水培与泥炭土培金线莲生长及代谢差异比较.pdf

接收日期：2024-01-05 接受日期：2024-02-05 基金项目：福建中医药大学引进人才科研启动项目(2801/701190097)*通信作者。E-mail: 水培与泥炭土培金线莲生长及代谢差异比较水培与泥炭土培金线莲生长及代谢差异比较 赵 琪，王 弛，赵 峰*(福建中医药大学药学院，福建 福州 350122)摘 要：系统比较以水培和土培方式栽培 30 d 和 90 d 的金线莲生长指标、品质组分构成的差异，并通过代谢组学探究不同栽培方式下金线莲主要差异代谢通路。结果表明，相较于土培，水培第 30 天根长显著增加，第 90 天根长及叶面积显著增长，但茎粗有所下降；水培第 30 天净光合速率显著增长，水培第 90 天叶绿素含量显著增加。从组分上看，水培第 30 天总黄酮及金线莲苷含量显著增加，天冬氨酸、-氨基丁酸、羟脯氨酸含量显著降低；水培第 90 天，天冬氨酸、天门冬酰胺、-氨基丁酸和蛋氨酸含量显著降低。代谢通路上，与土培组相比，水培组金线莲第 30 天脂质、黄酮和黄酮醇生物合成、二萜及次级代谢生物合成显著上调；第 90 天脂质和次级代谢通路显著上调，二萜生物合成则发生下调。关键词：金线莲；水培；代谢组学；差异代谢物 Doi:10.3969/j.issn.1009-7791.2024.01.003 中图分类号：Q945 文献标识码：A 文章编号：1009-7791(2024)01-0022-09 Differences in Growth and Metabolics between Hydroponic and Peat Soil Cultivation Anoectochilus roxburghii ZHAO Qi,WANG Chi,ZHAO Feng*(School of Pharmacy,Fujian University of Traditional Chinese Medicine,Fuzhou 350122,Fujian China)Abstract:The aim of the study was to systematically compare the differences in growth indexes and quality components between hydroponics and soil cultivation for 30 days and 90 days,and to investigate the main differential metabolic pathways of Anoectochilus roxburghii.The results showed that comparing with soil cultivation,the root length of hydroponics increased significantly on 30th day,and the root length and leaf area increased significantly on 90th day,but the stem thickness decreased.The net photosynthetic rate increased significantly on 30th day of hydroponics,and the chlorophyll content increased significantly on 90th day of hydroponics.In terms of components,total flavonoids and kinsenoside increased significantly on 30th day of hydroponics,and aspartic acid,-aminobutyric acid,and hydroxyproline decreased significantly;aspartic acid,asparagine,-aminobutyric acid,and methionine decreased significantly on 90th day of hydroponics.On metabolic pathways,lipid,flavonoid and flavonol biosynthesis,diterpene and secondary metabolic biosynthesis were significantly up-regulated on 30th day,and lipid and secondary