miR-126-5p通过靶向TRAF3抑制糖氧剥夺再灌注介导的HT22细胞凋亡和炎症.pdf

医学分子生物学杂志,2024,21(1):017-024 J Med Mol Biol,2024,21(1):017-024DOI:10.3870/j.issn.1672-8009.2024.01.003资助项目:四川省医学青年创新科研课题计划(No.Q22014)通讯作者:赵磊(电话:[phone],E-mail:)This work was supported by a grant from the Sichuan Provincial Medical Youth Innovation Research Project Plan(No.Q22014)Corresponding author:ZHAO Lei(Tel:[phone],E-mail:)miR-126-5p 通过靶向 TRAF3 抑制糖氧剥夺再灌注介导的 HT22细胞凋亡和炎症赵莉,赵磊,谢艾伶,王亚梅,吴雨娟,唐爽遂宁市中心医院脑血管病科 四川省遂宁市,629000【摘要】目的 探讨 miR-126-5p 通过靶向肿瘤坏死因子受体相关因子3(tumor necrosis factor receptor-asso-ciated factor 3,TRAF3)对糖氧剥夺再灌注(oxygen-glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)介导的小鼠海马神经元细胞 HT22 细胞凋亡和炎症的影响。方法 模拟缺血/再灌注损伤(ischemia/reperfusion,I/R)损伤在体外建立氧糖剥夺/复氧(oxygen-glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)细胞模型,分析 miR-126-5p与 TRAF3 靶向关系及对 HT22 细胞凋亡和炎症反应的影响。结果 与对照组比较,OGD/R 组中 miR-126-5p下调而 TRAF3 mRNA 及蛋白水平上调,细胞存活率及 Bcl-2 蛋白水平降低,乳酸脱氢酶(lactate dehydro-genase,LDH)释放量、细胞凋亡率、Bax 及 Cleaved caspase-3 蛋白水平升高(P均 0.05)。与 OGD/R+mimic-NC 组比较,OGD/R+miR-mimic 组、OGD+miR-mimic+pcDNA 组 TRAF3 蛋白水平、LDH 释放量、细胞凋亡率、Bax 及 Cleaved caspase-3 蛋白水平明显降低,细胞存活率及 Bcl-2 蛋白水平升高,而 OGD+miR-mimic+pcDNA-TRAF3 组各指标升高,细胞存活率明显下降(P均0.05)。结论 miR-126-5p 通过靶向TRAF3,抑制 OGD/R 介导的 HT22 细胞凋亡和炎症反应,从而对神经元细胞发挥保护作用。【关键词】microRNA-126-5p;糖氧剥夺再灌注;肿瘤坏死因子受体相关因子 3;细胞凋亡;炎症;神经元【中图分类号】R741.02,R587.1miR-126-5p Inhibits Oxygen-glucose Deprivation/Reperfusion Media-ted Apoptosis and Inflammatory Response in HT22 Cells by TargetingTRAF3ZHAO Li,ZHAO Lei,XIE Ailing,WANG Yamei,WU Yujuan,TANG ShuangDepartment of Cerebrovascular Diseases,Suining Central Hospital,Suining,Sichuan,629000,China【Abstract】ObjectiveTo explore the effect of miR-126-5p on apoptosis and inflammatory re-sponse in mouse hippocampal neuron HT22 cells mediated by oxygen-glucose deprivation/reperfu-sion(OGD/R)by targeting tumor necrosis factor receptor-associated factor 3(TRAF3).Methods The OGD/R cell model