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酶工程实验报告（论文）
动物肝脏碱性磷酸酶的分离纯化及酶学性质的鉴定

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2023年5月

目录
摘要 1
Abstract 2
1.前言 3
1.1碱性磷酸酶 3
1.2碱性磷酸酶化学特性 3
1.3研究意义 3
2.试剂与仪器 4
2.1试剂 4
2.2仪器 5
3. 材料与方法 5
3.1材料 5
3.2方法 5
3.2.1碱性磷酸酶的分离纯化 9
3.2.2碱性磷酸酶的动力学鉴定 13
3.2.3碱性磷酸酶的最适pH及酸碱稳定性测定 13
3.2.4碱性磷酸酶的及热稳定性测定 15
3.2.5克制剂类型鉴别 9
结果 9
结论 13
参考文献 13
致谢 15

动物肝脏碱性磷酸酶的分离纯化及酶学性质的鉴定
摘要 目的 ①通过一系列实验，熟悉并掌握碱性磷酸酶分离纯化的一般环节及相关原理，可以纯熟运用碱性磷酸酶的分离纯化方法得到较为纯净的碱性磷酸酶，②同时对碱性磷酸酶的动力学（Km)、最适PH及酸碱稳定性、最适温度及热稳定性、克制剂类型进行鉴别鉴定。方法：①采用有机溶剂沉淀法从肝匀浆中分离纯化碱性磷酸酶（简称AKP）。②在不同作用物浓度的条件下，测定酶活性（A），求Km值。③将酶液提成若干份，分别置于一系列不同的PH的溶液中保温解决一定期间，然后在最适PH条件下进行活力测定。④一定条件下于不同温度解决酶，迅速降温测定酶活力。⑤以KH2PO4作为碱性磷酸酶的克制剂，验证其克制作用。
关键词：碱性磷酸酶、动力学（Km)、最适PH及酸碱稳定性、最适温度及热稳定性、克制剂、鉴定、米氏常数
The separation and purification of liver alkaline phosphatase and the enzymatic properties and identification
ABSTRACT: Objective (1) through a series of experiments, familiar with and master the general steps of isolation and purification of alkaline phosphatase and related principle, able to skillfully use the separation and purification of alkaline phosphatase method is relatively pure alkaline phosphatase, (2) the dynamics of alkaline phosphatase (Km), the optimal PH and acid-base stability, the optimum temperature and thermal stability, the types of inhibitors of appraisal. Methods: (1) using organic solvent precipitation from liver homogenate in purification of alkaline phosphatase (AKP). (2) under the condition of different concentration of substrate, the determination of enzyme activity (A), o k value. (3) the enzyme liquid into several portions, respectively in a range of different PH of the solution heat preservation processing in a certain time, and then under the condition of the optimal PH for activity assay. (4) under a certain condition in different temperature processing enzymes, rapid cooling determination of enzyme activity. (5) with KH2PO4 as alkaline phosphatase inhibitor, verify its inhibition.