metabolic pathways were significantly up-regulated,while diterpene biosynthesis underwent a down-regulation on 90th day in the hydroponically grown group compared to the soil-grown group on 30th day and 90th day.Key words:Anoectochilus roxburghii;hydroponics;metabolomics;differential metabolites 2024,53(1):2230.Subtropical Plant Science 第 1 期 赵 琪等：水培与泥炭土培金线莲生长及代谢差异比较 23金线莲Anoectochilus roxburghii为兰科Orchidaceae开唇兰属 Anoectochilus 多年生草本植物1，富含氨基酸、黄酮类等活性成分，具有清热凉血、祛风利湿等功效2，为药食两用植物。水培是一种无土栽培技术，即在人工调配的营养液中培养植物3。目前能够运用水培技术栽培金线莲，并展现出优于土培的特点。首先，与传统土壤基质相比，水培在养分利用率、污染物控制、病虫害管理等方面优势尤其突出45；其次，水培条件下金线莲的生长状况往往优于土培6；再次，水培方式生产更有利于工厂化逆境生长条件的模拟，如有报道一种新型水培装置可模拟不同海拔和坡度的金线莲生长环境7。但是，目前尚未见围绕两种栽培方式影响金线莲生理指标和化学组分构成的系统研究，也未有两种栽培方式对金线莲主要差异代谢通路的影响的研究。本研究将系统地比较金线莲在水培和土培 30 d 和 90 d条件下生长指标、品质组分构成的差异，并通过代谢组学探究不同栽培方式下金线莲主要差异代谢通路，为工厂化水培金线莲提供理论依据。1 材料与方法 1.1 试验设计 尖叶金线莲种源 6 月龄组培苗，购自福建省中科生物股份有限公司。经 14 d 开盖炼苗，选择长势好且大小基本一致的组培苗。参照作者前期所建立的方法进行栽培：白光 30 molm2s1，光周期 14 h，温度 25，相对湿度 75%。随机区组设计，设置“水培组”与“泥炭土培组”(分别简称“水培”和“土培”)。水培，采用 41 cm 24 cm 14 cm 的 24 孔种植箱，去离子水量没过定植篮底部 0.51 cm；土培，采用塑料育苗盆(口径 8 cm，盆高 11 cm，底径4.8 cm)，每盆栽培 4 株，栽培深度掩埋种苗约 23个节(约 34 cm)，基质为泥炭土(丹麦，品氏):珍珠岩(中国，德沃多)=2:1(体积比)。水肥管理：水培组，每 14 d 更换一次营养液(花多多 11 号兰科肥，浓度0.25 gL1)；土培组一周浇去离子水 1 次(每盆60 mL)，下一周浇施营养液(浓度 1 gL1，每盆 60 mL)1 次，如此循环。1.2 仪器与设备 LED 人工气候箱(宁波普朗特仪器有限公司)；SPAD-502 Plus 叶绿素仪(日本柯尼卡美能达)；Dionex Ultimate3000 高效液相色谱，串联 Q-ExactiveTM高分辨率四极杆-Orbitrap 质谱仪(美国，赛默飞世尔科技公司)；AcquityTMUHPLC CSH C18(1.7 m，2.1 mm 100 mm)色谱柱；EasySep-3030 液相色谱，串联UM5800Plus 蒸发光散射检测器(上海通微分析技术有限公司)；XBridge HILIC(5 m，4.6 mm 250 mm)正相色谱柱(美国，Waters 公司)；CIRAS-3 便携式光合作用测定系统(汉莎科技集团)；MM400 球磨仪(德国 Retsch 公司)；LGJ-10FD 真空冷冻干燥机(北京松源华兴生物技术有限公司)；P5 型双光束紫外可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)。1.3 主要试剂 三乙胺(上海麦克林生化科技股份有限公司)；19种氨基酸混合标品(-氨基丁酸 GABA、丙氨酸 Ala、蛋氨酸 Met、脯氨酸 Pro、甘氨酸 Gly、瓜氨酸 Cit、精氨酸 Arg、赖氨酸 Lys、酪氨酸 Tyr、亮氨酸 Leu、色氨酸 Trp、苏氨酸 Thr、丝氨酸 Ser、天冬氨酸 Asp、天门冬酰胺 Asn、缬氨酸 Val、苯丙氨酸 Phe、组氨酸 His、羟脯氨酸 Hy-Pro)购自上海源叶生物科技有限公司；金线莲苷、水仙苷标准品，纯度大于 98%(上海源叶生物科技有限公司)；色谱级甲醇、色谱级乙腈(德国默克公司)；AccQ-FluorTM 氨基酸衍生剂(上海源叶有限公司)；乙酸铵(上海安谱实验科技股份有限公司)。