was established in vitro by simulating ischemia/reperfusion(I/R)inju-ry.The targeting relationship between miR-126-5p and TRAF3 and the effect of miR-126-5p on apop-tosis and inflammatory response in HT22 cells were analyzed.Results The level of miR-126-5p inthe OGD/R group was down-regulated while the mRNA and expression levels of TRAF3 were up-regulated when compared with those in the control group.The cell survival rate and the Bcl-2 expres-sion level in the OGD/R group were decreased while the lactate dehydrogenase(LDH)release,the apoptosis rate and the protein expression levels of Bax and cleaved caspase-3 in the OGD/Rgroup were increased when compared with those in the control group(all P0.05).The protein ex-pression levels of TRAF3,Bax and cleaved caspase-3,the LDH release,the apoptosis rate weresignificantly decreased in the OGD/R+miR-mimic group and the OGD+miR-mimic+pcDNA groupwhile the cell survival rate and the protein expression level of Bcl-2 were increased when comparedwith those in the OGD/R+mimic-NC group.In addition,the above indicators were elevated in theOGD+miR-mimic+pcDNA-TRAF3 group while the cell survival rate was significantly lowered whencompared with those in the OGD/R+mimic-NC group(all P 0.05).ConclusionmiR-126-5pcan inhibit the OGD/R-mediated apoptosis of and inflammatory response in HT22 cells by targetingTRAF3,thus playing a protective role on neuronal cells.【Key words】microRNA-126-5p;oxygen-glucose deprivation/reperfusion;tumor necrosis factorreceptor-associated factor 3;cell apoptosis;inflammation;neuron 神经元作为神经系统的基本单元,具有接收、处理和传递信息的功能,对缺氧缺血较为敏感,长时间的缺氧缺血会严重影响神经元的功能,引起神经系统功能紊乱和损伤1。再灌注是一种治疗缺氧缺血的有效手段,通常通过静脉注射补液、输血等方法来恢复血流量2。虽然再灌注可以帮助保护神经元,但治疗过程中大量血液进入脑组织,可能会引起再灌注损伤2。缺血再灌注与脑梗死病理生理密切相关,同时可以引起神经化学、生物化学和电生理等反应,最终导致细胞死亡和脑组织的病变3。如何有效弥补因脑缺血而导致的神经元损伤,以及缓解在再灌注过程中可能产生的氧化应激和神经炎症已成为众多学者的研究目标4。近年来,在脑缺血再灌注治疗中,分子靶向治疗技术已经取得了不错的进展4,其治疗方法包括针 对 特 定 分 子 或 途 径 的 药 物5。