KEY WORDS: alkaline phosphatase, dynamics (Km), the optimal PH and acid-base stability, optimum temperature and thermal stability, inhibitors, identification,Km
动物肝脏碱性磷酸酶的分离纯化及酶学性质的鉴定
1. 前言
1.1碱性磷酸酶
碱性磷酸酶（ ALP 或 AKP ）是广泛分布于人体或动物体肝脏、骨骼、肠、肾和胎盘等组织经肝脏向胆外排出的一种酶。这种酶能催化核酸分子脱掉5’磷酸基团，从而使DNA或RNA片段的5’-P末端转换成5’-OH末端。但它不是单一的酶，而是一组同功酶。目前已发现有 AKP1 、 AKP2 、 AKP3 、 AKP4 、 AKP5 与 AKP6 六种同功酶。其中第 1 、 2 、 6 种均来自肝脏，第 3 种来自骨细胞，第 4 种产生于胎盘及癌细胞，而第 5 种则来自小肠绒毛上皮与成纤维细胞。
1.2碱性磷酸酶化学特性
碱性磷酸酶属于同源二聚体蛋白，分子量为56KDa。每个单体由449个氨基酸组成，完整的AKP分子呈现典型的α/β的拓扑结构，同时每个单体均具有一个活性中心，活性中心区域由Asp101-Ser102-Ala103三连体、Arg166、水分子、三个金属离子及其配体氨基酸组成。AKP被phoA 基因编码，与很多分泌蛋白同样，在细胞质内合成氨基末端带有信号肽的单体前体，信号肽引导前体跨内膜运送后被切除，同源二聚体形成。碱性磷酸酶是一种可以将相应底物去磷酸化的酶，即通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生成磷酸根离子和自由的羟基，这类底物涉及核酸、蛋白、生物碱等。而该脱去磷酸基团的过程被称为去磷酸化或脱磷酸化。碱性磷酸酶是磷酸酶的一种，磷酸酶的作用与激酶的作用正相反，激酶是磷酸化酶，可以运用能量分子，如ATP，将磷酸基团加到相应底物分子上。碱性磷酸酶在碱性环境有最大活力，对来源于细菌中的ALP来说，其最适pH是8.0，而对来源于牛的ALP则是8.5。ALP是一种含锌的糖蛋白，在碱性环境中（最适Ph为10左右）可以水解各种天然及人工合成的磷酸单酯化合物底物。
1.3研究意义
临床上测定ALP重要用于骨骼 、肝胆系统疾病的诊断和鉴别诊断，特别是黄疸的鉴别诊断。对于不明因素的高ALP血清水平，可测定同工酶以协助明确其器官来源。
（1）生理性增高：儿童在生理性的骨骼发育期，碱性磷酸酶活力可比正常人高1～2倍。处在生长期的青少年，以及孕妇和进食脂肪含量高的食物后均可以升高。
（2）病理性升高：
①骨骼疾病如佝偻病、软骨病、骨恶性肿瘤、恶性肿瘤骨转移等；
②肝胆疾病如肝外胆道阻塞、肝癌、肝硬化、毛细胆管性肝炎等；
③其他疾病如甲状旁腺机能亢进。
（3）病理性减少：见于重症慢性肾炎、儿童甲状腺机能不全、贫血等。
2.仪器与试剂
2.1仪器
移液枪、量筒、剪刀、玻璃匀浆器、离心机、离心管、恒温水浴锅、721型分光光度计
2.2试剂
0.5mol/L醋酸镁溶液、0.1mol/L醋酸钠溶液、0.01mol/L醋酸镁--0.01mol/L醋酸钠溶液、Tris-HCl pH8.8缓冲液、正丁醇、丙酮、95%乙醇、0.04mol/L作用物液（10.16g磷酸苯二钠于1000ml水中配制）、0.1mol/L碳酸盐缓冲液、0.5mol/LNaOH溶液、0.3%4-氨基安替比林、0.5%铁氰化钾、0.5mol/LKH2PO4、0.04M磷酸氢钠
3. 材料与方法
3.1材料
新鲜的猪肝或鸭肝
3.2方法
3.2.1碱性磷酸酶的分离纯化
将得到的动物肝脏10g剪碎为组织块加0.01mol/L醋酸镁--0.01mol/L醋酸钠30ml在电动匀浆机上匀浆，取肝匀浆32.5ml加10ml正丁醇搅拌3--5分钟，室温静置30分钟，用四层纱布过滤得23.5ml滤液加23.5ml冷丙酮混匀，冰冻离心2023r/min5分钟，弃上清液，沉淀加0.5mol/L醋酸镁20ml，量体积为28.5ml得悬液加95%乙醇13ml至30%，离心2023r/min5分钟，弃沉淀得上清液33.5ml加95%乙醇30ml至65%，离心2023r/min5分钟。弃上清液得沉淀加0.01mol/L醋酸镁--0.01mol/L醋酸钠20ml溶解，加95%乙醇9.75ml至30%，离心2023r/min5分钟，弃沉淀，上清液30ml加95%乙醇24.5ml至60%，离心2023r/min5分钟，弃上清液，沉淀加0.5mol/L醋酸镁15ml溶解，加99.5%丙酮8.5ml至33%，离心2023r/min5分钟，弃沉淀，上清液22.5ml加99.5%丙酮7.65ml至50%，离心4000r/min10分钟，弃上清液，沉淀加pH8.8Tirs缓冲液25ml,离心2023r/min5分钟，弃沉淀，得上清液记录总体积25ml。
3.2.2碱性磷酸酶的动力学鉴定--Km测定
取大试管8支，按下表操作
表1
试剂（ml)
管号
1
2
3
4
5
6
7
0
0.04mol/L作用物液
0.15
0.20
.025
0.30
0.40
0.60
0.80
0
Ph10碳酸缓冲液
0.90
0.90
0.90
0.90
0.90
0.90
0.90
0.90
蒸馏水
0.85
0.80
0.75
0.70
0.60
0.40
0.20
1.0
混匀，37℃预温5分钟
酶液
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
①按表1操作加入酶液混匀之后立即计时，各管在37℃水浴中准保证温15分钟后，立即加入0.5mol/LNaOH溶液1.0ml终止反映；②显色，各管中加入0.3%4氨基安替比林1.0ml和0.5%铁氰化钾2.0ml，充足混匀，静置10分钟，以0管为对照，在波长510nm下比色，记录各管吸光度。③作图，所测各管的吸光度代表各管中反映速度V，以之为纵轴，以作用物浓度[S]为横轴作图观测曲线形状；以各管吸光度值的倒数为纵坐标，以作用物浓度的倒数为横坐标作图求酶的Km值。
3.2.3碱性磷酸酶的最适pH及酸碱稳定性测定
①pH--活性曲线的制作
取6支试管，按下表操作
表2
管号
1
2
3
4
5
0
反映pH
8
9
10
11
12
10
相应pH缓冲液
各加0.5ml
酶液
各加0.1ml(0号管酶液在铁氰化钾之后加）
37℃预热5min
预热的基质液
各加3.0ml
37℃精保证温15min各加1.0ml碱性溶液终止反映
0.5%铁氰化钾
各加2.0ml
静置10min
A510
0.074
0.111
0.150
0.072
0
0
以反映pH值为横坐标，A510为纵坐标绘制pH--活性曲线，求最适pH值。
②酸碱稳定范围的测定
取6支试管编号，按下表操作
表3
管号
1
2
3
4
5
0
解决pH
8
9
10
11
12
10
相应缓冲液
各加0.1ml
酶液
各加0.1ml
37℃保温解决1小时
0.1MpH10碳酸盐缓冲液
各加0.5ml
预热的基质液
各加3.0ml（0号试管基质液在铁氰化钾之后加）
37℃精保证温15min各加1.0ml碱性溶液终止反映
0.5%铁氰化钾
各加2.0ml
静置10min
A510
0.202
0.197
0.146
0.107
0.011
0
以pH为横坐标，A510为纵坐标，绘制酸碱稳定曲线，分析碱性磷酸酶的酸碱稳定范围。
3.2.4碱性磷酸酶的最适温度及热稳定性测定
①温度--活性曲线的制作
取试管4支，按下表操作
管号
1
2
3
0
反映温度（℃）
30
37
80
37
稀释酶液
各加0.1ml(0号管酶液在铁氰化钾之后加）
预热复合基质液
各加3.0ml
分别在不同温度下精确反映15min,各加1.0ml碱性溶液终止反映
各加0.5%铁氰化钾2.0ml,静置10min
A510
0.023
0.016
0
0
表4
以反映温度为横坐标，A510为纵坐标绘制温度--活性曲线图，求最适温度。
②热稳定性
取4支试管，按下表操作
表5
管号
1
2
3
0
热解决温度（℃）
30
37
80
37
热解决时间（min）
30
30
30
30
酶液（ml)
各加0.1ml(0号管在铁氰化钾之后加）
相应水浴中放置相应时间后取出，以流动水冷却于37℃温水中预热2分钟
37℃预热的复合基质液
各加3.0ml
37℃精保证温15min各加1.0ml碱性溶液终止反映
各加0.5%铁氰化钾2.0ml,静置10min
A510
0.024
0.196
0
0
以解决温度为横坐标，A510为纵坐标，绘制热稳定曲线，分析热稳定范围。
3.2.5克制剂类型鉴别
试剂（ml)
管号
1
2
3
4
5
6
7
0
0.04mol/L作用物液
0.15
0.20
.025
0.30
0.40
0.60
0.80
0
碳酸盐缓冲液
0.90
0.90
0.90
0.90
0.90
0.90
0.90
0.90
蒸馏水
0.80
0.75
0.70
0.65
0.60
0.50
0.1
0.90
0.25MKH2PO4
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
混匀，37℃预温5分钟
酶液
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
最终底物浓度(mmol/L)
2
3
4
5
6
8
16
0
结果
结果如下图

