牛樟芝种质资源分析及其Antcin类化合物对乳腺癌细胞的影响.pdf

4云南农业科技2 0 2 4年第1期李晶（198 5-），女，湖北武汉人，博士，2 0 17 年毕业于福建农林大学园艺学院蔬菜学专业（食用菌方向）。2 0 11年起工作于福建农林大学菌草研究所，现就职于福建农林大学国家菌草工程技术研究中心。主要从事菌草栽培食药用菌和樟芝三定向调控等相关研究。主持、参与福建省科技厅自然科学基金、教育厅国家林业局公益性行业项目、国家林业局引智专项、中央引导地方科技发展专项、福建省科技重大专项、福建省闽台合作人才引智等研究项目；工作期间参与国家菌草工程技术研究中心、菌草综合开发利用技术国家地方联合工程技术研究中心、福建省菌草生态产业协同创新中心等平台建设。获授权专利3项，以第一作者发表中英文论文16 篇，获2 0 18 年福建省科技进步奖一等奖（排名8）,2 0 19 年赴台湾中兴大学进行访学工作，开展牛樟芝对乳腺癌细胞的作用研究。牛樟芝种质资源分析及其Antcin类化合物对乳腺癌细胞的影响温叶艳1,2，张引莲1,2，张煜隆1,2，林紫璇1,，林冬梅1，林兴生1，李（1.福建农林大学菌草科学与技术研究院/国家菌草工程技术研究中心，福建福州350 0 0 2；2.福建农林大学生命科学学院，福建福州350 0 0 2)Analysis of germplasm resources of Taiwanofungus camphoratus and the effectsof its antcin compounds on breast cancer cellsWEN Ye-yan2,ZHANG Yin-lian2,ZHANG Yu-long2,LIN Zi-xuan2,LIN Dong-mei,LIN Xing-sheng,LI Jing摘要：收集牛樟芝种质资源并研究其Antcin类化合物对乳腺癌细胞转移、侵等作用，为开发乳腺癌治疗药物提供理论思路。本研究分别采用ISSR、I T S-RFLP和BOX-PCR技术对6 株牛樟芝菌株进行种质资源分析，并开展牛樟芝Antcin类化合物对乳腺癌细胞转移、侵袭等作用研究。结果表明,ISSR法和BOX-PCR技术能从条带的特异性对供试菌株进行分类；利用8 条多态性ISSR引物对供试菌株进行PCR扩增，共获得8 12 条多态性条带，其多态性条带比例达41%，表明其遗传多样性较为丰富，与外源菌株（金福菇）相比遗传相似系数为0.34;6 株供试菌株间具有不同程度亲缘关系，且在遗传相似系数0.48处可聚为3类；通过多种方式比较，AC002、A C0 0 3、A C0 0 4和AC005可聚为一类。5molL-ATB+20molL-ATH、10 molL-1ATB、40 molL-1LATH对乳腺癌MDA-MB-231细胞无细胞毒性,ATB+H组在48 h时相对阴性处理癌细胞迁移降低48.2%(P0.05)，且显著抑制MDA-MB-231细胞的成球,从而抑制癌细胞在体内的成瘤，且能显著抑制MDA-MB-231细胞的侵袭能力（P0.05)。牛樟芝ATB+ATH能为开发乳腺癌治疗药物提供理论支撑。关键词：牛樟芝；菌株鉴定；乳腺癌；Antcin类化合物收稿日期：2 0 2 3-0 3-0 3基金项目：福建省农业农村厅农业资源保护与利用专项（K K Y2 2 0 0 1XA）；福建省科学技术厅自然科学基金（2 0 2 1J01135）；福建农林大学学科交叉融合推动菌草科学及产业高质量发展（7 12 0 2 10 30)。作者简介：温叶艳（1999-），女，甘肃白银人，硕士研究生，主要研究方向为菌草食用菌种质资源收集与鉴定；E-mail：。*为通讯作者：李晶（198 5-），女，博士，助理研究员，主要研究方向为菌草栽培食药用菌、牛樟芝三合成及定向调控；E-mail：13959197 195 16 3.c o m。晶品1*牛樟芝（Taiwanofungus camphoratus M.Zang&C.H.Su)是中国台湾特有的珍稀药用菌,又名牛樟菇、樟芝，是多年生蕈菌类，具有圆柱形担孢子，菌丝呈黄色、棕红色或红色，子实体生长在中国台湾特有的牛樟树中空内壁上，呈暗棕红色,形状呈不规则状。牛樟芝Antcin类化合物是其主要活性物质，常被用于解毒、止痛,具有抗氧化和抗肿瘤作用。