microRNAs(miRNAs)是一类长度为 22 25 个核苷酸的短RNA 分子,通过与基因转录的 mRNA 分子的 3非翻译区(3 untranslated regions,3UTR)互补配对来影响基因的后转录调控5-6。如吴亚琨等7研究表明 miR-30a 可通过靶向调控 Keap1 缓解大鼠脑缺血再灌注损伤。miR-126-5p 是一种非编码 miRNA,miR-126-5p 的调控与多种疾病相关,如心血管疾病、肿瘤等8。近年来,有研究表明 miR-126-5p在脑缺血再灌注损伤中可发挥一定的保护作用。例如,刘洋等9研究报道上调 miR-126 表达可缓解脑缺血再灌注大鼠的脑损伤。miR-126-5p 过表达可降低缺血性脑卒中后促炎细胞因子和黏附分子的表达,减轻局部炎症反应,减轻脑卒中后血脑屏障的破坏。肿瘤坏死因子受体相关因子 3(tumor necro-sis factor receptor-associated factor 3,TRAF3)是一种炎症相关因子,可激活丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)和核因子 B(nuclear factor-kappa B,NF-B)信号通路,促进神经元凋亡,但目前有关 miR-126-5p 对脑缺血再灌注损伤的调控作用及与 TRAF3 的关系和分子机制还有待研究。氧糖 剥 夺/复 氧(oxygen-glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)是一种常见的缺血缺氧细胞模型,用于模拟缺血再灌注的情况,该模型主要用于探究神经细胞损害机制的研究。本研究中,我们选择小鼠海马神经元细胞系 HT22 作为实验对象,通过模拟缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤。损伤在体外建立 OGD/R 细胞模型,探讨miR-126-5p 对糖氧剥夺再灌注介导的 HT22 细胞凋亡和炎症的影响机制,以期为缺血再灌注脑损伤的治疗提供靶点。1 材料与方法1.1 药物与试剂HT22 细胞购自科佰生物公司;乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)试 剂 盒(货 号:ml094790)购自酶联生物公司;胎牛血清(货号:WS500T)购自缔一生物公司;四甲基偶氮唑盐(货 号:8028)购 自 西 安 百 萤 生 物 有 限 公 司;DMEM 培养基(货号:10569-010)购自浙江硕烨医疗器械有限公司;细胞计数试剂盒 8(CellCounting Kit-8,CCK8)试 剂 盒(货 号:E-CK-A362)购自 Elabscience 公司;凋亡试剂盒(货号:40302 ES20)购自翌圣生物公司;逆转录试剂盒(货号:K1622)购自北京智杰方远公司;荧光定量 RT-qPCR 试剂盒(货号:RT0411-01)购自杭州主诺生物公司;双荧光素酶检测试剂盒(货号:11402ES80)购自翊圣生物公司;miR-126-5p 模拟体和空载质粒购自上海吉玛制药技术有限公司;胰酶(货号:8129-46-7)购自武汉荣灿生物科技有限公司;GADPH 抗体(货号:JN22870)购自纪宁生物有限公司、肿瘤坏死因子受体相关因子 3(tumor necrosis factor receptor-associated factor 3,TRAF3)抗体(货号:PAB12954)购自艾美捷科技公司;Bax 抗体(货号:3032-100)以及山羊抗兔二抗购自齐源生物公司;cleaved caspase-3 抗体(货号:9664)购自优宁维生物公司;Bcl-2 抗体(货号:YLS-K0078)购自翊立飒生物公司。pcD-NA3.1-TRAF3 购自吉满生物;pGL3 质粒购自伯远生物公司;GADPH 内参引物(货号:B661104-0001)均购自上海生工生物工程有限公司。脂质体转染试剂 Lipofectamine 2000(货号:GK20005)购自 GlpBio 公司;二甲基亚砜(货号:D2650)购自上海卡迈舒生物科技有限公司;磷酸缓冲盐溶液81赵莉,等.miR-126-5p 通过靶向 TRAF3 抑制糖氧剥夺再灌注介导的 HT22 细胞凋亡和炎症(phosphate-buffered saline,PBS)(货号:180327)购自武汉普诺赛生命科技有限公司。