LINC00319调控PENK调节PI3K_AKT信号通路在骨肉瘤中的机制研究.pdf

医学分子生物学杂志,2024,21(3):247-253 J Med Mol Biol,2024,21(3):247-253DOI:10.3870/j.issn.1672-8009.2024.03.009资助项目:南通市卫健委课题(No.MB2021023)通讯作者:张海平(电话:[phone],E-mail:)This work was supported by a grant from the Health Commission Program of Nantong(No.MB2021023)Corresponding author:ZHANG Haiping(Tel:[phone],E-mail:)LINC00319 调控 PENK 调节 PI3K/AKT 信号通路在骨肉瘤中的机制研究夏非,张海平南通大学第二附属医院(南通市第一人民医院)手外科 江苏省南通市,226000【摘要】目的 探讨 LINC00319 调控前脑啡肽(proenkephalin,PENK)调节 PI3K/AKT 信号通路在骨肉瘤(osteosarcoma,OS)中的机制。方法 提取 OS 患者及非 OS 患者外周血 RNA,qPCR 法检测 LINC00319及 PENK 表达水平,分析 LINC00319 与 PENK 相关性。在 MG63 细胞中敲低或过表达 LINC00319,qPCR 及蛋白质印迹法分别检测 PENK 的 mRNA 及蛋白表达。OS 小鼠移植瘤模型分为 shNC 组及 shLINC00319 组,称量肿瘤重量,免疫组化实验检测肿瘤组织中 PENK、AKT、p-AKT、PI3K 的表达。MG63 细胞分为 shNC组、shLINC00319 组、shLINC00319+shPENK 组,EdU 法检测细胞增殖,Transwell 法检测细胞侵袭,蛋白质印迹法检测 AKT、p-AKT、PI3K 蛋白表达水平。结果 相较非 OS 患者,LINC00319 在 OS 患者外周血高表达,PENK 在 OS 患者外周血低表达,PENK 与 LINC00319 表达呈负相关。敲低 LINC00319 后,PENK mR-NA 及蛋白水平上调,过表达 LINC00319 后,PENK mRNA 及蛋白水平下调。相较于 shNC 组,shLINC00319组小鼠肿瘤重量降低,肿瘤组织中 AKT 蛋白表达水平不变,p-AKT 蛋白表达水平降低,PI3K 蛋白表达水平降低。相较于 shNC 组 MG63 细胞,shLINC00319 组细胞增殖与侵袭能力降低,p-AKT、PI3K 蛋白表达水平下降;相较于 shLINC00319 组细胞,shLINC00319+shPENK 组细胞的增殖与侵袭能力以及 p-AKT、PI3K蛋白的表达水平均有所升高。结论 LINC00319 在 OS 患者外周血高表达,PENK 在 OS 患者外周血低表达,两者表达呈负相关性。LINC00319 的高表达通过抑制 PENK 水平,进而激活 PI3K/AKT 信号通路促进 OS 细胞增殖及细胞侵袭。【关键词】骨肉瘤;LINC00319;PENK;PI3K/Akt【中图分类号】R737.9Mechanism of LINC00319 Regulating PENK/PI3K/AKT SignalingPathway in OsteosarcomaXIA Fei,ZHANG HaipingDepartment of Hand Surgery,Second Affiliated Hospital of Nantong University(Nantong First Peo-ples Hospital),Nantong,Jiangsu,226000,China【Abstract】Objective To explore the mechanism of LINC00319 regulating PENK/PI3K/AKTsignal pathway in osteosarcoma(OS).Methods The expression levels of LINC00319 and PENK inthe peripheral blood RNAs from OS patients and non-OS patients were detected using qPCR,andthe correlation between LINC00319 and PENK expression were analyzed.Knockdown or overexpres-sion of LINC00319 were performed in the MG63 cells,and the mRNA and protein expression levelsof PENK were detected using qPCR and Western blotting methods,respectively.The