据国际抗癌协会资料统计，乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤，全世界每年约12 0 万妇女发病，其中约50 万人死于乳腺癌，且发病率在中国逐年上升，对社会家庭产生温叶艳等：牛樟芝种质资源分析及其Antcin类化合物对乳腺癌细胞的影响巨大的影响 2 。牛樟芝中Antcin A、A n t c i n K、A n t c i n H等化合物具有不同的抗肿瘤活性作用 3。Hsieh等 4 认为Antcin A、A n t c i n C和Methyl anticiante A可选择性抑制人类癌细胞而非正常细胞的增殖;MethylantcinateB和AntcinB被认为是对各种类型癌细胞的强细胞毒性药物 5;AntcinA能抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭，可作为开发乳腺癌治疗抗转移药物的先导制剂 。分子生物学技术已成为2 1世纪科技革命的主要技术之一,DNA分子标记技术是分子生物学技术的重要组成部分，成为作物遗传育种、品种鉴定、遗传多样性分析、基因定位和克隆等研究的重要手段。在食用菌研究中,DNA分子标记技术和基因转化技术等已广泛应用于生物遗传多样性、种群结构、种质鉴定和物种鉴别中 7。其中简单重复序列区间长度多态性(InterSimple Sequence Repeat,ISSR)和基于 ITS 限制性内切酶片段长度多态性分析（Internal Transcribed Spacer-Restriction Fragment Length Polymorphism,ITS-RFLP)技术成为研究真菌遗传多样性较为常见的分子技术之一 8,该方法具有简便、快速、低成本和重复性好等特点 9。BOX-PCR指纹图谱分析技术与重复片段PCR菌株/细胞编号AC001AC002AC003AC004AC005AC006T003MDA-MB-2315基因指纹分析（Repetitive DNA PCR-based GenomicFingerprinting,REP-PCR)和分型法基于肠杆菌基因间重复共有序列（Enterobacterial Repetitive IntergenicConsensus-PCR,ERIC-PCR)技术相似，但其操作更为简单快捷，容易获得较为丰富的扩增条带，不需要菌株的特异性DNA探针，仅需要一条单引物就能够完成大量菌株的DNA多态性分析，已被广泛应用于品种鉴定 10 。文章通过收集牛樟芝菌株并使用DNA分子标记技术对其进行种质资源分析，并对从牛樟芝中提取到的Antcin类化合物开展其对乳腺癌细胞的增殖、转移等研究，探讨Antcin类化合物的协同作用，为开发乳腺癌治疗药物提供新思路。1术材料与方法1.1供试材料1.1.1试验菌株和细胞本研究所使用供试菌株均由笔者收集并保存于福建农林大学国家菌草工程技术研究中心，乳腺癌细胞由中国台湾中兴大学树木代谢组学和天然药物开发实验室王升陽教授提供（表1）。表1供试菌株及细胞来源菌株/细胞名称牛樟芝牛樟芝牛樟芝牛樟芝牛樟芝牛樟芝金福菇乳腺癌细胞菌株/细胞来源中国台湾神农真菌生技有限公司（子实体）中国台湾神农真菌生技有限公司（菌丝体）福州绿谷生物药业技术研究所（菌丝体）福州闽江真菌研究所（菌丝体）福建农林大学菌物研究中心（菌丝体）福建农林大学食品科学学院（菌丝体）福建农林大学国家菌草工程技术研究中心（菌丝体）中国台湾中兴大学树木代谢组学和天然药物开发实验室AC0011.1.2主要工具酶及试剂牛樟芝固体培养基主要配方为2.5%葡萄糖、0.5%蛋白陈、0.3%麦芽糖、0.3%酵母提取物、0.1%KH,P04、0.1%M g SO 47H200.1%维生素Bi、0.2 5%柠檬草水提取物 10 、2%琼脂粉，培养基于12 1灭菌2 0min后倒平板冷却备用。Antcin B（A T B)和 Antcin HAC002AC003AC004图1供试菌株（A T H)化合物从牛樟芝AC001子实体中分离得到,纯度均 99%l。