1.2 仪器MCO-5AC CO2培养箱购自山东欧莱博医疗器械有限公司;MH-2 型微型振荡仪购自广州越特科学仪器有限公司;DYCP-31DN 电泳仪购自北京鑫诺宸仪器仪表有限公司;TE70XP 半干电转膜仪购自美国 hoefer 公司;ZF-258 凝胶成像仪购自嘉鹏仪器设备公司;RT-qPCR 仪购自济南千司生物技术有限公司;HBS-1096B 酶标仪购自南京德铁实验设备有限公司;Attune 流式细胞仪购自赛默飞公司。1.3 细胞培养及诱导 OGD/R 模型将 HT22 细胞在 DMEM 培养基中培养,添加10%的胎牛血清,1%的青霉素和链霉素混合抗生素,置于 37 5%CO2的培养箱中培养。采用胰酶对细胞进行消化传代。本研究中以对数期的细胞作为实验对象,构建 OGD/R 模型。具体方法如下10:采用 PBS 清洗细胞,然后将细胞转入不含糖的 DMEM 培养基,并置入氧含量为 1%、二氧化碳含量为 5%、氮气含量为 94%的培养箱中进行培养,持续 6 h。随后,将细胞置于常规 DMEM培养基中,并放入 CO2培养箱中生长,持续 24 h。OGD/R 构建结束后,HT22 细胞存活率明显下降,HT22 细胞的形态发生明显改变,如细胞体积缩小、细胞变圆或向外突出。这些结果表明建模成功10。1.4 细胞分组与转染取正常培养的 HT22 细胞作为对照组,另取未经转染的 OGD/R 诱导的 HT22 细胞作为 OGD/R组。在构建 OGD/R 模型前,将 NC-mimic、miR-126-5p mimic、miR-126-5p inhibitor、NC-inhibitor、NC-pcDNA、pcDNA-TRAF3使 用Lipofectamine2000 Reagent 转染到 HT22 细胞中,分别作为 mim-ic-NC 组、miR-mimic 组、miR-inhibitor 组、inhibi-tor-NC 组、pcDNA 组、pcDNA-TRAF3 组。然后按上述操作将 NC-mimic、miR-126-5p mimic、miR-126-5p mimic+pcDNA、miR-126-5p mimic+pcDNA-TRAF3 进行转染后,构建 OGD/R 模型,分别作为OGD/R+mimic-NC 组、OGD/R+miR-mimic 组、OGD+miR-mimic+pcDNA 组、OGD+miR-mimic+pcDNA-TRAF3 组。1.5 RNA 分离以及 RT-qPCR 检测根据制造商说明,通过 RNA 提取试剂盒对待测细胞进行 RNA 分离提取,并依照说明书逆转录得到 cDNA 链。通过 RT-qPCR 仪以 cDNA 链为模板进行扩增。反应条件如下:94 4 min;94 32s,62 32 s,75 3 min,共40 个循环。基因表达值以 2-Ct法11计算,GAPDH 作为内参基因。引物 序 列 如 下:miR-126-5p 正 向 序 列:5-GG-TATAATCCGCCGCTTAGCTGCC-3,反向序列:5-GTGCAGGGTTGCAAGGT-3;TRAF3 正向序列:5-CAGTGTGGTGGAATTCATGGACACCAGTAAGAAG-ACA-3,反向序列:5-AACGGGCCCTCTAG-ACTC-GAGTCAGGGGTCTGGTAGATCCGA-3;GAPDH 正向 序 列:5-CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC-3,反 向序列:5-GCGCCCAATACGACCAAATC-3。1.6 蛋白质印迹检测 TRAF3 及凋亡相关蛋白水平取各组 H22 细胞,在 4 下离心 10 min,加入裂解液裂解后,加入 Loading Buffer 缓冲液,选择蛋白质定量法(波长为 562 nm)检测各组蛋白含量,进行灌胶上样操作。取适量样本与 SDS 样品缓冲液混合,加热煮沸 5 min,然后离心后取上清液,进行电泳分离。根据胶的大小剪取模和滤纸,在转膜前,先用甲醇浸泡 PVDF 膜 3 s,然后选择半干法转到 PVDF 膜。将膜置于封闭缓冲液中1 h,在室温下进行摇动以封闭。加入一抗 TRAF3、cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2 和 GADPH(1 1 000)在4 下过夜,加入 IgG 二抗(12 000),37 下孵育1 h,取出胶片,浸入显色液中 1 min,清洗后定影,并通过 Image-ProPlus 软件进行分析,以 GADPH(11 000)为内参,计算各蛋白的相对水平。