mouse OStransplanted tumor model was established and mice were divided into 2 groups:shNC group andshLINC00319 group.The tumor weight was measured,and the expression levels of PENK,AKT,p-AKT,and PI3K in the tumor tissues were detected through immunohistochemistry experi-ments.MG63 cells were divided into 3 groups:shNC group,shLINC00319 group,shLINC00319+shPENK group.Cell proliferation was detected by EdU.Cell invasion was detected via transwellmethod.The protein expression levels of AKT,p-AKT,and PI3K were detected using Westernblotting.Results The expression level of LINC00319 was higher in the peripheral blood of OS pa-tients,and the expression level of PENK was lower when compared to those in the peripheral bloodof non-OS patients.The expression level of PENK was negatively correlated with the expression levelof LINC00319.After knocking down LINC00319,PENK mRNA and protein levels were upregulat-ed,while overexpression of LINC00319 resulted in decreased expression level of PENK mRNA andprotein.Compared to mice in the shNC group,mice in the shLINC00319 group showed decreasedtumor weight,unchanged expression level of AKT protein in tumor tissues,and deceased expres-sion levels of p-AKT,PI3K protein.Compared to cells in the shNC group,MG63 cells in theshLINC00319 group showed decrease abilities in cell proliferation and invasion,the expression lev-els of p-AKT and PI3K proteins were decreased in the shLINC00319 group as well.Cells in theshLINC00319+shPENK group showed increase abilities in cell proliferation and invasion,and theexpression levels of p-AKT and PI3K proteins were increased when compared to those in theshLINC00319 group.Conclusion LINC00319 is highly expressed in the peripheral blood of OS pa-tients,while PENK is lowly expressed in the peripheral blood of OS patients,and their expressionlevels are negatively correlated.LINC00319 promotes OS cell proliferation and invasion by inhibitingPENK levels and activating the PI3K/AKT signaling pathway.【Key words】osteosarcoma;LINC00319;proenkephalin;PI3K/Akt 骨肉瘤(osteosarcoma,OS)是一种间充质起源的比较常见的骨恶性肿瘤1-2。以肿瘤细胞直接分化形成类骨组织或未成熟骨为特征3,约占儿童骨肿瘤的 60%4。传统的治疗策略主要包括多药物化疗和广泛手术切除5。