南蛇藤总萜抑制中性粒细胞胞外诱捕网形成的作用与机制研究.pdf

板学学报（农业202445(1)：7 5-8 3，13 8.引文格式：郭雅洁，朱森，刘延庆，南蛇藤总抑制中性粒细胞胞外诱捕网形成的作用与机制研究J.扬州大Jan.2024Journal of Yangzhou University(Agricultural and Life Science Edition)2024年1月Vol.45 No.1第45卷第1期扬州大学学报（农业与生命科学版）DOI:10.16872/ki.1671-4652.2024.01.010南蛇藤总枯抑制中性粒细胞胞外诱捕网形成的作用与机制研究郭雅洁，朱淼，刘延庆，陶丽*（扬州大学医学院国家中医药管理局胃癌毒邪重点论治研究室，江苏扬州2 2 50 0 9）摘要：为探索南蛇藤总（thetotal terpenoids of Celastrus orbiculatusThunb.，T T C)对中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophilextracellulartraps，NET s）形成及其作用机制，通过分离与制备中性粒细胞，建立佛波酯（phorbol12-myristate13-acetate，PM A)诱导的NETs形成细胞模型。利用瑞氏-姬姆萨染色、扫描电镜与免疫荧光技术研究南蛇藤总枯对NETs形成及其生物学标志的影响，并利用AnnexinV/PI试验研究南蛇藤总对中性粒细胞调亡的影响。结果表明：南蛇藤总枯能剂量依赖性地抑制PMA诱导的NETs形成；南蛇藤总（8 0 gmL-1）可阻断中性粒细胞弹性蛋白酶（n e u t r o p h i l e l a s t a s e，NE)的释放，并破坏NETs相关DNA-NE复合物的形成；南蛇藤总（8 0 gmL-1）可显著抑制PMA诱导的瓜氨酸化组蛋白H3（c i t r u lli n a t e d h i s t o n e H 3，C i t H 3）的表达水平；南蛇藤总可剂量依赖性地促进中性粒细胞调亡。综上，南蛇藤总对中性粒细胞NETs的形成具有抑制作用，其机制可能与其直接诱导中性粒细胞调亡有关。关键词：南蛇藤总；中性粒细胞胞外诱捕网；调亡；中性粒细胞弹性蛋白酶；瓜氨酸化组蛋白H3中图分类号：S853.7；R 2 8 5.5文献标志码：A文章编号：16 7 1-46 52（2 0 2 4)0 1-0 0 7 5-0 9The effect and mechanism of the total terpenoids of Celastrus orbiculatusThunb.on inhibiting the formation of neutrophil extracellular trapsGUO Yajie,ZHU Miao,LIU Yanqing,TAO Li(Key Laboratory of the Toric Pathogens-Based Thera peutic Approaches of Gastric Cancer,State Administration ofTraditional Chinese Medicine/College of Medicine,Yangzhou University,Yangzhou 225009,China)ABSTRACT:To investigate the mechanisms and the effect of the total terpenoids of Celastrus orbiculatus Thunb.(TTC)on NETs,the cell model of NETs formation induced by phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA)was established by isola-ting and preparing neutrophils.The effects of TTC on the formation of NETs and their biological markers were studied byWright-Giemsa Staining,scanning electron microscope and immunofluorescence.The Annexin V/PI experiment