1.7 CCK8 法检测细胞存活率转染 48 h 后,向每个孔中添加 10 L CCK8,并置于避光的恒温培养箱中培养 2 h。然后,通过酶标仪在 450 nm 波长下测量每个孔的吸光度(A)值,并计算每个组的平均 A 值。最后,计算细胞的存活率12。1.8 特异性细胞毒性试剂盒检测 HT22 细胞 LDH 的释放量从细胞培养箱中取出细胞板,加入试剂盒中的LDH 释放试剂,加入量为原有培养液体积的 10%,加入 LDH 释放试剂后,反复吹打数次混匀,然后继续孵育 24 h。到达预定时间后,将培养板离心 5min,分别取各孔的上清液,加入新的 96 孔板中,检测样品的 LDH 释放量。1.9 流式细胞仪检测细胞凋亡率在转染后,将细胞放置在 37 和 5%CO2的培养箱中培养 48 h,然后收集每个培养孔上清液,对细胞消化后加入 100 攟L 二甲基亚砜和 20 攟L PI,并在避光的情况下进行 37 反应 20 min。最后使用流式细胞仪检测细胞凋亡率。91医学分子生物学杂志,2024,21(1):017-024 J Med Mol Biol,2024,21(1):017-0241.10 生物信息学分析及双荧光素酶报告实验基于 TargetScan 生物信息学工具的分析发现,TRAF3 基因的 3-UTR 区域存在可被 miR-126-5p 结合的靶向序列。为了进一步验证该结论,将包含野生型和突变型 miR-126-5p 靶向序列的 TRAF3 mR-NA 序列分别克隆至 pGL3 质粒中,分别命名为pGL3-TRAF3 和 pGL3-TRAF3-mut。使用细胞培养技术,将上述质粒和模拟物转染至细胞中。在转染后 48 h,采用双荧光素酶实验测定荧光素酶活性。1.11 统计学分析采用 SPSS 17.0 对数据进行分析。作图通过GraphPadPrism5 软件。所有的数据用 x s 表示。两组间的比较通过 t 检验,多组间比较采用单因素方差分析检验。2 结果2.1 miR-126-5p 和 TRAF3 在 OGD/R 细胞模型中的表达量RT-qPCR 结果显示,与对照组比较,各组miR-126-5p 表达量均降低,TRAF3 mRNA 表达量均显著性升高(P 0.05)。蛋白质印迹结果显示,与对照组比较,各组 TRAF3 蛋白水平均显著性升高(P 0.05)(图 1),表明 OGD/R 损伤可导致HT22 细胞 miR-126-5p 表达量降低,而 TRAF3 mR-NA 表达量、TRAF3 蛋白水平升高。A:miR-126-5p 在对照组及 OGD/R 组中的相对表达量;B:TRAF3 mRNA 在对照组及 OGD/R 组中的相对表达量;C:TRAF3 在对照组及 OGD/R 组中蛋白水平。1:对照组;2 5:分别为 OGD/R 6 h、12 h、24 h、48 h 组。与对照组比较,P0.05。图 1 各组 miR-126-5p 及 TRAF3 表达量2.2 miR-126-5p 过表达促进 OGD/R 诱导的 HT22 细胞生长RT-qPCR 结果显示,与对照组比较,miR-126-5p 在 OGD/R 组中显著下调(P 0.05),说明OGD/R 损伤可导致 HT22 细胞 miR-126-5p 表达降低;与 OGD/R 组比较,miR-126-5p 在 OGD/R+miR-mimic 组中显著上调(P0.05),说明在转染miR-126-5p-mimic(即 miR-126-5p 过表达)可促进HT22 细胞 miR-126-5p 表达。CCK-8 结果显示,与对照组比较,OGD/R 组的细胞存活率显著下降(P 0.05);与 OGD/R 组比较,OGD/R+miR-mimic 组的细胞存活率显著升高(P0.05),说明OGD/R 损伤可降低 HT22 细胞存活率,而转染miR-126-5p-mimic(即 miR-126-5p 过表达)可提高HT22 细胞存活率。特异性细胞毒性试验结果表明,与对照组比较,OGD/R 组的 LDH 释放量显著升高(P 0.05);与 OGD/R 组比较,OGD/R+miR-mimic 组的 LDH 释放量显著下降(P 0.05)(图2),说明 OGD/R 损伤可导致 HT22 细胞 LDH 释放量升高,而转染 miR-126-5p-mimic(即 miR-126-5p过表达)抑制 HT22 细胞 LDH 释放。