供试 2 种多肉植物黑腐病的生防效果无显著差异，但 OMR1-7 菌株在 PDA 培养基上对血色罗密欧黑腐病菌的抑菌效果却显著低于对静夜黑腐病菌的抑菌效果。这是由于生防细菌在植物体内的生防效果受自身定殖能力、寄主和环境等多重因素影响，因此体外抑菌防效和田间防效存在一定差异45-46。4 结论本研究首次对拟石莲花属多肉植物的生物防治进行了生防细菌挖掘，明确了解淀粉芽孢杆菌OMR1-7 菌株对拟石莲属多肉植物黑腐病的生防效果，研究结果将为多肉植物黑腐病的防控和生防药剂开发提供参考。b)H2OOMR1-7+KMJY6KMJY6KMEARM-2OMR1-7+KMEARM-2H2O静夜植株plant of ED静夜ED静夜叶片leaves of ED静夜根部roots of ED血色罗密欧植株plant of EA血色罗密欧叶片leaves of EA血色罗密欧根部roots of EA*050100150KMEARM-2OMR1-7+KMEARM-2KMJY6OMR1-7+KMJY6发病率/%incidence rates生防防效/%biocontrol efficiencya)b)c)020406080100血色罗密欧EA图 6 解淀粉芽孢杆菌 OMR1-7 菌株对拟石莲属多肉植物血色罗密欧和静夜黑腐病的生防效果Fig.6BiocontrolefficiencyofB.amyloliquefaciensOMR1-7againstblackrotdiseasesofE.agavoidescv.Romeo(EA)andE.derenbergiicv.Purpus(ED)第1期刘爽，等：解淀粉芽孢杆菌 OMR1-7 菌株对拟石莲花属多肉植物黑腐病的生防效果61参考文献胡莹冰,沈守云.多肉植物的景观应用及发展趋势J.广东农业科学,2013,40(12):46.DOI:10.16768/j.issn.1004-874x.2013.12.057.1刘磊.多肉还能再火十年吗?N/OL.中国花卉报,2023-04-20(2)2023-07-18.DOI:10.38297/ki.nzghh.2023.000168.2GULLINOML,DAUGHTREYML,GARIBALDIA,etal.Fusariumwiltsofornamentalcropsandtheirman-agementJ.CropProtection,2015,73:50.DOI:10.1016/j.cropro.2015.01.003.3KAMALI-SARVESTANIS,MOSTOWFIZADEH-GH-ALAMFARSAR,SALMANINEZHADF,etal.Fusari-um and Neocosmospora species associated with rot ofCactaceaeandothersucculentplantsJ.JournalofFu-ngi,2022,8(4):364.DOI:10.3390/jof8040364.4XUE Z F,JI M L,TIAN Q L,et al.First report ofFusarium 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