然而,这些治疗方案对 OS 进展的抑制作用是有限的。OS 患者的中位生存时间为 13 个月,2 年和 5 年生存率分别为44%和 20%6。因此,迫切需要更全面的揭示OS 的发病分子调控机制,以助于其早期诊断和有效治疗。长链非编码 RNA(lncRNA)是一种大于200 核苷酸的没有蛋白质编码效力的 RNA7。尽管一直在探索 OS 的机制,但 lncRNA 在基因组中普遍存在转录现象,但较之 mRNA 往往表达水平比较低,而 OS 发展背后的 lncRNA 的分子机制尚不清楚。而 LINC00319 作为 lncRNA 家族中的一种,目前已证实在膀胱癌、宫颈癌和胃癌中有重要作用8-10。并且研究表明 LINC00319 在 OS 中高表达可促 进 OS 进 展11。前 脑 啡 肽(proenkephalin,PENK)最初被证明通过阿片类药物途径在成熟的神经和神经内分泌系统中表达,并参与调节细胞生存12。PENK 可通过 PI3K 信号调控 OS 细胞迁移13。然而 LINC00319 和 PENK 是否与 OS 疾病进展有关联还不清楚,故本文将从临床患者、动物、细胞水平分别探讨其机制,以期从基因层面上去丰富 OS 发病机制的研究,探寻 OS 治疗的潜在靶点,为靶向治疗 OS 提供理论基础。1 材料与方法1.1 细胞株与动物1.1.1 细胞株 人骨肉瘤细胞系 MG63(CBP60233)购自南京科佰生物科技有限公司。1.1.2 OS 患者外周血取 2022 年 1 月 2023 年1 月我院收治的 20 例骨肉瘤患者外周血为研究对象,非 OS 患者外周血作对照,OS 患者性别:男性14 例,女性 6 例;年龄 16 35 岁,平均(24.4 4.2)岁。OS 患者纳入标准:符合骨肉瘤的诊断标准,经病理检查确诊为骨肉瘤;进行外科手术治疗,且术前均未接受过放化疗、免疫治疗等;患者签订知情同意书。已通过我院伦理委员会审核批准(批准号:2021KT159)。1.1.3实验动物6 周龄的雄性无胸腺裸鼠 20只,体质量 18 20 g,购于南通大学实验动物中心,许可证号:SCXK(苏)20190001。实验动物随机分为两组 shNC 组和 shLINC00319 组,每组 10只。在 SPF 级实验动物房饲养,动物房温度为18 22,湿度维持在 50%60%之间。动物实验均遵守实验动物管理和保护条例,由我院伦理委员会批准(批准号:2021KT083)。1.2 主要试剂与仪器Anti-PENK、anti-PI3K、anti-AKT、anti-p-AKT、anti-GAPDH、Goat Anti-Rabbit IgG H&L(Alexa Flu-or647)、Goat Anti-Mouse IgG H&L(Alexa Fluor488)抗体等均购自 Abcam 公司。PLKO-shNC、PL-KO-shPENK、PLKO-shLINC00319、pCDH-GFP-NC、pCDH-GFP-LINC00319 慢病毒购自上海吉玛基因公司。细胞增殖 EdU 检测试剂盒购自碧云天生物技术公司。RPIM-1640 培养基和胎牛血清购自 Gibco 公司,激光共聚焦显微镜(LSM700)购自德国卡尔蔡司公司。1.3 方法1.3.1 细胞培养MG63 细胞培养于含体积分数为 10%胎牛血清的 RPMI-1640 培养基中,置于含5%CO2的 37 细胞培养箱培养至汇合率达 80%842夏非,等.LINC00319 调控 PENK 调节 PI3K/AKT 信号通路在骨肉瘤中的机制研究时进行细胞传代。1.3.2 外周血采取保存 使用5 mL EDTA 真空采血管抽取空腹静脉血4 mL,采血后轻轻颠倒试管,混合8 10 次,避免剧烈震荡,采完血样后样本垂直放置,低温离心机3 500 r/min 离心10 min 得到血浆,样本无肉眼可见溶血,剔除所有溶血可能的血浆样本,每200 L 分装到一个冻存管,随后存放于-80 冰箱待用,减少冻融次数,抽血后2 h 内完成。1.3.3 细胞分组MG63 细胞分别经 PLKO-shNC、PLKO-LINC00319、PLKO-shPENK 慢病毒感染后分为shNC 组、shLINC00319 组、shLINC00319+shPENK组。MG63 细胞分别经 pCDH-OE-NC 和 pCDH-OE-LINC00319 慢 病 毒 感 染 后 分 为 OE-NC 组 和 OE-LINC00319 组。1.3.4慢病毒感染和细胞转染取对数生长期的MG63 细胞铺板过夜培养后,取10 L(1 108IU/mL)对应组别慢病毒感染 16 h,随后更换为完全培养基继续培养至 72 h,用 3 mol/L 的嘌呤霉素筛选 2 周后通过 qPCR 和蛋白质印迹法检测敲低或过表达效率。1.3.5裸鼠异种移植实验将 MG63-shNC 细胞、MG63-shLINC00319 细胞(2 106个/只)分别皮下注射到 10 只裸鼠的腋窝皮下位置。在细胞注射后30 d 对小鼠实施安乐死以获得肿瘤并称取重量。