A:miR-126-5p 相对表达量;B:细胞存活率;C:LDH 释放量。1:对照组;2:OGD/R 组;3:OGD/R+mimic-NC 组;4:OGD/R+miR-mimic 组。与对照组比较,P0.05;与 OGD/R 组比较,#P0.05。图 2 各组细胞存活率及 LDH 释放量2.3 miR-126-5p 过表达逆转 OGD/R 诱导的细胞凋亡流式细胞术结果表明,与对照组比较,OGD/R 组的细胞凋亡率显著上升(P0.05);与 OGD/R 组比较,OGD/R+miR-mimic 组的细胞凋亡率显02赵莉,等.miR-126-5p 通过靶向 TRAF3 抑制糖氧剥夺再灌注介导的 HT22 细胞凋亡和炎症著下降(P 0.05),说明转染 miR-126-5p(即miR-126-5p 过表达)可降低细胞凋亡率。凋亡相关蛋白检测结果显示,与对照组比较,OGD/R 组 Bcl-2蛋白水平显著下调(P 0.05),而 Bax 及 cleavedcaspase-3 蛋白水平明显上调(P0.05);与 OGD/R组比较,OGD/R+miR-mimic 组的 Bcl-2 蛋白水平明显上调,而 Bax 及 cleaved caspase-3 蛋白水平明显下调(P 0.05)(图 3),说明转染 miR-126-5p(即miR-126-5p 过表达)可促进细胞 Bcl-2 蛋白分泌,而降低 Bax 及 cleaved caspase-3 蛋白水平。A:细胞凋亡率;B:细胞凋亡蛋白水平。1:对照组;2:OGD/R 组;3:OGD/R+mimic-NC 组;4:OGD/R+miR-mimic 组。与对照组比较,P0.05;与 OGD/R 组比较,#P0.05。图 3 各组细胞凋亡情况2.4 miR-126-5p 靶向调控 TRAF3靶基因预测发现,TRAF3 和 miR-126-5p 之间存在互补配对的碱基,说明 miR-126-5p 可靶向调控 TRAF3。RT-qPCR 结果显示,与 mimic-NC 比较,miR-mimic 组中 miR-126-5p 表达量显著上调(P 0.05),与 inhibitor-NC 组比较,miR-inhibitor组中 miR-126-5p 表达量显著下调(P 0.05)。双荧光素酶报告结果显示,共转染后,野生型纯合子TRAF3 的荧光素酶活性显著降低(P 0.05)。此外,RT-qPCR 结果显示,与 mimic-NC 组比较,miR-mimic 组中 TRAF3 mRNA 表达量显著下降(P 0.05),与 inhibitor-NC 组比较,miR-inhibitor 组 TRAF3 mRNA 表达量显著上升(P0.05)(图 4)。说明 miR-126-5p 过表达可导致TRAF3 mRNA 表达量降低。A:生物信息学预测 TRAF3 是 miR-126-5p 的靶标;B:miR-126-5p 相对表达量;C:双荧光素酶报告实验显示TRAF3 是 miR-126-5p 的靶标;D:TRAF3 mRNA 表达量。1:对照组;2:mimic-NC 组;3:inhibitor-NC 组;4:miR-inhibitor 组。与对照组比较,P0.05,与 inhibitor-NC 组比较,#P0.05,与 mimic-NC 组 TRAF3 MUT 比较,&P 0.05),pcDNA-TRAF3 组 TRAF3 mRNA 表达量显著升高(P 0.05);蛋白质印迹结果显示,与 OGD/R+mimic-NC 组比较,TRAF3 蛋白量在 OGD/R+miR-mimic 组、OGD+miR-mimic+pcDNA 组均显著下12医学分子生物学杂志,2024,21(1):017-024 J Med Mol Biol,2024,21(1):017-024调(P0.05);与 OGD+miR-mimic 组比较,OGD+miR-mimic+pcDNA-TRAF3 组 TRAF3 蛋白量显著上升(P0.05)。CCK-8 结果显示,与 OGD/R+mimic-NC 组比较,OGD/R+miR-mimic 组以及 OGD+miR-mimic+pcDNA 细胞存活率显著升高(P0.05);与 OGD/R+miR-mimic 组比较,OGD+miR-mimic+pcDNA-TRAF3 组细胞存活率显著降低(P 0.05),说明TRAF3 mRNA 过表达可导致细胞存活率降低。