利用大孔吸附树脂纯化东北刺人参不定根多糖的研究.pdf

第4 5卷 第3期2 0 2 3年9月 延 边 大 学 农 学 学 报A g r i c u l t u r a lS c i e n c eJ o u r n a l o fY a n b i a nU n i v e r s i t y V o l.4 5 N o.3 S e p.2 0 2 3收稿日期:2 0 2 3-0 7-3 0 基金项目:国家自然科学基金(8 1 9 6 0 6 8 5)作者简介:张宏妍(2 0 0 0),女,吉林白城人,硕士研究生,研究方向为植物组织培养及生物反应器应用。通信作者:廉美兰(1 9 6 3),女(朝鲜族),吉林龙井人,教授,博士,E-m a i l:m l l i a n y b u.e d u.c n文章编号:1 0 0 4-7 9 9 9(2 0 2 3)0 3-0 0 0 9-0 9 D O I:1 0.1 3 4 7 8/j.c n k i.j a s y u.2 0 2 3.0 3.0 0 2利用大孔吸附树脂纯化东北刺人参不定根多糖的研究张宏妍,李晗熙,国宇晴,白鈴泓,廉美兰*(延边大学 农学院,吉林 延吉1 3 3 0 0 2)摘要:为了提高东北刺人参不定根的利用率,该研究从乙醇提取后的不定根残渣提取多糖后,利用大孔吸附树脂采用单因素和响应面试验对多糖纯化工艺进行了优化。结果表明:大孔吸附树脂种类、进样质量浓度、进样体积、进样流速、洗脱剂的质量浓度与体积、洗脱流速等因素对多糖纯化有很大影响,与其他树脂种类相比,A B-8树脂利于多糖吸附和解析。单因素实验结果表明:最佳进样质量浓度为0.8m g/m L,进样体积为2B V,进样流速为2B V/h,洗脱剂浓度为2 0%,洗脱剂体积为2.5B V,洗脱流速为2B V/h。4因素(进样质量浓度、进样体积、洗脱剂浓度和洗脱剂体积)3水平 的 响应 面实 验结 果 表明:优化 的纯 化工 艺 为进 样质 量 浓度0.9 1m g/m L,进样体积2.4 3B V,洗脱剂浓度2 1.9 8%,洗脱剂体积1.5 2B V。该研究结果可为植物多糖纯化和醇提后残留废渣的再利用提供参考,具有很大的应用价值。关键词:东北刺人参废渣;响应面法;多糖;大孔树脂;分离纯化中图分类号:R 2 8 4.2 文献标志码:A P u r i f i c a t i o no fp o l y s a c c h a r i d e s f r o mO p l o p a n a x e l a t u sa d v e n t i t i o u s r o o t su s i n gm i c r o p o r o u sa b s o r p t i o nr e s i nZ HANG H o n g y a n,L IH a n x i,GUOY u q i n g,B A IL i n g h o n g,L I AN M e i l a n*(A g r i c u l t u r a l C o l l e g eo fY a n b i a nU n i v e r s i t y,Y a n j iJ i l i n1 3 3 0 0 2,C h i n a)A b s t r a c t:T o i m p r o v et h eu t i l i z a t i o ne f f i c i e n c yo fa d v e n t i t i o u sr o o t s(A R s)o fO p l o p a n a xe l a t u s,i nt h i ss t u d y,w eu s e dc r u d ep o l y s a c c h a r i d e s e x t r a c t e d f r o mt h eO.e l a t u sA Rr e s i d u e a f t e r e t h a n o l i c e x t r a c t i o n t oo p t i m i z e t h ep o l y s a c c h a r i d ep u r i