1.4 生长与生理指标测定 两处理组中随机选择 10 株金线莲，按牛欢等8的方法测量根长、叶面积、茎粗、叶厚；光合作用仪测定净光合速率；叶绿素仪测定叶绿素。1.5 总黄酮、金线莲苷和游离氨基酸组分测定 采用三乙胺显色法9，以水仙苷为对照测定总黄酮含量；液相色谱法测定金线莲苷含量10；AQC柱前衍生高效液相色谱法测定游离氨基酸含量11。以上理化指标均以干基计。1.6 非靶向代谢组学 使用Q-Extractive 超高分辨质谱，按照Zhao 等12 第 53 卷 24的方法进行代谢组学分析。取样品粉末 0.100 g，加15 mL 70%(v/v)乙腈，超声提取 20 min，冷冻离心5 min(10000 rmin1，4)，取上清液，每处理 8个重复，过 0.22 m 有机相微孔滤膜，待测。色谱柱为 AcquityTM UHPLC CSH C18(1.7 m,2.1 mm 100 mm)；柱温 30；流速 0.2 mLmin1；进样体积 5 L。流动相 A 为水(含 0.2%甲酸)，流动相 B 为乙腈(含 0.2%甲酸)；梯度洗脱条件：05 min，2%B；515 min，2%20%B；1530 min，20%80%B；3035 min，80%95%B；3540 min，95%B；4040.1 min，95%2%B；40.145 min，2%B。以正离子扫描模式采集信号，质量扫描范围 1001000 m/z；一级母离子采集分辨率 7 万，二级碎片离子采集分辨率3.5万。质谱数据通过Thermo Xcalibur 2.2 SP2(美国赛默飞世尔科技公司)采集。利用Metaboanalyst 5.0(https:/www.metaboanalyst.ca/)软件进行数据预处理和统计，将质谱数据和峰矫正，根据基于 PLS-DA 模型得到的变量权重值(VIP)和 P 值筛选差异代谢物，以 VIP1.0、P0.01 的代谢物为差异代谢物，并通过京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路数据库进行代谢通路富集分析。1.7 统计方法 采用 SPSS23.0 软件统计分析生长、生理、品质组分数据，用 TBtools 制作聚类热图。采用 ANOVA进行单因素方差分析。Graph Pad Prism 8.0.2 软件作图。2 结果与分析 2.1 植株形态及生长指标差异 两种栽培基质生长30 d和90 d的金线莲外观如图 1 所示。整体上看，水培的叶片大且排列紧凑，而土培叶片小且排列稀疏；叶正面色泽水培较土培浅，在水培 30 d 呈嫩绿色，土培 30 d 呈淡绿色，土培 90 d 呈墨绿色，水培 90 d 呈深绿色；中脉处叶色均较浅，叶背面色泽在水培和土培 30 d 及水培 90 d均呈淡棕绿色，土培 90 d 颜色较深；水培的叶面积和根长明显大于土培，且根的色泽更洁白晶莹剔透。比较金线莲相同栽培方式不同时间(30 d 和 90 d)的茎粗、叶面积、叶厚、根长发现，土培时，仅茎粗未见显著变化，叶面积、叶厚和根长均显著增加；水培时，茎粗显著下降，而叶面积、叶厚和根长的变化趋势与土培基本一致，即显著增加；进一步从变化幅度上看，水培条件下，叶面积和根长的增加幅度都大于土培，而叶厚在两组栽培方式中无明显差异(图 2)。从不同栽培方式的比较来看，培养 30 d后，水培金线莲的根长显著高于土培，而其他指标(茎粗、叶面积、叶厚)均未见显著性差异；栽培 90 d后，水培的茎粗显著低于土培，叶面积和根长则显著高于土培，叶厚无显著差异(图 2)。由此可知，水培在前 30 d 较有效地促进根长增加；90 d 后促进叶面积和根长的增加，但使茎粗下降。2.2 叶绿素和净光合速率变化 从相同栽培方式不同时间(30 d 和 90 d)叶绿素和净光合速率比较来看，土培时，叶绿素含量未见显著变化，而净光合速率显著增加 61.7%；水培时，叶绿素含量显著增加 18.6%，而净光合速率变化趋势与土培相反，显著下降 24.6%(图 3)。从相同栽培时间不同栽培方式间的比较上看，栽培 30 d 后，两种方式的金线莲叶绿素含量未见显著差异，而水培的净光合速率显著高于土培 64.1%；栽培 90 d 后，水培的叶绿素含量显著高于土培20.7%，净光合速率无显著变化。