LDH结果显示,与 OGD/R+mimic-NC 组比较,OGD/R+miR-mimic 组以及 OGD+miR-mimic+pcDNA 组细胞 LDH 释放量显著降低(P0.05),与 OGD/R+miR-mimic 组 比 较,OGD+miR-mimic+pcDNA-TRAF3 组 LDH 释放量显著升高(P 0.05)(图5)。说明 TRAF3 mRNA 过表达可导致 LDH 释放量显著升高。A:转染效率的验证;B:TRAF3 蛋白水平;C:细胞存活率;D:细胞 LDH 释放量。1:对照组;2:pcDNA 组;3:pcDNA-TRAF3 组;4:OGD/R+mimic-NC 组;5:OGD+miR-mimic 组;6:OGD/R+miR-mimic+pcDNA 组;7:OGD+miR-mimic+pcDNA-TRAF3 组。与对照组比较,P 0.05;与 OGD/R+mimic-NC 组比较,P 0.05;与 OGD/R+miR-mimic组比较,#P0.05。图 5 miR-126-5p 靶向 TRAF3 促进 HT22 细胞生长2.6miR-126-5p 靶向 TRAF3 逆转 OGD/R 诱导的 HT22细胞凋亡 流式细胞术结果显示,与 OGD/R+mimic-NC组 比 较,OGD/R+miR-mimic 组 以 及 OGD+miR-mimic+pcDNA 组细胞凋亡率显著下降(P0.05)(图6);与OGD+miR-mimic 组比较,OGD+miR-mim-ic+pcDNA-TRAF3 组细胞凋亡率显著上升(P0.05),说明TRAF3 mRNA 过表达可导致细胞凋亡率升高。A:细胞凋亡率;B:细胞凋亡蛋白水平。1:OGD/R+mimic-NC 组;2:OGD+miR-mimic 组;3:OGD/R+miR-mimic+pcDNA 组;4:OGD+miR-mimic+pcDNA-TRAF3 组。与 OGD/R+mimic-NC 组比较,P 0.05;与 OGD/R+miR-mimic 组比较,#P0.05。图 6 miR-126-5p 靶向 TRAF3 抑制 HT22 细胞凋亡 WB 结果显示,与 OGD/R+mimic-NC 组比较,OGD/R+miR-mimic 组以及 OGD+miR-mimic+pcDNA 组 Bcl-2 的表达量显著上升(P0.05),而cleaved caspase-3、Bax 表 达 量 显 著 下 降(P 0.05);与 OGD+miR-mimic 组比较,OGD+miR-mimic+pcDNA-TRAF3 组 Bcl-2 的表达量显著下降22赵莉,等.miR-126-5p 通过靶向 TRAF3 抑制糖氧剥夺再灌注介导的 HT22 细胞凋亡和炎症(P0.05),而 cleaved caspase-3、Bax 表达量显著上升(P 0.05),说明 TRAF3 mRNA 过表达可导致 Bcl-2 表达量降低,cleaved caspase-3、Bax 表达量升高。3 讨论miR-126-5p 是一种由 miR-126 前体 RNA 基因细胞内加工剪切产生的成熟 miRNA。近年来的研究表明,miR-126 是维持血管完整性最重要的 miR-NA 之一,在脑缺血再灌注后的神经保护中发挥重要作用12。miR-126-5p 过表达可降低缺血性脑卒中后促炎细胞因子和黏附分子的表达,减轻脑卒中后血脑屏障的破坏13。TRAF3 是一种调节细胞凋亡、免疫应答和炎症反应的信号转导蛋白,与脑缺血再灌注和神经元有着紧密的关系14。LDH 是一种存在于体内细胞内的酶,其主要作用是将储存在细胞内的乳酸氧化成丙酮酸,并在能量代谢过程中起重要作用15。当身体发生炎症反应时,组织受损会导致细胞破裂,并释放出 LDH 等细胞内酶和蛋白质等成分,导致 LDH 水平升高16。因此,LDH 在体内的水平可以反映细胞破坏的程度和炎症反应的严重程度。本研究结果显示,miR-126-5p在 OGD/R 模型中下调而 TRAF3 上调,提示 miR-126-5p 在脑缺血再灌注的损伤中起保护作用。全脑缺血和局灶性脑缺血后血管完整性降低,而影响miR-126-5p 表达,进而可加重了神经元的死亡。对HT22 细胞中 miR-126-5p 行过表达处理后 HT22 细胞存活率显著升高,而 LDH 释放量和细胞凋亡率显著降低,且 OGD/R 诱导的 Bcl-2 蛋白水平降低,Bax、cleaved caspase-3 蛋白水平升高被逆转。