图1Km值测定
由图一可知，Km值测定曲线y=3.697x+1.684，计算出Km值为2.195mmol/L

图2pH--活性曲线

图3酸碱稳定范围

图4温度-活性曲线图

图5热稳定性范围

图5克制剂类型图

结论及讨论
结论
通过本实验，可知碱性磷酸酶在本次实验条件下的Km值为2.195mmol/L，其最适pH值为10，酸碱稳定性范围为pH值8-9，在pH值为8时最为稳定，pH值过高或过低都会影响AKP的稳定性。
通过本次实验可知，在本次实验条件下，AKP的最适温度为30℃，其热稳定性范围为35-37℃，其在37℃时的稳定性最佳，当温度低于最适温度时，酶的活性会随着温度的升高而上升，而温度高于最适温度时，其活性会随之下降。
而本实验采用的克制剂类型为竞争性克制
讨论
本次实验过程中，在最后一个实验中，由于实验仪器的故障以及我们的一个小小的失误，导致我们的实验失败了.虽然我们及时做出了补救措施，但是得到的结果仍不尽如人意，出现了一些误差，导致做出来的图线性关系不是较好，在之后的研究工作中，从本次实验中的局限性吸取经验教训，更严谨的得到科学数据，更加认真的从事研究工作。
参考文献
陈惠黎·1999·生物大分子的结构与功能·上海：上海医科大学出版社
郭勇，蔡武城·1986·微生物酶·北京：科学出版社
郭勇·1996·现代生化技术·广州：华南理工大学出版社
郭勇·2023·酶工程·2版·北京：科学出版社
罗进贤·1987·分子生物学引论·广州·中山大学出版社
张今，曹淑贵·2023·分子酶学工程导论·北京：科学出版社
Dugas H·1995·Bioorganic Chemistry·New Yoru：Springer-Verlag
Nicholas C Price,Lewis Stevens.2023.Fundamentals of Enzymology,3rd Edition.NewYork:OxfordUniversityPress
致谢
感谢伍红老师，林亚秋老师为我提供本次实验的机会，让我有机会接触并研究碱性磷酸酶的分离纯化技术。
感谢老师耐心细致地为我讲解各种仪器的操作方法及注意事项，帮助我解决实验中碰到的一些问题。老师的帮助使我受益匪浅，不仅使我及时完毕了实验任务，也教会了我许多实验技巧。
最后再次感谢在本次毕业实验中指导和帮助我的老师们！