1.3.6 EdU 法测定细胞增殖严格按照说明书操作,各组细胞铺于 6 孔板,过夜培养。将 2 EdU工作液(20 mol/L)等体积加入 6 孔板中。继续孵育细胞2 h 标记 EdU。随后用1 mL 4%的多聚甲醛固定液室温固定 15 min。之后用 1 mL 含 0.3%TritonX-100 的通透液,室温孵育10 min。每孔加入0.5 mL Click 反应液室温避光孵育 30 min。吸除Click 反应液,每孔加1 Hoechst 33342 溶液1 mL,室温避光孵育 10 min。荧光显微镜下观察并呈像。1.3.7 细胞侵袭分析 使用 Transwell 室(Costar)用于细胞侵袭测定。Transwell 室预涂 50 L 2 mg/mL 基质胶。8 104个/孔细胞悬浮在200 L 无血清 DMEM 培养基,接种到上部室中。600 L 含10%FBS 的 RPMI-1640 培养基用作引诱剂,并添加到下腔中。培养 24 h 后,粘附在膜下表面的细胞用4%多聚甲醛固定,并用 0.1%结晶紫染色,而膜上表面的细胞通过用棉签擦拭去除。在倒置光学显微镜下对至少 3 个包含侵入下表面的细胞的随机视野进行成像。1.3.8 免疫组化染色将从 OS 异种移植物获得的肿瘤组织包埋在石蜡中,石蜡包埋的含有肿瘤组织的薄(4 m)切片用二甲苯脱蜡,然后通过酒精梯度再水合。用特异性抗体(anti-PENK,anti-AKT,anti-p-AKT,anti-PI3K)进 行 IHC 染 色。IHC 评分分为染色强度评分和染色阳性率评分:染色强度评分分为 0 分,0.5 分,1 分,2 分,3 分,共 5 个档次;染色阳性率评分分为0 100%区间;IHC 染色总评分的计算方式为:“染色强度评分”与“染色阳性率评分”的乘积(0 300%),简称为 IHC Score。随后以 shNC 组小鼠肿瘤组织的染色分数为标准,标准化各蛋白数据。1.3.9 蛋白质印迹法使用冰冷的 RIPA 溶液和蛋白酶抑制剂从匀浆组织或细胞裂解物中提取总蛋白。将蛋白质样品稀释至等浓度,在沸水浴中 5min 变性,通过 SDS-PAGE 分离,并转移到聚偏二氟乙烯膜上。用含5%脱脂牛奶的 Tris 缓冲盐水吐温(TBST)缓冲液封闭膜,然后在 4 过夜孵育对应一抗 PENK(11 000),GAPDH(12 000)。用TBST 缓冲液洗涤四次后,将膜在25 温育辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二级抗体(110 000)60 min。用化学发光成像系统(Bio-Rad)观察蛋白质条带。1.3.10qPCR 法使用 TRIzol 从细胞中提取总RNA。定量实时 PCR(qPCR)实验使用 SYBR-Green 试剂(Takara Bio 股份有限公司,Shiga,Ja-pan)进行,其具有 LINC00319 的正向引物(5-CTAGATGTTACCCTGGCTCAAC-3)和 反 向 引 物(5-AGAGAAAAGGCATTCGATGGG-3)、PENK 的正 向 引 物(5-CAATACTGGTCAGCTCCTTCG-3)和反向引物(5-CAAATTCAGCCACAATCACCC-3)、GAPDH 正向引物(5-GAGGTGAGGTCGGAGTC-3)和反向引物(5-GAGAGGTGATGGTTC-3)。1.4 统计学方法连续变量的数据表示为平均值 标准偏差。所有分析均使用 SPSS 20.0 软件进行。所有实验均为3 个生物学重复。使用不成对的 Student t 检验分析各组之间的差异。使用 Pearson 相关分析评估LINC00319 和 PENK 表达水平之间的相关性。P 0.05 被认为差异显著。2 结果2.1 OS 患者外周血中 LINC00319 与 PENK 表达呈负相关qPCR 结果显示,LINC00319 在 OS 患者外周血中 mRNA 表达水平(2.99 0.39)显著高于非OS 患者(1.04 0.18),差异均有统计学意义,t=-19.92,P0.0001(图 1A)。qPCR 检测结果显示,PENK 在 OS 患者外周血中 mRNA 表达水平942医学分子生物学杂志,2024,21(3):247-253 J Med Mol Biol,2024,21(3):247-253(0.35 0.08)显 著 低 于 非 OS 患 者(1.04 0.19),差异均有统计学意义,t=14.62,P 0.001(图 1B)。相关性分析结果 显 示,OS 患 者 外 周 血 中LINC00319 和 PENK 表达呈负相关,相关性系数 r为 0.769 6,P0.001(图 1C)。A:qPCR 检测 LINC00319 表达;B:qPCR 检测 PENK 表达;C:PENK 与 LINC00319 相关性分析。P0.001。