was usedto study TTC on neutrophil apoptosis.Results showed that TTC could dose-dependently inhibit the formation of NETsinduced by PMA;TTC(80 g mL-)could block the release of neutrophil elastase(NE)and disrupt the formation ofNets associated DNA-NE complexes.TTC（8 0 g mL-)significantly inhibited PMA-induced CitH3 expression;TTCcan promote neutrophil apoptosis in a dose-dependent manner.This study suggests that TTC can inhibit the formation ofneutrophil NETs,and its mechanism may be related to its direct induction of neutrophil apoptosis.KEY WORDS:Celastrus orbiculatus Thunb.;neutrophil extracellular traps;apoptosis;neutrophil elastase;citrullinatedhistone H3中药南蛇藤是卫矛科南蛇藤属植物南蛇藤（Celastrus orbiculatusThunb.）的干燥藤茎，又名过山凡，在抗肿瘤、抗炎和自身免疫性疾病等方面显现出巨大的潜力1-2 。本课题组3-41 长期对南蛇藤抗消化收稿日期：2 0 2 3-0 7-0 9基金项目：国家自然科学基金资助项目（8 18 0 37 8 2）作者简介：郭雅洁（1998 一），女，山西长治人，扬州大学硕士研究生，主要从事中药抗肿瘤药理研究。*通信作者，陶丽，州大学副教授、硕导，主要从事中药抗肿瘤药理研究；E-mail：i ml i t a o y z u.e d u.c n。76第45卷扬州大学学报（农业生命科学版）道肿瘤及其转移的药效物质进行了系统研究3-4，从南蛇藤乙酸乙酯萃取物中提取出松香烷型、贝壳杉烷型二/降二、齐墩果烷型与羽扇豆烷型五环三等2 0 余种类成分，称为南蛇藤总。中性粒细胞作为肿瘤微环境中的重要组成因子，在肿瘤的演进中起着重要的调节作用。中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellulartraps，NET s)形成作为近年来被发现的一种新型中性粒细胞死亡方式，已被证明在众多疾病中发挥着重要作用5-7 。NETs是中性粒细胞染色质释放到胞外的网状超微结构，由解聚的染色质和细胞内颗粒蛋白组成，主要包括髓过氧化物酶（myeloperoxidase，M PO）、中性粒细胞弹性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）和肽酰基精氨酸脱亚氨酶4（protein arginine deiminasetype IV,PAD4)等s8本研究通过建立佛波酯（phorbol12-myristate 13-acetate，PM A)诱导的NETs构建细胞模型，研究南蛇藤总体外对NETs形成的影响及其分子机制，以期为南蛇藤的药理药效研究提供新的研究依据。1材料与方法1.1供试细胞人早幼粒细胞白血病细胞株HL-60购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库（货号为TCHu23）。细胞接种于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，置于37、5%CO,恒温培养箱中培养。