图 1 土培和水培金线莲形态比较(30 d 和 90 d)Fig.1 The morphological comparison of Anoectochilus roxburghii seedlings cultured in soil and water(30 d&90 d)第 1 期 赵 琪等：水培与泥炭土培金线莲生长及代谢差异比较 25 图 2 水培和土培金线莲生长指标比较(30 d 和 90 d)Fig.2 The growth indexes of Anoectochilus roxburghii cultured in hydroponic and soil(30 d&90 d)注：图柱上不同小写字母表示不同处理组间差异显著(P0.05，n=10)，下同。图 3 土培和水培金线莲叶绿素和净光合速率比较(30 d 和 90 d)Fig.3 The chlorophyll and net photosynthetic rates of Anoectochilus roxburghii cultured in soil and water(30 d&90 d)由此可知，水培在第 30 天较有效地增加净光合速率，在第 90 天显著增加叶绿素的积累。2.3 总黄酮和金线莲苷含量变化 从相同栽培方式不同时间(30 d 和 90 d)的金线莲总黄酮、金线莲苷含量变化来看，土培时，总黄酮和金线莲苷含量未见显著变化；水培时，金线莲苷含量显著下降 31.1%，而总黄酮含量无显著变化(图 4)。从金线莲不同栽培方式的总黄酮、金线莲苷含量比较看，水培 30 d 后，金线莲总黄酮、金线莲苷含量相较于土培显著增加；水培 90 d 后总黄酮、金线莲苷含量与土培无显著差异。由此可知，水培 30 d 能有效增加金线莲苷和总黄酮含量。第 53 卷 26 图 4 土培和水培金线莲总黄酮和金线莲苷含量(30 d 和 9 0d)Fig.4 The contents of total flavonoids and chloresin of Anoectochilus roxburghii cultured in soil and water(30 d&90 d)注：图柱上不同小写字母表示不同处理组间差异显著(P1.0 且P0.01 作为筛选差异物的阈值，在30 d 水培和土培间存在163 个差异代谢物，包括42种脂质、29 种碳水化合物、26 种萜类、20 种核苷酸等；在90 d 水培和土培间存在125 个差异代谢物，包括45 种脂质、20 种碳水化合物、20 种核苷酸等(图7)。通过作韦恩图可以获知经 30 d 和 90 d 栽培后，土培和水培中共同的差异代谢物有 76 个(图 8)，其中脂质的占比为最高(Lipids，54%),其次为萜烯类(Terpenoids，14%)。即水培和土培方式主要对金线莲的脂质和萜烯类物质的影响最大。2.5.2 差异代谢物差异代谢物 KEGG 富集分析富集分析 将上述全部差异代谢物(附录)进行 KEGG 富集分析，可深入地探究各代谢通路的差异。结果显示，在栽培 30 d 和 90 d 分别富集到 51 条和 59 条代谢通路，以 Impact 值0.4 为筛选条件，分别进一步聚焦到 8 条和 6 条代谢通路(图 9)，其中极显著富集(P0.01)的差异代谢通路，在第 30 天和 90 天时，两种栽培方式的影响趋势如图 10 所示。综上所述，水培和土培金线莲在不同生长阶段所导致的差异生物代谢通路存在不同，但有两个通路会始终受到影响，即次级代谢物的生物合成和二萜生物合成。图 6 土培和水培金线莲的 PLS-DA 得分图 Fig.6 PLS-DA scores of of Anoectochilus roxburghii cultured in soil and water 注：每个点代表 1 个生物学重复。图 7 土培和水培金线莲差异代谢物分类图 Fig.7 Classification of different metabolites of Anoectochilus roxburghii cultured in soil and water 第 53 卷 28 图 8 土培和水培金线莲差异代谢物韦恩图 Fig.8 Venn diagram of different metabolites of Anoectochilus roxburghii cultured in soil and water 图 9 土培和水培金线莲差异代谢通路富集图(P0.05)Fig.9 Enrichment map of different metabolic pathways of Anoectochilus roxburghii cultured in soil and water(P0.05)图 10 土培和水培金线莲极显著差异代谢通路富集图(P0.01)Fig.10 Enrichment map of highly significant different metabolic pathway of Anoectochilus roxburghii cultured in soil and water(P0.01)第 1 期 赵 琪等：水培与泥炭土培金线莲生长及代谢差异比较 293 讨论 采用 UHPLC-MS/MS 技术对水培和土培的金线莲进行非靶向代谢组学分析，发现水培第 30 天黄酮和黄酮醇的生物合成、油菜素类甾醇的生物合成、次级代谢物的生物合成、二萜类生物合成较土培组均有上调，表明水培在 30 d 内可有效提高黄酮类、脂类等营养物质含量水平。