f i c a t i o np r o c e s su s i n gm a c r o p o r o u sa d s o r p t i o nr e s i n s t h r o u g hs i n g l e-f a c t o ra n dr e s p o n s es u r f a c ee x p e r i m e n t s.T h e r e s u l t s s h o w e dt h a tA B-8r e s i nw a s s u i t a b l e f o rp o l y s a c c h a r i d ea d-s o r p t i o na n dd e s o r p t i o nc o m p a r e dw i t ho t h e rr e s i nt y p e s.T h ef a c t o r s,n a m e l y,s a m p l ec o n c e n t r a t i o na n dv o l u m e,a n ds a m p l i n g f l o wr a t e,e l u e n t c o n c e n t r a t i o na n dv o l u m e,a n de l u t i o nf l o wr a t ec r i t i c a l l ya f f e c t e dt h ep o l y s a c c h a r i d ep u r i f i c a t i o ne f f i c i e n c y.I nt h es i n g l e-f a c t o re x p e r i m e n t s,w ef o u n dt h a ts a m p l ec o n c e n-t r a t i o no f 0.8m g/m L,s a m p l ev o l u m eo f2B V,s a m p l i n gf l o wr a t eo f2B V/h,e l u e n tc o n c e n t r a t i o no f2 0%,e l u e n tv o l u m eo f 2.5B V,a n de l u t i o nf l o wr a t eo f2B V w e r ef a v o r a b l e.F u r t h e r m o r e,ar e s p o n s es u r f a c ee x p e r i m e n tw i t hf o u r f a c t o r s(s a m p l ec o n c e n t r a t i o na n dv o l u m e,a n de l u e n t c o n c e n t r a t i o na n dv o l-u m e)a n dt h r e el e v e l sc o n f i r m e da no p t i m a lp u r i f i c a t i o np r o c e s s,i n w h i c ht h ep o l y s a c c h a r i d ec o n t e n tr e a c h e d t h em a x i m u ma t s a m p l e c o n c e n t r a t i o no f 0.9 1m g/m L,s a m p l ev o l u m eo f 2.4 3B V,e l u e n t c o n c e n-延 边 大 学 农 学 学 报第4 5卷 t r a t i o no f 2 1.9 8%,a n de l u e n tv o l u m eo f 1.5 2B V.T h e f i n d i n go f t h i ss t u d yp r o v i d e dar e f e r e n c e f o r t h ep u r i f i c a t i o no fp l a n t p o l y s a c c h