1.2药品与试剂南蛇藤（广州至信中药饮片公司）；甲醇（分析纯，国药集团化学试剂公司，货号为6 7-56-1）；乙醇（分析纯，国药集团化学试剂公司，货号为6 4-17-5）；冰乙酸（分析纯，国药集团化学试剂公司，货号为64-19-7）；R PM I-16 40 培养基（中国维森特生物技术公司，货号为350-0 0 6-CL）；胎牛血清（美国Gibco-Invitrogen公司，货号为10 2 7 0 10 6）；小鼠外周血中性粒细胞分离液试剂盒（北京索莱宝生物科技公司，货号为P9201）；全反式维甲酸（ATRA，上海源叶生物科技公司，货号为S30976）；佛波酯（PMA，上海碧云天生物科技公司，货号为S1819）；D Na s e I（中国赛默飞世尔科技公司，货号为90 0 8 3）；奥沙利铂（O x a l i p l a t i n，美国Sigma-Aldrich公司，货号为O9512）；0.4%锥虫蓝染色液（美国Gibco-Invitrogen公司，货号为152 50 0 6 1）；瑞氏-姬姆萨快速染液（北京索莱宝生物科技公司，货号为G1020）；CD 11b-A PC（英国Abcam公司，货号为ab239292）；CD 13-FIT C（英国Abcam公司，货号为ab34722）；鼠抗人NE单克隆抗体（美国SantaCruzBiotechnology公司，货号为SC55549）；山羊抗鼠AlexaFluorTMPlus488荧光二抗（中国赛默飞世尔科技公司，货号为A32723）；瓜氨酸化组蛋白H3或CitH3（R 2 十R8十R17，英国Abcam公司，货号为ab281584）；组蛋白H3（英国Abcam公司，货号为ab1791）；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH，英国Abcam公司，货号为ab8245）；抗兔/鼠IgGs（美国Proteintech公司，货号为SA00001-2/SA00001-1）；A n n e x i n V-FI T C细胞调亡检测试剂盒（美国Proteintech公司，货号为PF00005)。1.3主要仪器COz恒温培养箱（Heracell150i型，美国ThermoScientific公司）；流式细胞仪（LSRFortessa型，美国BD公司）；场发射扫描电镜（GeminiSEM300型，德国CarlZeiss公司）；双光子激光共聚焦显微镜（LSM880NLO型，德国CarlZeiss公司）；生物显微镜（U-HGLGPS型，日本Olympus公司）；凝胶成像系统（ChemiDocXRS型，美国Bio-Rad公司）。1.4试验方法1.4.1南蛇藤总制备南蛇藤购于广州至信中药饮片公司，经中国药科大学生药学系秦民坚教授鉴定为卫矛科南蛇藤属植物南蛇藤（CelastrusorbiculatusThunb.）的干燥藤茎。取10 kg南蛇藤药材，超微粉碎后加入10 倍量的90%乙醇浸泡。乙醇热回流提取后减压回收得浸膏，加水混悬后依次采用石油醚、乙酸乙酯萃取。分离乙酸乙酯层，加2 0%乙醇洗涤，将乙酸乙酯层减压浓缩干燥，获得南蛇藤总提取物。该制备工艺已授权发明专利，专利号为2 0 0 7 10 0 2 5343.39。总类化合物含量以3-乙酰基齐墩果酸表示，在3次独立批次中均占总提取物的6 0%以上。采用硅胶柱层析、Alltech6000蒸发光散射检测器和半制备型高效液相色谱进行分离纯化。南蛇藤化学成分的分子结构采用质谱（TripleTOFTM5600型，美国ABSCI-77郭雅洁等：南蛇藤总抑制中性粒细胞胞外诱捕网形成的作用与机制研究第1期EX公司）与 H-13C核磁共振谱（ASR-500型，瑞士Bruker公司）分析。将干燥的南蛇藤总粉末用少量二甲基亚砜（DMSO)完全溶解至10 0 mgmL-1作为母液使用。1.4.2小鼠外周血中性粒细胞分离取10 只左右的6 8 周龄的雄性C57BL/6小鼠，经心脏采血将新鲜血液收集至含乙二胺四乙酸(EDTA)的抗凝管中。使用小鼠外周血中性粒细胞分离液试剂盒，采用密度梯度离心获得小鼠外周血中性粒细胞。锥虫蓝染色检测细胞活性在95%以上，瑞氏-姬姆萨染色鉴定中性粒细胞形态与纯度在90%以上，即用于后续试验。1.4.3ATRA诱导的HL-60中性粒细胞样细胞制备与鉴定取对数生长的HL-60细胞，按110 5cfumL-1接种于10 cm培养皿中，加人10 molL-的ATRA或等体积DMSO作为对照，诱导HL-60定向分化5d。于诱导分化第0、1、2、3、4、5天收集细胞。取少量细胞用0.4%锥虫蓝染色，观察每天的细胞活力。制备细胞涂片，用瑞氏-姬姆萨染液进行细胞染色，显微镜下观察并记录细胞核的形态变化，统计分化率。收集ATRA分化5d的HL-60细胞，加人荧光标记的中性粒细胞特异标志物CD11b、白细胞抗原CD45与急性髓系白血病特异标志物CD13抗体，室温避光孵育30 min后采用流式细胞仪检测表面标记物的表达水平，即分化的HL-60中性粒细胞样细胞（differentiated HL-60，d H L-6 0)。