第 90 天水培次级代谢物的生物合成及-亚麻酸代谢上调，二萜生物合成及半乳糖代谢下调，表明水培 90 d 不利于二萜类及糖代谢的积累。3.1 脂类 脂类代谢物对植物生长具有重要调控作用，脂肪酸作为信号转导介质，维护植物生长发育稳态13。类甾醇是一类植物甾体激素，在调节植物叶片上向性和光形态建成等生理过程中具有重要作用14。Li等15认为，内源油菜素甾醇类物质水平的提高可以提高植物光合作用。金线莲水培 30 d 表现出净光合速率显著升高，这说明水培 30 d 油菜素类甾醇生物合成通路极显著上调，进而影响到金线莲生长时的光合作用。在高等植物中，不饱和脂肪酸是膜脂的最主要构成之一，植物的 C18 不饱和脂肪酸的生物合成是基于 3-磷酸甘油的连续酰化，且磷脂酸和二酰甘油为中间体1618。金线莲水培 90 d 表现出叶面积显著增加，这可能是由于水培 90 d 后-亚麻酸通路极显著上调引起的。仇淑芳等19研究表明基质持水量越高，植株株高、叶面积越大；苏开等20研究表明，水培增加株高、茎粗、叶面积等生长指标，这与本研究结果一致，表明水培会促进金线莲的形态建成。3.2 萜类 植物萜类化合物对植物的生长发育至关重要，萜类化合物的化感物质可释放到周围环境中，引起自毒或排斥2122。Fischer 等23认为萜类化合物在高浓度时往往表现为抑制作用，Mattsson 等24研究发现蟛蜞菊中的化感物质在低浓度时不仅对自身有促进作用，对某些其它植物也产生促进作用。本研究发现，水培 90 d 外观形态明显变大，这可能与水培组贝壳杉烯酸、赤霉素 A34、(E,E)-香叶醇等二萜生物合成通路在第 90 天呈极显著下调，进而影响化感物质浓度降低相关。3.3 黄酮和黄酮醇 水培 30 d 黄酮和黄酮醇生物合成通路极显著上调，有 3 种黄酮类差异代谢物(槲皮素、山奈酚、木犀草素)参与此通路。Baek等25研究发现水培生长的小白菜总黄酮含量显著高于土培，Nascimento26的研究结果表明，对比土培，水培会增加甘蓝的总黄酮含量。这些结果与本研究结果一致，表明水培 30 d会增加金线莲总黄酮的含量。4 结论 相较于土培，水培金线莲第 30 天根长、净光合速率、总黄酮、金线莲苷含量有显著提高，-氨基丁酸、天冬氨酸、羟脯氨酸含量下降；第 90 天叶面积、根长、叶绿素含量增加，茎粗、净光合速率、金线莲苷、-氨基丁酸、蛋氨酸、天冬氨酸、天门冬酰胺含量下降。通过代谢组学分析，水培第 30 天黄酮和黄酮醇生物合成、类甾醇、次级代谢、二萜类生物合成通路显著上调，不饱和脂肪酸及糖代谢通路下调；第 90 天不饱和酸及次级代谢生物合成通路极显著上调，二萜生物合成及糖代谢极显著下调。参考文献 1 吕欣锴,周丽思,郭顺星.我国金线兰资源特征及繁育技术研究进展J.药学学报,2022,57(7):20572067.2 福建省食品药品监督管理局编,黄有霖主编.福建省中药材标准M.福州:海风出版社,2006.3 Szekely I,Jijakli M H.Bioponics as a promising approach to sustainable agriculture:A review of the main methods for producing organic nutrient solution for hydroponics J.WATER,2022,14(397523).4 Bergstrand K,Asp H,Hultberg M.Utilizing anaerobic digestates as nutrient solutions in hydroponic production systems J.Sustainability,2020,12(23):112.5 Gonnella M,Renna M.The evolution of soilless systems towards ecological sustainability in the perspective of a circular economy.Is it really the opposite of organic 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