a r i d e s a n d t h e r e u s eo f r e s i d u a lw a s t e r e s i d u e a f t e r e t h a n o l e x t r a c t i o n,w h i c hi so fg r e a t a p p l i c a t i o nv a l u e.K e y w o r d s:T h ew a s t e r e s i d u eo fO p l o p a n a x s e l a t u sN a k a i;r e s p o n s e s u r f a c em e t h o d;p o l y s a c c h a r i d e;p o r-o u s r e s i n;s e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o n 东北刺人参(O p l o p a n a x s e l a t u sN a k a i),又名刺参,是一种多刺的落叶灌木,是中国长白山珍贵药用植物之一1。主要分布于吉林省高山地带周围,朝鲜、俄罗斯也有少量分布,喜欢生长在悬崖峭壁的石缝或者黑土层厚的地段处2。东北刺人参含多糖类、黄酮类、总酚类、挥发油、蒽醌类、皂苷类等多种有效成分。对治疗神经衰弱、低血糖、糖尿病、风湿等疾病有疗效,并且具有抗真菌、抗氧化、抗癌、抗炎等药理作用3。正因如此,也使得其在很多国家和地区医药市场上的需求量急速增加,作为药材被大量采伐,野生资源受到了严重破坏。生物反应器作为获得植物原材料的有效途径,可以在短时间内大量培养出不定根,有效缓解了原材料短缺这一问题4-5。前期研究发现,经乙醇提取后的东北刺人参不定根约剩有7 0%以上的废渣,废渣中含有多糖、多肽、黄酮等活性成分,具有较高的再利用价值。多糖是一种广泛分布于动植物、藻类及微生物中的天然大分子聚合物,由1 0个以上的单糖通过-或-糖苷键聚合形成。植物多糖是从植物中提取的天然活性物质,大量研究证明,其具有抑菌、抗癌、抗炎、抗自由基等生物活性6-8,同时在东北刺人参不定根渣中多糖含量也较为丰富,但是由于植物体构造复杂,生物活性化合物在植物体内种类繁多,不同化合物的功能不一,在使用时很难实现精准高效的应用,从而造成资源的浪费,因此,需要对不同功能的植物源生物活性物质进行分离与提纯。大孔树脂具有多孔结构,吸附量大、易解析、选择性好、重复利用等特点,是2 0世纪6 0年代发展起来的新型有机高聚物吸附剂,在医药研究领域的应用越来越多9,尤其在黄酮、多糖等生物活性物质的提取、分离纯化方面的应用尤为突出,并逐渐显现出其优越性1 0-1 1。包秀利等1 2在研究猪苓多糖的纯化方法时,采用3种不同型号大孔吸附树脂,最终结果表明,3种不同型号大孔吸附树脂对猪苓多糖均有显著纯化作用,以A B-8型大孔吸附树脂对猪苓多糖纯化效果最好,赵峻等1 3在A B-8树脂和D 1 0 1树脂纯化桑叶多糖的比较试验中表明,2种树脂纯化桑叶多糖的产率无显著差异,且产率也比较稳定,A B-8树脂和D 1 0 1树 脂 都 可 用 于 纯 化 桑 叶 多 糖 的 工 艺;潘 峰等1 4在S-8大孔吸附树脂纯化吴茱萸果实多糖工艺优化的试验中发现,S-8大孔吸附树脂可用于吴茱萸果实多糖的高效纯化,条件温和环保,且不会引起多糖链断裂和多糖结构改变,同时潘峰等1 5在大孔吸附树脂纯化白薇粗多糖的试验结果中表明,H P-2 0型树脂对白薇粗多糖纯化有很好的作用。由此可见,D 1 0 1、A B-8、S-8、S P-2 0这4种型号的树脂均对植物多糖纯化有效。在多糖纯化提取中,可以通过控制几个因素来提高效率,例如,大孔吸附树脂种类、进样浓度、进样体积、进样流速和洗脱剂浓度、洗脱剂体积及洗脱流速,这些因素之间具有复杂的相互作用1 6。因此,需要多因素实验设计,通过使用相对较少的实验组来优化多糖纯化提取过程。B o x-B e h n k e n设计响应面方法(B B D-R S M)是一种常见的数学模型,具有更好的可预测性和更少的工作量,试验周期短,求得的回归方程精度高,能研究几种因素交互作用等优点1 7,通常用于优化提取过程。