1.4.4PMA诱导的中性粒细胞NETs形成模型与药物评价1）NET s 形态的染色与分析：制备小鼠外周血中性粒细胞与中性粒细胞样dHL-60细胞，加人PMA（2 0 0 n g mL-1）孵育4h后，制备细胞涂片后进行瑞氏-姬姆萨染色。在10 0 0 倍镜下拍照并对NETs的释放程度进行观察与统计。NETs形成率（%）为释放NETs的细胞占视野中所有细胞的百分比。药物干预试验中，将阳性药DNaseI（10 0 U)与不同浓度的南蛇藤总（2 0、40、8 0 gmL-1)加入小鼠外周血中性粒细胞与中性粒细胞样dHL-60细胞预先处理2 h，再采用PMA诱导4h以刺激NETs形成，相对于PMA刺激组，计算给药组NETs形成抑制率（%）。2）扫描电镜观察NETs形态：制备dHL-60细胞爬片，接种密度为1X10cfumL-1，加入PMA（2 0 0 n g mL-1）或/与南蛇藤总（8 0 gmL-1）。弃去上清，PBS轻轻洗涤2 次，每孔加1mL2.5%戊二醛避光固定1h，双蒸水冲洗3次，依次采用30%、50%、7 0%、95%乙醇梯度脱水后临界点干燥，扫描电镜观察并拍照。3）免疫荧光染色观察NETs标记物：制备dHL-60细胞爬片，接种密度为110 cfumL-1，加人PMA（2 0 0 n g mL-1)）或/与南蛇藤总粘（8 0 gmL-）。弃去上清，PBS轻轻洗涤2 次，加人预冷的丙酮固定15min；PBS洗涤2 次，加人0.3%TritonX-100透化5min后加人5%BSA/PBS室温下封闭2 h；PBS洗涤2 次，加人中性粒弹性蛋白酶抗体（1：10 0)于4孵育过夜，PBS洗涤2 次后加人荧光二抗（1：2 0 0）室温孵育2 h；PBS洗涤2 次，用Hoechst33342进行核酸染色；封片，在6 30 倍镜下拍照并对NE-DNA复合物水平进行观察与统计。1.4.5蛋白质免疫印迹试验检测瓜氨酸化组蛋白H3将接种于直径10 cm培养皿的dHL-60细胞用不同浓度的南蛇藤总（2 0、40、8 0 gmL-1）预处理2 h，加人PMA（2 0 0 n g mL-1）刺激4h，离心收集细胞制备全细胞裂解。蛋白质定量后，以每个泳道2 5g的蛋白质样品，0.0 4A恒流电泳2 h并10 0 V恒压湿法转膜1.5h。PVD F膜室温封闭1h，洗涤后加入CitH3一抗，4孵育过夜。回收一抗再次洗膜后，加入鼠/兔二抗（1：10 0 0 0），室温孵育2 h。继续TBST洗膜，加入ECL发光液后对目的条带进行成像4.6AnnexinV-FITC双染检测中性粒细胞凋亡收集小鼠外周血中性粒细胞，加人不同浓度（0、2 0、40、8 0 gmL-1)南蛇藤总枯和阳性药奥沙利铂（10 gml-）处理48 h，收集每孔细胞后，AnnexinV结合缓冲液重悬。依次加人5l.CL488-Annexin和5uLPI探针，室温避光孵育15min，流式细胞仪检测细胞调亡水平。1.5数据处理与统计分析数据以土SD表示。所有试验至少独立重复3次。统计分析NETs形成率和细胞调亡率时，组间比较采用Student/检验或单因素方差分析（one-wayANOVA)与事后Dunnett 检验；统计分析药物干78第45卷扬州大学学生命科学版）预后蛋白质相对表达或NETs形成相对抑制率时，组间比较采用非参数Kruskal-WallisH与事后Dun-nett检验；以P0.05表示有显著统计学意义，P0.01或P0.001表示有极显著统计学意义。采用GraphPadPrism9.5软件分析绘图。2结果与分析2.1南蛇藤总枯主要化学成分结构及含量从南蛇藤茎中提取、制备、富集出含多种类化合物成分的南蛇藤总，核磁共振和质谱数据表明至少含有2 0 种类化合物，主要包括松香烷型、贝壳杉烷型二/降二及齐墩果烷型与羽扇豆烷型五环三枯（图1）2000A160012008004000510152025303540时间time/minOHCOOHBHOOHOCHOHOHCOOHFCOOH0YOHOHOHOHHC20H28:03C20H2:0C2iH3004C20H2:02C:0H460,C30Ha6O4C:0H460,Triptobenzene A Triptobenzene MTriptonediolTriptonoterpene 28-Hydroxy-3-oxo-olean Hederagonic acidHederagonic