图 1 OS 患者外周血中 LINC00319 与 PENK 表达呈负相关2.2 LINC00319 在 MG63 细胞中调控 PENK 表达水平qPCR 结 果 显 示,在 OS 细 胞 系 MG63 中,shLINC00319-1#组和shLINC00319-2#组的LINC00319 表达水平低于 shNC 组,同时检测 PENK 水平发现,shLINC00319-1#组和 shLINC00319-2#组的 PENK mRNA表达水平高于 shNC 组(图2A)。蛋白质印迹检测结果显示,shLINC00319-1#组和shLINC00319-2#组中 PENK 蛋白表达水平也高于 shNC组(图2C)。qPCR 结果显示,OE-LINC00319 组的 LINC00319表达水平高于 OE-NC 组,而 OE-LINC00319 组 PENK的 mRNA 表达水平低于 OE-NC 组(图 2B)。蛋白质印迹检测结果显示,OE-LINC00319 组 PENK 的蛋白表达水平也低于 OE-NC 组(图2D)。A、B:qPCR 检测 MG63 细胞中 LINC00319/PENK mRNA 表达;C、D:蛋白质印迹检测 MG63 细胞中 PENK 蛋白表达。P0.01,P0.001。图 2 LINC00319 在 MG63 细胞中调控 PENK 表达水平2.3 敲低 LINC00319 抑制 MG63 细胞体内成瘤能力构建 MG63 细胞 LINC00319 敲低的细胞系,皮下注射构建骨肉瘤小鼠模型,分为 shNC 组和shLINC00319 组。测定两组肿瘤重量,结果显示,shLINC00319 组肿瘤组织重量(0.19 0.03)g 显著低于 shNC 组(0.37 0.05)g,差异均有统计学意义,t=9.90,P0.001(图 3)。与 shNC 组比较,P0.001。图 3 敲低 LINC00319 抑制 MG63 细胞体内成瘤能力052夏非,等.LINC00319 调控 PENK 调节 PI3K/AKT 信号通路在骨肉瘤中的机制研究2.4 敲低 LINC00319 抑制肿瘤组织中 AKT/PI3K 信号小鼠肿瘤组织免疫组化及蛋白质免疫印迹结果显示,shNC 组 PENK 蛋白相对表达水平显著低于shLINC00319 组(图 4、表 1)。免疫组化结果显示shNC 组 AKT 蛋白相对表达水平与 shLINC00319 组无显著差异,shNC 组 p-AKT 蛋白相对表达水平显著高于 shLINC00319 组,shNC 组 PI3K 蛋白相对表达水平显著高于 shLINC00319 组(表 1)。表 1 小鼠肿瘤组织免疫组化分析(n=10)PENKAKTp-AKTPI3KshNC 组0.99 0.111.17 0.181.09 0.141.00 0.15shLINC00319 组2.53 0.301.08 0.150.32 0.050.28 0.06t-15.001.3415.7614.02PP0.001P=0.196P0.001P0.001图 4 蛋白质印迹检测裸鼠肿瘤组织中 PENK 蛋白表达2.5 LINC00319 下调后通过 PENK 抑制 MG63 细胞增殖采用 EdU 法标记细胞增殖,检测发现,shNC组 MG63 细胞 EdU 阳性率(52.67 5.97)%高于shLINC00319 组 MG63 细胞(27.36 5.41)%,差异有统计学意义,t=5.434,P=0.006(图 5)。shLINC00319 组 MG63 细胞 EdU 阳性率(27.36 5.41)%低于 shLINC00319+shPENK 组 MG63 细胞(51.23 4.45)%,差 异 有 统 计 学 意 义,t=-5.897,P=0.004(图 5)。图 5 EdU 法检测 MG63 各组细胞增殖(200)2.6 LINC00319 通过 PENK 抑制 MG63 细胞侵袭Transwell 检测细胞侵袭能力发现,shNC 组MG63 细 胞 侵 袭 率(43.17 3.27)%高 于shLINC00319 组(19.67 3.41)%,差异有统计学意义,t=4.274,P=0.005(图 6)。shLINC00319组 MG63 细 胞 侵 袭 率(19.67 3.41)%低 于shLINC00319+shPENK 组(37.69 3.35)%,差异均有统计学意义,t=-5.897,P=0.003(图6)。图 6 Transwell 法检测 MG63 细胞各组细胞侵袭能力(100)152医学分子生物学杂志,2024,21(3):247-253 J Med Mol Biol,2024,21(3):247-2532.7LINC00319 在 MG63 细胞中通过 PENK 调控 AKT/PI3K 信号 蛋白质印迹检测结果显示,相比于 shNC 组,shLINC00319 组 MG63 细胞中总 AKT 蛋白表达水平不变,P-AKT 和 PI3K 蛋白水平降低(图 7)。此外,相 比 于 shLINC00319组,shLINC00319+shPENK 组 MG63 细胞中总 AKT 蛋白表达水平不变,P-AKT 和 PI3K 蛋白水平升高(图 7)。