因此,该研究使用在B B D-R S M实验中控制进样浓度、进样体积、洗脱剂浓度、洗脱剂体积来优化纯化提取过程,旨在为东北刺人参不定根渣中多糖的应用提供参考依据。1 材料与方法1.1 材料经乙醇提取后的东北刺人参不定根废渣干品作为试验材料,将不定根废渣干品浸泡在7 5%乙醇(料液比为11 5)中,6 0 冷凝回流1h后,抽滤,收集滤渣,重复3次。合并滤渣,挥干乙醇后,用1 0 0热水提取1h,提取3次,将每次抽滤的滤液进行合并,减压浓缩,加入乙醇沉淀离心,即得不定根多糖粗提物,备用。1.2 方法1.2.1 东北刺人参不定根废渣多糖分离纯化工艺优化的单因素试验1)大孔树脂的预处理将所需4种型号的大孔树脂在9 5%乙醇溶液01 第3期张宏妍,等:利用大孔吸附树脂纯化东北刺人参不定根多糖的研究中浸泡2 4h,用9 5%乙醇溶液先冲洗树脂柱,后用蒸馏水多次淋洗至无白色浑浊且无乙醇味。经上述处理后的树脂在4%HC l溶液和N a OH溶液中浸泡4h,再用蒸馏水冲洗流出液至p H值呈中性时停止,保存备用。2)大孔吸附树脂型号的选择采用动态吸附法1 8筛选大孔树脂的型号。该试验使用4种大孔树脂为D 1 0 1、A B-8、S-8和S P-2 0,购于廊坊麦克森化工建材有限公司(河北,中国)。将东北刺人参不定 根废渣粗 提 取 物 用 蒸 馏 水 稀 释 至1m g/m L后,测定其多糖浓度(C0)。取5g预处理后的大孔树脂放入2 0m L三角瓶中,加入(V1)1 0m L稀释的东北刺人参不定根废渣粗提物(1m g/m L),使树脂开始吸附多糖,吸附时间为4h,然后抽滤,测定滤液中多糖含量(C2)。计算吸附率,评价树脂吸附效果。将树脂上柱,用乙醇溶液洗脱,测定4种树脂的解吸率。综合吸附率及洗脱率两个指标,筛选出最佳型号的树脂。计算公式见(1),(2)。吸附率/%=(C0-C1)/C01 0 0,(1)解吸率/%=(C2-V2)/(C0-C1)V1 1 0 0.(2)3)进样质量浓度、进样体积、进样流速的筛选根据大孔树脂种类筛选试验结果,选用A B-8树脂 进 行 预 处 理,并 注 入 树 脂 柱(柱 径柱 高11 0),试验方法如下。进样质量浓度筛选试验:将粗提物浓度设置为0.4、0.6、0.8、1.0m g/m L后,分别进样,进样流速为1B V/h(B V为树脂柱体积),进样总体积为2B V。进样体积筛选试验:进样质量浓度设置为中最佳浓度,进样体积设置为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5B V,进样流速设置为1B V/h,每进料0.5B V,收集1次滤液用于测定。进样流速筛选试验:进样流速分别设置为1、2、3B V/h,进样浓度为试验中最佳浓度,进样体积为试验中最佳体积。以上所有处理均收集滤液,测定吸附率。4)洗脱剂浓度、洗脱剂体积和洗脱流速的筛选筛选洗脱剂浓度试验:选择乙醇作为该研究洗脱剂,精密称取预处理A B-8型大孔吸附树 脂5.0g于三角瓶中,加入1m g/m L粗提物1 0m L,处理4h后抽滤。将抽滤后的树脂再次置于三角瓶中,并加入1 0 m L不同浓度的乙醇(1 0%、2 0%和3 0%)浸泡4h,不加洗脱剂组加入与洗脱剂组同等剂量的蒸馏水,后抽滤。收集滤液,测定解吸率,根据多糖解吸率筛选洗脱剂浓度。筛选洗脱剂体积试验:加入粗提物的进样质量浓度、进样体积、进样流速为上述3)中筛选出的最佳条件,预处理的A B-8型大孔吸附树脂,与粗提物上柱吸附。洗脱流速设置为1 B V/h,每0.5B V洗脱后进行1次流出液体收集,洗脱剂总体量为3B V.筛选洗脱流速试验:洗脱剂体积为上述筛选洗脱剂体积试验中的最佳条件,洗脱流速分别设置为1、2、3B V/h。上述所有处理中收集滤液,减压压缩并干燥处理后,测定多糖解析率。1.2.2 东北刺人参不定根多糖分离纯化工艺响应面试验根据1.2.1的单因素试验,以A:进样质量浓度,B:进样体积,C:洗脱剂浓度,D:洗脱剂体积4个因素为自变量(表1),使用D e s i g n-E x p e r t1 2.0软件,依据B o x-B e h n k e n法进行4因素3水平试验设计共计2 7个组合,以纯化后的多糖得率为指标,对纯化多糖工艺进行优选。