acid(3.2 mg)(2.0 mg)(4.2 mg)(2.1 mg)-12-en-29-oic acid(4.3 mg)(2.5 mg)(3.0 mg)HOOHCOOHCOOH0OHHHOC20H2603Ci9Hz6:02C21H2604C22H:34O2C30H4s03C30H6O;C:H4O:Triptobenzene N Nortriptonoterpene Nortriptophenolide Ent-Kaur-15 en 3-Oleanolic acid3-Ketooleanolic acidWilforlideB(3.8 mg)(1.7 mg)(2.3 mg)-19-ol acetate(7.6 mg)(1.9 mg)(2.3 mg)(4.7 mg)0FCOOHTCOOHYH00HOC20H2:02C20H2:02C2Ha,O2C20H2:O2C3oH4sO:C30H:O;Ent-Kaur-16-enEnt-Kaur-15-enEnt-Kaur-16-en Doianoterpene A 3-Oleanolic acidBetulonlic acid-19.20-olide-19.20-olide-19ol acetate(5.6 mg)(2.7 mg)(3.4 mg)(3.0 mg)(5.6 mg)(4.7 mg)图1南蛇藤总枯主要化学成分结构及含量Fig.1Structure and content of TTCA.高压液相色谱分析采用Waterse2695系统、AlltechELSD6000检测器，梯度洗脱由溶剂A（乙睛）和溶剂B（水：0.3%甲酸）组成；B.南蛇藤总成分的化学结构（1-2 0），包括化学名称、分子式和结构式。A.The high-pressured liquid chromatography analysis was conducted with Waters e2695 system equipped with Alltech ELSD 6000detector;the gradient elution was composed of solvent A(acetonitrile)and solvent B(water:O.3%formic acid);B.Chemical structures(1-20)of TTC constituents,which were classified into three groups.The information on chemi-cal name,molecular formulas and the amount of each substance was shown in the table.2.2南蛇藤总抑制PMA诱导的小鼠外周血中性粒细胞NETs形成研究10-12 表明，中性粒细胞可由多种信号途径活化释放NETs，其中最经典的是NADPH氧化酶依赖的NOX（NA D PH o x i d a s e)信号途径。为研究南蛇藤总对中性粒细胞NETs形成的影响，试验分离小鼠外周血中性粒细胞建立了PMA诱导的NETs形成的模型。瑞氏-姬姆萨染色结果显示，小鼠79第1期郭雅洁等：南蛇藤总抑制中性粒细胞胞外诱捕网形成的作用与机制研究外周血中性粒细胞的细胞核呈分叶状且有核丝相连，PMA（2 0 0 n g mL-1）刺激4h后，细胞核出现核肿胀与去分叶化现象，并出现典型的细胞外DNA纤维网状结构。DNaseI是一种脱氧核糖核酸酶，可催化DNA降解从而发挥NETs清除作用，本研究将DNaseI作为阳性对照处理。与此相比，南蛇藤总可部分逆转PMA诱导的胞外DNA释放及其网状结构形成，并缓解细胞核的肿胀程度（图2.A）。对NETs形成的定量统计结果显示，PMA（2 0 0 n g mL-1）引起93.0%的中性粒细胞发生NETs，阳性药DNaseI处理可降解NETs结构，清除率为58.4%，而南蛇藤总枯可剂量依赖性抑制PMA诱导的NETs形成，2 0、40、8 0 gmL-1剂量的抑制率分别为11.4%、36.2%、45.7%，其中高剂量南蛇藤总处理表现出极显著的统计学差异（图2.B）。这表明南蛇藤总可有效逆转PMA诱导的NETs形成。