图 7 蛋白质印迹检测MG63 细胞中AKT/PI3K 等蛋白表达3 讨论癌症已经成为世界范围内威胁人类健康的最主要疾病之一,其发病率和死亡率仍在不断的上升,尤其是在中国等发展中国家14-15。OS 是人类骨骼系统常见的恶性肿瘤。lncRNA 是一类新发现的转录或转录后机制调控因子。研究表明,几种 ln-cRNA 与 OS 的启动有关16。Zhou 等17确定 ln-cRNA BSN-AS2 通过吸收 miR-654-3p 和上调 SYTL2基因来促进脊髓 OS 的进展。我们之前的工作表明,LINC00319 可 以 通 过 吸 收 miR-455-3p 上 调NFIB 来促进 OS 的进展11。此外脑啡肽 PENK 通过激活 PI3K/Akt 信号通路抑制骨肉瘤细胞迁移13。而 LINC00319 与 PENK 在 OS 中的关系并不清楚。本文研究发现,LINC00319 mRNA 表达水平在 OS 患者外周血中高表达,PENK mRNA 在 OS 患者外周血中低表达,并且 LINC00319 与 PENK 的表达水平呈负相关。该结果表明两者之间存在密切关联。从哺乳动物基因组中数千个基因座转录而来的长链非编码 RNA 已被认为是参与基因表达调控和各种细胞过程中介的关键因素18。为进一步明确LINC00319 是否调控 PENK 表达,我们使用基因干扰(短发夹 RNA,short hairpin RNA,shRNA)及过表达手段分别干扰/过表达 LINC00319 水平。我们的 研 究 结 果 显 示 当 在 MG63 细 胞 中 敲 低LINC00319 时,PENK 的表达水平显著提高。而当在 MEG63 细胞中过表达 LINC00319 后,PENK 的表达水平大幅度下降。无论是 mRNA 水平还是蛋白水 平 均 显 示 一 致 的 结 果。该 部 分 结 果 表 明LINC00319 作为上游调控因子可以调节 PENK 的表达水平。研究表明,LINC00319 的过表达与患者预后不良有关,并与皮肤鳞状细胞癌的细胞增殖和侵袭有关19。此外,LINC00339 的上调可以增强LSCC 中的细胞增殖和侵袭20。我们的研究结果显示,敲低 LINC00319 后 MG63 细胞侵袭能力下降,MG63 细胞 EdU 阳性率降低,LINC00319 可以增强MG63 细胞增殖与侵袭;而 shLINC00319+shPENK组 MG63 细胞的侵袭能力和 EdU 阳性率均高于shLINC00319 组,这说明 LINC00319 促进 MG63 的增殖与侵袭可能通过 PENK 实现。在 OS 中,PI3K/AKT 信号通路的失调十分常见,而抑制 PI3K/AKT 的 PTEN 的染色体缺失是一种常见事件21。PI3K/AKT 通路参与了多种肿瘤的化疗耐药过程22。AKT 过表达细胞中抗凋亡蛋白Bcl-xL 高表达,并在用化疗药物处理肿瘤细胞时,抑制 P53 促进的细胞凋亡过程23。此外,PI3K/AKT 途径的激活也参与肿瘤细胞的增殖与侵袭过程,如 HMGB1-RAGE 通过 PI3K/AKT 信号不仅促进乳腺癌细胞的侵袭,而且促进 PD-L1 的表达,从而导致效应 T 细胞活化被抑制,减弱的 HMGB1-RAGE-PI3K/AKT 途径可能有助于减弱乳腺癌细胞侵袭性表型24。本文研究发现,敲低 LINC00319可以降低 MG63 细胞在小鼠体内的成瘤能力,shLINC00319 组肿瘤重量显著低于 shNC 组。免疫组化结果显示 PENK 表达水平在 shLINC00319 组中上 调,AKT蛋 白 相 对 表 达 水 平 无 变 化,shLINC00319 组中 p-AKT 和 PI3K 蛋白相对表达水平显著降低。此外,MG63 细胞实验结果也类似,敲低 LINC00319 后总 AKT 蛋白表达水平不变,P-AKT 和 PI3K 蛋白水平降低。这些结果表明敲低LINC00319 后,PI3K/AKT 途 径 被 抑 制。当 在MG63 细胞中同时敲低 LINC00319 和 PENK 后,相比于 shLINC00319 组,细胞中总 AKT、P-AKT 和PI3K 蛋白表达水平回复至与 shNC 组相似水平。该结果表明,在 MG63 细胞中敲低 LINC00319 可以抑制 PI3K/AKT 途径,而这种抑制效应信号可能由PENK 传导。252夏非,等.LINC00319 调控 PENK 调节 PI3K/AKT 信号通路在骨肉瘤中的机制研究综上所述,本研究发现 LINC00319 在 OS 患者外周血高表达,PENK 在 OS 患者外周血低表达,两者表达呈负相关性。LINC00319 的高表达通过抑制 PENK 水平,进而激活 PI3K/AKT 信号通路促进OS 细胞增殖及细胞侵袭。