表1 响应面试验因素及水平T a b l e1 F a c t o r sa n d l e v e l so f r e s p o n s es u r f a c ed e s i g ne x p e r i m e n t独立变量编码水平-101进样质量浓度/(m gm L-1)A0.60.81进样体积/B VB1.522.5洗脱质量浓度/%C1 02 03 0洗脱体积/B VD1.522.51.2.3 多糖浓度的测定参照胡彦武等1 9方法,进行多糖含量的测定。为了绘制标准曲线,精密称取0.1g干燥的葡糖标准品,蒸馏水定容至1 0 0m L,分别取0.1、0.2 5、0.5、0.7 5、1.0、1.2 5和1.5m L上述葡萄糖溶液再用蒸馏水定容至1 0m L后,配制7种不同质量浓度葡萄糖溶液。取上述7种质量浓度的葡萄糖溶液各1m L,分别加入1m L的5%苯酚和5m L浓硫酸,空白对照组加入同样容量蒸馏水,反应3 0m i n后,用紫外分光光度计测定4 9 0n m处的吸光值,绘制葡萄糖标准曲线。测定样品中多糖含量的方法为:取1m L样品于试管中,先后加入1m L5%苯酚、5m L浓硫酸,充分混匀,静置3 0m i n,使其充分反应后利用紫外11延 边 大 学 农 学 学 报第4 5卷 分光光度计测定4 9 0n m处吸光值,并根据标准曲线计算多糖含量。1.2.4 数据分析试验 数 据 使 用G r a p h-P a d8.3.0(G r a p h P a dS o f t-w a r e,I n c.,S a nD i r g o,C A)进行方差分析和t检验,使用D e s i g n-E x p e r t 1 2.0进行响应面分析,采用邓肯式新复极差法进行多重比较,显著性为P0.0 5,所有试验处理均采用3次重复。2 结果与分析2.1 不定根多糖纯化单因素试验2.1.1 大孔树脂种类的筛选吸附和解脱的效果在不同种类的大孔吸附树脂对东北刺人参不定根废渣多糖中的表现不同。从吸附东北刺人参不定根废渣中多糖的情况来看,A B-8和D 1 0 1树脂在多糖的吸附率明显高于S-8和H P-2 0树脂,吸附率分别为8 0.6%和7 5.3%,说明A B-8和D 1 0 1两种树脂均对吸附东北刺人参不定根废渣中多糖中表现较好。而从解吸东北刺人参不定根废渣多糖的情况来看,用乙醇作为洗脱剂进行洗脱,结果发现A B-8和S-8树脂的解吸率显著高于D 1 0 1和H P-2 0树脂,A B-8和S-8树脂的解析率均在8 9%以上(表2)。综上所述,在吸附率和解吸率情况上来看,A B-8大孔树脂明显高于其他3种类型的大孔树脂,所以,该研究选用A B-8大孔树脂用于进一步的东北刺人参不定根废渣中多糖纯化条件的研究。表2 不同类型的大孔吸附树脂对不定根提取物中多糖的吸附和解析的影响T a b l e2 E f f e c t o fm i c r o p o r o u sa d s o r p t i o nr e s i nt y p e so na b s o r p t i o na n dd e s o r p t i o no fp o l y s a c c h a r i d e s i na d v e n t i t i o u s r o o t e x t r a c t树脂类型吸附率/%解吸率/%D 1 0 17 5.38 4.0 6A B-88 0.68 9.2 7S-86 7.79 1.8HP-2 06 2.98 1.6 42.1.2 进样质量浓度、进样体积和进样流速对东北刺人参不定根中多糖吸附的影响该试验采用动态吸附法,从进样质量浓度、进样体积、进样流速3方面影响上对大孔树脂吸附多糖进行研究(图1)。注:数值为平均值标准偏差(n=3)。字母表示在0.0 5水平上差异显著(P0.0 5),下同。