B*A100807*%率SN%/率呼SAN8060王*6040中CKPMA200PMA+DNaseI(10040T1J SLAN2020000200DNaseI 0 20 40 80PMA/ng mL-1TTC/gmL-1PMA+TTC(20 gmL-).PMA+TTC(40g*mLPMA+TTC(80gmL-)图2 南蛇藤总枯对小鼠外周血中性粒细胞NETs形成的影响Fig.2Effect of TTC on neutrophil NETs formation in peripheral blood of mouseA.瑞氏-姬姆萨染色观察PMA诱导的小鼠原代中性粒细胞NETs形态与南蛇藤总的干预作用，放大倍镜10 0 0，标尺20m。B.PM A 诱导的NETs形成率、南蛇藤总菇（2 0、40、8 0 gmL-1)与阳性药DNaseI（10 0 U)对PMA（2 0 0 n g mL-1)诱导的NETs形成的抑制率，组间比较非参数Kruskal-WallisH与事后Dunnett检验；*P0.01，*P 0.0 0 1。A.T h emorphology of primary neutrophil NETs induced by PMA in mouse and the intervention effect of TTC were observed byWright-Giemsa Staining,magnification 1 000 X,scale 20 m。B.T h e f o r ma t i o n r a t e o f PM A-i n d u c e d NET s t h e i n h i b i t i o nrates of TTC(20,40,80 g mL-1)and positive drug DNase I(100 U)on PMA(200 ng:ml-1)-induced NETs forma-tion;*Po.01,*P0.001.2.3ATRA诱导的中日性粒细胞样dHL-60细胞的制备与鉴定由图3.A可知，HL-60细胞最初表现嗜中性早幼粒细胞形态（promyelocytes），在ATRA诱导分化的不同时期依次表现为中幼粒细胞（myelocytes）、晚幼粒细胞（metamyelocytes）、杆状幼粒细胞（b a n d s）和分叶核细胞（segmented neutrophils)13)。形态学上，ATRA诱导分化的HL-60细胞核核质比缩小，出现凹陷与分叶，且杆状核、分叶核粒细胞明显增多。分化第3、4、5天时分化率分别为25.5%、6 5.2%、7 6.5%。CD11b（整合素M)是一种全髓系白细胞特异的表面跨膜蛋白，在成熟的中性粒细胞中表达较高。有研究13表明，ATRA在诱导HL-60分化的过程中出现CD11b表达水平升高，因此CD11b可作为早幼粒细胞分化的标志。CD45为白细胞共同抗原，而CD13在急性早幼粒细胞白血病细胞中过度表达14。因此作者选择在CD45+CD13+中分析ATRA诱导的CD11b表达变化。流式细胞仪检测结果显示，分化5d时dHL-60细胞与未分化的HL-60细胞相比，CD11b的阳性表达率由1.95%提高至89.4%，表明HL-60细胞被成功诱导分化为dHL-60粒细胞样细胞（图3.B）。因此，本课题组从细胞核形态学与免疫学指标确定dHL-60细胞为中性粒样细胞，故以dHL-60作为中性粒细胞模型研究南蛇藤对NETs形成的影响。2.4南蛇藤总枯抑制PMA诱导的dHL-60细胞的NETs形成在成功制备分化中性粒细胞样dHL-60细胞的基础上，采用PMA诱导的NETs形成模型与瑞氏-姬姆萨染色，获得了与原代中性粒细胞一致的结果。PMA（2 0 0 n g ml-1）刺激4h后，镜下观察到细胞核与胞浆混为一团，胞外可见大量DNA网状纤维结构包裹，NETs诱导率为8 3.3%（图4.A1）。阳性药DNaseI处理可降解NETs结构，清除率为53.1%，而南蛇藤总可剂量依赖性抑制dHIL-60细胞的NETs形成，2 0、40、8 0 gmL-剂量处理抑制率分别为10.5%、35.0%、44.4%，其中高剂量南80第45卷扬州大学学生命科学版）Apromyeloytesday 0day 2myelocytesmetamyelocytesbandsseqmented neutrophils0P/ow！