参考文献1 RICKEL K,FANG F,TAO J.Molecular genetics of osteo-sarcomaJ.Bone,2017,102:69-79.2 ZHA Z,HAN Q,LIU W,et al.lncRNA GAS8-AS1 down-regulates lncRNA UCA1 to inhibit osteosarcoma cell mi-gration and invasionJ.J Orthop Surg Res,2020,15:38.3 KLANGJORHOR J,PONGNIKORN D,PHANPHAISARNA,et al.An analysis of the incidence and survival rates ofbone sarcoma patients in thailand:reports from population-based cancer registries 2001-2015J.Cancer Epidemiol,2022,76:102056.4WU B,XING C,TAO J.Upregulation of microRNA-23b-3p induced by farnesoid X receptor regulates the prolifera-tion and apoptosis of osteosarcoma cellsJ.J Orthop SurgRes,2019,14(1):398.5GORYN T,PIENKOWSKI A,SZOSTAKOWSKI B,et al.Functional outcome of surgical treatment of adults with ex-tremity osteosarcoma after megaprosthetic reconstructionsingle-center experienceJ.J Orthop Surg Res,2019,14:346.6 LIU W,XIE X,QI Y,et al.Exploration of immune-relatedgene expression in osteosarcoma and association with out-comesJ.JAMA Netw Open,2021,4(8):e2119132.7 CHEN Y,LI K,ZHANG X,et al.The novel long noncod-ing RNA lncRNA-Adi regulates adipogenesis J.StemCells Transl Med,2020,9(9):1053-10678 WANG X,MENG R,HU Q M.LINC00319-mediated miR-3127 repression enhances bladder cancer progressionthrough upregulation of RAP2 AJ.Front Genet,2020,11:180.9 YANG J,HOU S,LIANG B.LINC00319 promotes migra-tion,invasionandepithelial-mesenchymaltransitionprocess in cervical cancer by regulating miR-3127-5p/RPP25 axisJ.In Vitro Cell Dev Biol Anim,2020,56:145-153.10 ZOU J,WU K,LIN C,et al.LINC00319 acts as a microR-NA-335-5p sponge to accelerate tumor growth and metas-tasis in gastric cancer by upregulating ADCY3J.Am JPhysiol Gastrointest Liver Physiol,2020,318(1):G10-G22.11 SUN F,YU Z,WU B,et al.LINC00319 promotes osteosar-coma progression by regulating the miR-455-3p/NFIB ax-isJ.J Gene Med,2020,22(11):e3248.12 CORTELLINI A,TUCCI M,ADAMO V,et al.Integratedanalysis of concomitant medications and oncological out-comes from PD-1/PD-L1 checkpoint inhibitors in clinicalpracticeJ.J Immunother Cancer,2020,8(2):e001361.13 ZHANG H P,YU Z L,WU B B,et al.PENK inhibits os-teosarcoma cell migration by activating the PI3K/Akt sig-naling pathwayJ.J Orthop Surg Res,2020,15(1):162.14 UHLEN M,ZHANG C,LEE S,et al.A pathology atlas ofthe human cancer transcriptomeJ.Scie