图1 进样质量浓度、进样体积、进样流速对多糖吸附的影响F i g.1 E f f e c t o f s a m p l ec o n c e n t r a t i o na n dv o l u m e,a n ds a m p l i n g f l o wr a t eo np o l y s a c c h a r i d ea d s o r p t i o n21 第3期张宏妍,等:利用大孔吸附树脂纯化东北刺人参不定根多糖的研究 进样质量浓度为0.8m g/m L时,吸附率明显高于其他3种质量浓度(0.4、0.6、1.0m g/m L),该结果表明,质量浓度为0.8m g/m L的树脂可以更好地吸附多糖(图1-A)。因此,研究所选用的进样质量浓度为0.8m g/m L。在进样体积为2B V时,吸附率达到了最高值,之后随着进样体积的递增,吸附率逐渐降低,表明进样体积为2B V时,树脂已经吸附了最大量的多糖,继续进样只会使多糖流失,造成浪费(图1-B)。当进样流速为2B V/h时,吸附率显然高于其他2种流速(1,3B V/h),说明进样流速为2B V/h时,树脂可更好地吸附多糖(图1-C)。2.1.3 洗脱剂的浓度、体积和流速对东北刺人参不定根中多糖解吸的影响洗脱剂为乙醇,当乙醇浓度为2 0%时,树脂对多糖的解析率高于其他3种浓度(1%、1 0%、3 0%),结果表明,当乙醇洗脱剂浓度达到2 0%时,被大孔树脂吸附的多糖可以更好地解析出来(图2-A)。当洗脱剂体积为0.5B V时,解析率为最低,而后随着洗脱剂体积的逐渐递增,多糖解析率也呈现逐渐递增趋势,直至洗脱剂浓度为2.5B V时,多糖解析率达到最大值,该情况表明,当洗脱剂体积为2.5B V时,可以将多糖最大程度地解析出来,是较为适宜的洗脱体积(图2-B)。当洗脱流速为2B V/h时,多糖解析率高于其他2种流速(1、3B V/h),说明当洗脱流速为2B V/h时,对多糖解吸效果较好,因此,选择最佳的洗脱流速为2B V/h(图2-C)。图2 洗脱剂浓度、洗脱体积、洗脱流速对多糖解吸的影响F i g.2 E f f e c t o f e l u e n t c o n c e n t r a t i o na n dv o l u m e,a n de l u t i o nf l o wr a t eo np o l y s a c c h a r i d ed e s o r p t i o n2.2 纯化条件优化研究在上述单因素试验的基础上,利用响应面分析法的B o x-B e h n k e nD e s i g n方法,进行了4因素3水平的试验设计。结果表明,不同试验组的多糖得率有很大差异(表3)。以各试验组多糖得率作为响应值建立了响应面设计模型,经多元拟合回归分析,得到二次回归模型方程:Y=2.8 4+0.1 1 33A+0.2 3 67B+0.2 0 17C+0.0 8 50D-0.0 9 00A B+0.1 2 75A C-0.0 1 25A D+0.0 7 00B C-0.0 1 50B D+0.1 6 25C D-0.5 7 88A2-0.5 8 88B2-0.6 9 87C2-0.5 5 13D2,式中,A,B,C,D分别代表进样质量浓度,进样体积,洗脱剂浓度,洗脱剂体积。31延 边 大 学 农 学 学 报第4 5卷 表3 响应面试验结果T a b l e3 R e s u l t o f r e s p o n s e s u r f a c ed e s i g ne x p e r i m e n t试验号进样质量浓度/(m gm L-1)(A)进样体积/(B V)(B)洗脱剂浓度/%(C)洗脱体积/B V(D)多糖得率/%1.00.82.01 02.51.1 520.81.53 02.01.2 730.82.52 01.51.7 740.62.52 02.01.8 751.01.52 02.01.6 960.82.52 02.51.9 471.02.01 02.01.0 680.62.02 01.51.4 290.82.02 02.02.7 11 00.81.52 01.51.3 01 10.82.03 02.52.1 21 20.81.51 02.01.4 41 30.82.01 01.51.4 