回1day 3day 4day 52345H0255075100 125细胞比例cellproportion/%B81078107Q2-ULQ2-URQ2-ULQ2-UR610661060%1.95%0.01%9OIX/OSS89.4%9OTX/OSS4105410%21012101F0.02%98.0%0.02%10.6%Q2-LLQ2-LRQ2-LLQ2-LR01030103103104105106107103104105106107103101105106 107103104 105106107CD45.PC5.5CD13.FITCCD45.PC5.5CD13.FITCControl-HL-60ATRA-dHL-60图3ATRA诱导的中性粒细胞样dHL-60细胞鉴定Fig.3Identification of ATRA-induced neutrophil-like dHL-60 cellsA.瑞氏-姬姆萨染色观察ATRA诱导的HI-60细胞向中性粒细胞分化的细胞形态，放大倍镜10 0 0 X，标尺2 0 m：柱状图表示ATRA诱导的HL-60细胞逐渐向不同阶段中性粒细胞分化谱系的细胞比例。B.流式细胞仪检测成熟中性粒细胞表面标记物 CD11b 的表达。A.The morphology of ATRA-induced differentiation of HI-60 cells into neutrophils was observed with Wright-Gi-emsa Staining,magnification 1 000X,scale 20 m;The histogram shows the proportion of ATRA-induced HI-60 cells gradually differ-entiated into different stages of neutrophil lineages.B.The expression of CDllb on the surface of mature neutrophils was detected byflow cvtometry.蛇藤总（8 0 gmL-1)处理表现出极显著的统计学差异。这表明南蛇藤总可有效逆转PMA诱导的中性粒细胞样dHL-60细胞的NETs形成（图4.A2）。由图4.B可知，在高分辨率扫描电镜下，PMA刺激下dHIL-60细胞核趋于扁平，并释放长短和粗细不均的DNA纤维并组成网状结构，南蛇藤总（8 0 gmL-）不仅可缩短DNA纤维长度，还可减少DNA丝状骨架的数量与密度。NETs由解聚的染色质和释放的颗粒蛋白组成，利用激光共聚焦定型观察中性粒细胞弹性蛋白酶NE和释放到胞外DNA纤维的共定位。由图4.C可知，在未刺激条件下，NE在dHL-60的细胞胞浆中表达，细胞核为典型分叶核；在PMA刺激后，出现细胞核肿胀、去分叶及丝状DNA释放，NE也结合到胞外染色质中，形成NE-DNA复合体；而南蛇藤总（8 0 gmL-)处理不仅可逆转胞外DNA的释放，还可抑制NE-DNA复合体的形成。这从形态学和免疫学双重角度进一步证明南蛇藤总可抑制PMA诱导的dHL-60细胞的NETs形成。2.5南蛇藤总枯抑制NETs标志物组蛋白H3的瓜氨酸化在NETs形成过程中，瓜氨酸化组蛋白（CitH3）对染色质解聚和胞外DNA释放发挥着重要作用，检测CitH3已成为公认的NETs形成的金标准。瓜氨酸化修饰位点通常位于组蛋白H3的R2、R 8 和R17等精氨酸残基中15。为进一步确认南蛇藤总对NETs形成的抑制作用，采用识别组蛋白H3精氨酸R2、R 8 与R17位点的瓜氨酸化组蛋白H3抗体，研究南蛇藤总对组蛋白H3瓜氨酸化水平的影响，结果表明，南蛇藤总（2 0、40、8 0 gml-1）可剂量依赖性地抑制PMA诱导的CitH3表达水平，其中高剂量组（8 0 gml-）)与PMA刺激组相比具有显著统计学意义。此外，南蛇藤总对PMA诱导的总的组蛋白H3表达水平无显著影响（图5）。这表明南蛇藤总可能通过减少NETs标志物组蛋白H3的瓜氨酸化而抑制NETs形成。2.6南蛇藤总促进中性粒细胞凋亡采用AnnexinV/PI双染色方法进一步检测了南蛇藤总对中性粒细胞样dHL-60细胞调亡的影响，81郭雅洁等：南蛇藤总抑制中性粒细胞胞外诱捕网形成的作用与机制研究第1期A1BCKPMA(200 ngmL-)PMA+DNase(100U)PMA+TTC(20 g*mL-)PMA+TTC(40 gmL-)PMA+TTC(80 gmL-)DNANEMergeCA2100*80*80%/率SIEN%/率SIAN60*604040VWd202000200DNaseI 0204080PMA/ng mL-1TTC/ngmL-1图4南蛇藤总枯对中性粒样dHL-60细胞NETs形成的影响Fig.4Effect of TTC on NETs formation in neutrogranular dHL-60 cellsA1.