这一结果提示 miR-126-5p 过表达处理减轻了 OGD/R 诱导的神经细胞凋亡及细胞损伤引起的炎症反应。结合 miR-126-5p 与 TRAF3 在 HT22 细胞差异表达的结果,我们推测 miR-126-5p 与 TRAF3 可能存在靶向调控性,通过生物信息站靶基因分析发现 miR-126-5p 与 TRAF3 存在结合位点;此外,双荧光素酶报告试验结果表明 miR-126-5p 与 TRAF3 靶向结合。同时,RT-qPCR 结果显示,miR-126-5p 过表达后 HT22 细胞 TRAF3 相对表达量显著降低,而敲低 miR-126-5p 后,TRAF3 水平降低被逆转。这些证据表明,miR-126-5p 可以靶向 TRAF3 从而降低 TRAF3 表达量,为后续研究奠定一定的理论基础。本研究在 OGD/R 诱导的 HT22 细胞中 miR-126-5p 低表达,而 TRAF3 高表达,且 miR-126-5p与 TRAF3 存在靶向结合片段,由此我们推测 miR-126-5p 可能通过负向调控 TRAF3,抑制糖氧剥夺再灌注介导的 HT22 细胞凋亡和炎症反应。为验证此猜想,设计了 TRAF3 回复实验显示 miR-126-5p 过表达对 TRAF3 表达的抑制作用又被 TRAF3 上调重新激活,且上调 TRAF3 后,miR-126-5p 过表达对HT22 细胞存活率,LDH 释放量和细胞凋亡率的影响也被逆转。LDH 作为一种重要的细胞质酶,其在 I/R 损伤过程中会被释放到细胞外,导致细胞死亡和炎性反应的加剧而 TRAF3 可以通过抑制 NF-B 通路等途径来抑制 LDH 的释放,从而减轻炎症反应和细胞死亡17。同时,TRAF3 还可以抑制MAPK 途径的活化,降低细胞凋亡的水平,使细胞更加抵抗 I/R 损伤。基于此,我们推测 miR-126-5p通过 靶 向 TRAF3,降 低 TRAF3 表 达 量,进 而MAPKs 和 NF-B 信号通路被抑制,从而减轻炎症反应以及减少神经元细胞的凋亡。综上所述,miR-126-5p 可以靶向结合 TRAF3基因,从而抑制 OGD/R 诱导的 HT22 细胞凋亡和炎症反应。但关于其具体作用机制还有待更深入探索与分析。参考文献1 GU S S,KANG X W,WANG J,et al.Effects of extracellu-lar vesicles from mesenchymal stem cells on oxygen-glu-cose deprivation/reperfusion-induced neuronal injuryJ.World J Emerg Med,2021,12(1):61-67.2 张印松,李光杰,相毅.甘草酸通过抑制自噬对脑缺血再灌注后神经元损伤的保护作用J.医学分子生物学杂志,2023,20(3):227-231.3 高蓓瑶,许东升,谢蓓菁,等.改良强制性运动调节脑缺血再灌注模型大鼠运动皮层内神经递质水平的研究J.四川大学学报:医学版,2020,51(5):611-617.4 庞鹏飞,冯达云,黄涛,等.氧化槐果碱上调 Nrf2/HO-1/NQO1 通路及抑制 NF-B 的活化缓解脑缺血再灌注大鼠氧化损伤和炎性反应J.医学分子生物学杂志,2020,17(2):85-90.5 詹舒仪,黄露露,龙思齐,等.丹参乙酸镁通过抑制TGF-途径减轻脑缺血/再灌注损伤的保护作用及机制J.转化医学杂志,2019,8(1):6-10.6 曾克武.中药化学生物学驱动的天然活性分子抗脑缺血新靶点发现J.中国药理学与毒理学杂志,2021,35(10):802-807.7 吴亚琨,姚佳,冯凯.MiR-30a 靶向 Keap1 缓解大鼠脑缺血再灌注损伤的机制研究J.中国医师杂志,2021,23(1):63-67.8ABDALLAH H Y,FAREED A,ABDELMAOGOOD A KK,et al.Introducing circulating vasculature-related tran-scripts as biomarkers in coronary artery diseaseJ.MolDiagn Ther,2023,27(2):243-259.9刘洋,孟玲玲,程济玲.汉防己甲素调节 miR-126/VEGF 表达对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑损伤的保护作用J.武警后勤学院学报(医学版),2019,28(2):32医学分子生