21 41.02.02 01.51.8 41 50.82.02 02.02.8 51 61.02.52 02.02.0 01 70.61.52 02.01.2 01 81.02.03 02.01.9 11 90.82.53 02.01.9 02 00.62.03 02.01.6 82 10.81.52 02.51.5 32 20.82.51 02.01.7 92 30.82.02 02.02.9 62 41.02.02 02.52.0 72 50.62.01 02.01.3 42 60.82.03 01.51.7 42 70.62.02 02.51.7 0 对回归模型进行方差分析的结果表明(表4),模型的P值小于0.0 0 1,表明此模型达到高度显著水平;失拟项代表实际值与预测值的不拟合程度,该模型中失拟项P值(0.2 8 18)大于0.0 5,呈不显著性,说明模型的预测值与实测值高度拟合。从图3也可以看出,模型的预测值离散程度大(图3-A),且与实际值趋于同一条直线(图3-B),进一步说明模型拟合程度高,说明该模型适用于该研究试验结果的分析预测。另外,R 2为0.9 1 98,表明试验误差小;调整后的确定系数R 2 A d j为0.8 2 62,表明模型充分拟合试验数据。从表4可知,进样体积(B),洗脱剂浓度(C)的P值均小于0.0 5,说明此2个因素对多糖得率均具有显著的影响。F值从大到小的顺序为,进样体积(F=1 6.4 5),洗脱剂浓度(F=1 1.9 5),进样浓度(F=3.7 7),洗脱剂体积(F=2.1 2),说明对多糖得率影响最大是进样体积,其次是洗脱剂浓度,然后是进样浓度,洗脱剂体积的影响最小。另外,每两个因素间(A B,A C,AD和B C,B D,C D)交互作用均无显著性(表4,图4)。该研究对东北刺人参不定根废渣多糖纯化的4因素3水平进行了响应面分析,结果表明,回归模型充分拟合试验数据,因此,用此模型分析结果可用于提取工艺的优化。回归模型给出的最佳提取工艺参数为:进样质量浓度0.9 1m g/m L,进样体积2.4 3B V,洗脱剂浓度2 1.9 8%,洗脱剂体积1.5 2B V,多糖得率的响应预测值为2.8 4%。41 第3期张宏妍,等:利用大孔吸附树脂纯化东北刺人参不定根多糖的研究表4 方差分析结果T a b l e4 R e s u l t o f v a r i a n c ea n a l y s i s方差来源平方和自由度均方FPM o d e l5.6 2 001 40.4 0 169.8 30.0 0 02*A-进样质量浓度/(m gm L-1)0.1 5 4110.1 5 413.7 70.0 7 59B-进样体积/B V0.6 7 2110.6 7 211 6.4 50.0 0 16*C-洗脱剂浓度/%0.4 8 8010.4 8 801 1.9 50.0 0 47*D-洗脱剂体积/B V0.0 8 6710.0 8 672.1 20.1 7 08A B0.0 3 2410.0 3 240.7 9 310.3 9 07A C0.0 6 5010.0 6 501.5 9 000.2 3 11AD0.0 0 0610.0 0 060.0 1 530.9 0 36B C0.0 1 9610.0 1 960.4 7 980.5 0 17B D0.0 0 0910.0 0 090.0 2 200.8 8 45C D0.1 0 5610.1 0 562.5 90.1 3 38A21.7 9 0011.7 9 004 3.7 30.0 0 01*B21.8 5 0011.8 5 004 5.2 50.0 0 01*C22.6 0 0012.6 0 006 3.7 40.0 0 01*D21.6 2 0011.6 2 003 9.6 70.0 0 01*残差0.4 9 021 20.0 4 09失拟项0.4 5 881 00.0 4 592.9 20.2 8 18纯误差0.0 3 1420.0 1 57总和6.1 1 002 6R20.9 1 98R2A d j0.8 2 62 注:A为进样质量浓度,B为进样体积,C为洗脱剂浓度,D为洗脱剂体积。