瑞氏-姬姆萨染色观察PMA诱导的dHL-60细胞NETs形态与南蛇藤总的干预作用，放大倍镜10 0 0，标尺20m；A 2.南蛇藤总（2 0、40、8 0 gml-1）与阳性药DNaseI（10 0 U)对PMA（2 0 0 n g ml-1)诱导的NETs形成的抑制率，*P0.01，*P 0.0 0 1；B.扫描电镜观察PMA诱导的dHL-60细胞NETs形态与高剂量南蛇藤总（8 0 gmL-1)干预的影响，放大倍镜90 0，标尺10 m；C.免疫荧光染色与激光共聚焦显微镜观察胞外DNA（蓝色）与NE（绿色）的共定位，放大倍镜6 30 oX，标尺50 m。A 1.T h e e f f e c t o f T T Co n t h e m o r p h o l o g y o fNETs induced by PMA and TTC in dHL-60 cells was observed by Wright-Giemsa Staining,magnification 1 000 X,scale 20 m;A2.Inhibition rate of TTC(20,40,80 g:ml-1)and positive drug DNase I(100 U)on PMA(200 ng:ml-1)-induced NETs formation,*P0.01,*P0.001;B.The morphology of dHL-60 cell NETs induced byPMA and the effects of high dose TTC(80 g mL-1)were observed by scanning electron microscopy,magnification9ooX,scale 10 m;C.The co-localization of extracellular DNA(blue)and NE(green)was observed by immunofluorescence staining and confocal laser microscopy,magnification 630 X,scale 50 m.6*4PMA(200 ngmL-1)+3TTC/ugamL-1002040804HAdV3/CHCitH3(R2+R8+R17)22histone H31GAPDH00CKPMA204080CKPMA20 4080TTC/ugmL-1TTC/ugmL-1图5南南蛇藤总枯对dHL-60细胞瓜氨酸化组蛋白H3表达水平的影响Fig.5Effect of TTC on expression level of citrullinated histone H3 in dHL-60 cells采用蛋白质免疫印迹分析CitH3（R 2+R 8+R 17）、组蛋白H3（H 3）的表达水平，GAPDH为上样量参照；*P0.05。T h e e x p r e s s i o n l e v e l s o f Ci t H 3(R 2+R 8+R 17)a n d h i s t o n e H 3(H 3)w e r e a n a l y z e d b y W e s t e r n b l o t t i n gwith GAPDH as reference:?P0.05.结果表明，南蛇藤总粘剂量依赖性地显著加速dHL-60细胞调亡比例，在2 0、40、8 0 gmL-1剂量下诱导的dHL-60细胞凋亡率分别为14%、2 1.9%、41.4%，阳性药奥沙利铂（10 gml)剂量诱导的凋亡率为82第45卷扬州大学学报（农业与生命科学版）28.9%（图6）。这表明南蛇藤总对中性粒细胞调亡具有促进作用。unstainedFITC+/PI-FITC-/PI+FITC+/PI+1050%0%0%0%9.3%0.1%0.3%4.4%104Q1Q2Q1Q2Q1Q2Q1Q250*%/sisode率103*Q4Q303Q4Q3Q440102995%0.5%87904%0.3%910%4.3%10210310410510210310410510210310410510210310410530*oxaliplatinTTC(20g:mL-1)TTC(40g:mL-)TTC(80g:mL-1)*201054.7%8.9%15.0%12.3%18.3