*表示P0.0 0 1水平上的极显著差异,*表示P0.0 5水平上的显著差异。R2和R2A d j分别表示相关系数和修正相关系数。图3 测值分析结果F i g.3 A n a l y s i so fp r e d i c t e dv a l u e51延 边 大 学 农 学 学 报第4 5卷 图4 4因素交互作用对多糖得率的影响F i g.4 I n t e r a c t i o ne f f e c t o f f o u r f a c t o r so np o l y s a c h a r i d ey i e l d61 第3期张宏妍,等:利用大孔吸附树脂纯化东北刺人参不定根多糖的研究3 讨论与结论植物多糖又可称作植物多聚糖,是生物体内除蛋白质及核酸外,又一类重要的生物大分子,属于生命有机体组成部分中不可或缺的天然高分子聚合物2 0。我国植物资源种类繁多,植物多糖类化合物普遍存在其中,在抗肿瘤、免疫调节、降血糖等诸多方面2 1,都有一定的调节作用,植物多糖相关研究中最主要的影响因素为色素、蛋白质等杂质,在传统方法纯化多糖脱除色素、蛋白质等杂质时,多选择双氧水法,S e v a g e法2 2,但这种方法的缺点在于脱除杂质的同时会导致部分多糖流失,并且工艺较为复杂。据研究,传统多糖纯化方法主要有高速逆流色谱法、双水相萃取法、高效液相色谱法等,与脱除杂质方法一样这些方法也具有工艺复杂,人工成本高的特点。由于大孔树脂具有高效、简单、环保、节能等优点,所以被广泛应用于天然产物纯化领域。刘仲英等2 3在响应面法大孔树脂纯化地黄多糖的最优工艺条件试验中发现,树脂质量比(H P D-4 0 0L S-7 0 0 B)为1.2 0,上 样 浓 度6.0 m g/m L,温 度3 0,上样速率1.5B V/h,上柱体积1.5B V,为最适宜地黄多糖纯化的工艺条件。纯化后的多糖保留率为9 0.2 5%,脱色率为8 3.1 5%,蛋白质脱除率7 9.7 5%,综合评分为8 4.9 7。罗淼等2 4在响应面法优化大孔树脂纯化毛木耳多糖工艺试验中发现,研究所选择7种不同的大孔树脂,筛选后发现D-1 0 1型大孔树脂吸附效果最好,最佳吸附条件为:上样液质量浓度5m g/m L,上样液p H值4,上样液速度2.5m L/m i n。最佳解吸条件为:4B V8 0%乙醇溶液,2.0m L/m i n洗脱速率,经过该工艺优化后,毛木耳多糖纯化后总多糖纯度为2 3.5 9%。廖琴等2 5在响应面法优化大孔树脂纯化百合多糖试验中发现,D 3 1 5大孔树脂经筛选为吸附多糖效果最佳的大孔树脂,而D 3 1 5大孔树脂纯化百合多糖最佳工艺为:样 品 溶 液 流 速3 m L/m i n,粗 多 糖 质 量 浓 度3.6m g/m L,柱温度4 6,粗糖溶液p H值7。在此工艺条件下产品中多糖纯度可达8 9.6 2%,纯化产率为7 5.5 7%。在该研究中,结合单因素试验和响应面分析法得出最适宜大孔吸附树脂A B-8对东北刺人参不定根废 渣 多 糖 纯 化 的 最 佳 条 件 为:进 样 质 量 浓 度0.9 1m g/m L、进 样 体 积2.4 3 B V、洗 脱 剂 浓 度2 1.9 8%、洗脱剂体积1.5 2B V,多糖得率的预测值为2.8 4%。综上所述,可以得出用A B-8树脂纯化东北刺人参不定根废渣多糖的试验具有可行性,该研究结果为今后对东北刺人参不定根废渣多糖纯化提供了实验依据,也对保护环境、充分利用不定根及提高经济效益有重要意义。参考文献:1 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7.下转第2 4页71延 边 大 学 农 学 学 报第4 5卷 2 1 MA CHA D O R,MA L TAC,A L V E S-P E R E I R AI,e ta l.E f f e c t so fn u t r i e n ts o l u t i o nc o n c e n t r a t i o no np l a n tg r o w t ha n dp h y t o c h e m i c a l a