2 T a q M a s t e r M i x、D 2 0 0 0(p l u s )M a r k e r、真菌DNA提取试剂盒、限制性内切酶EcoR I,DraI,BspD I,Apal I,MspA1I 等购于 NEW ENGLAND BIO-LABS公司，二甲基亚矾（DMSO）,Ro s w e l l Pa r k M e m o-rialInstitute-1640培养基（RPMI），胎牛血清（FBS），丙AC005AC006T0036酮酸钠，三苯氧胺（Tamoxifen，T A M），青霉素（Peni-cillin，A M P）、吉姆萨染色液（Giemsa）等由Invitrogen（Ca r l s b a d,CA）提供，Matrigel基质基底膜由DiscoveryLabware（Be d f o r d,U SA）提供，其他试剂均为国产分析纯。本文主要引物均由福州尚亚生物技术有限公司合成(表2)。表2 本研究所用引物引物名称引物序列(5 3)ITS1TCCGTAGGTGAACCTGCGGITS4TCCTCCGCTTATTGATATGCBOXAIR CTACGGCAAGGCGACGCTGACG BOX-PCR序列扩增P1TGCACACACACACACP4GGATGCAACACACACACACP5TCGTGTGTGTGTGTGTP13TCTCTCTCTCTCTCTCCGP14ACACACACACACACACCGP23GAGAGAGAGAGAGAGACTP24CACGAGAGAGAGAGAGAP25GAGAGAGAGAGAGAGACC1.2试验方法1.2.1基因组DNA提取将供试菌株采用牛樟芝固体培养基平板进行活化，分别取新鲜菌丝体按真菌DNA提取试剂盒说明书要求操作，经Nanodrop2000检测浓度和纯度合格后-2 0 保存备用。1.2.2ITS-RFLP序列扩增供试菌株ITS序列扩增反应体系为2 5L，其中2 TaqMaster Mixl2.5L、D NA 模板1L、I T S1与ITS4引物各1L,ddH,09.5L。PCR扩增程序：94预变性5min,94变性30 s,56退火30 s，7 2 延伸1min,30个循环，最后7 2 延伸7 min。PC R产物经1%琼脂糖凝胶电泳后进行产物回收、纯化和测序。通过限制性内切酶EcoR I,Dra I,BspD I,Apal I,MspA1I对ITS PCR产物进行酶切。反应体系（总体积30 L):10 FastDigest Green Buffer 2 L、Fa s t D i g e s tenzyme1 L、PCR产物10 L、d d H 2 0 17 L。酶切程序：37 反应5min后6 5加热10 min使酶失活。以1%琼脂糖凝胶，10 0 V电压电泳30 min，经切胶回收测序后，所得到的序列与NCBI中GenBank数据库做比对分析。序列采用软件MEGA7.0以邻接(Neighbor-joining，简称NJ)法构建进化树，以外源菌株金福菇TO03作为外源对照。云南农业科技2 0 2 4年第1期1.2.3BOX-PCR序列扩增BOX-PCR序列扩增反应体系为2 5L,其中包括2 Taq Master Mix3.3L,DNA模板1L,引物1L,ddH019.7L。PC R扩增程序:9 5预变性7min,94变性1min,52退火1min,72延伸8min,30个循环，最后7 2 延伸15min。PC R产物经1%琼脂糖凝胶电泳后拍照记录。1.2.4ISSR序列扩增用途ISSR序列扩增反应体系为2 5L，包括2 TaqITS序列鉴定Master Mix 12.5 L,DNA模板1 L,引物1 L,ddH,0ITS序列鉴定10.5L。PC R扩增程序:94预变性4min,94变性30 s,以50 6 0 复性45s,72延伸2 min,共35ISSR序列扩增个循环,最后7 2 延伸7 min。PC R产物经1%琼脂ISSR序列扩增糖凝胶电泳后拍照。采用软件Ntsyspc 2.10e以非加权ISSR序列扩增组平均法(UPGMA)聚类分析和Tree Plot法对凝胶电ISSR序列扩增泳图进行分析并建立进化树。ISSR序列扩增1.2.5乳腺癌细胞培养及MTT试验ISSR序列扩增将乳腺癌细胞MDA-MB-231接种在含有10%胎ISSR序列扩增牛血清、1.5gL-NaHCO,和10 0 UL-AMP的RPMI培ISSR序列扩增养基中,在5%CO,培养箱中37 继代培养至第6 代，以第7 代MDA-MB-231细胞为实验对象。MTT试验是将MDA-MB-231细胞分别以10 4个。孔-1（2 0 0 L）的密度接种在含有10%FBS、1.5g L-1NaHCO,和1%青霉素的RPMI培养基的96 孔细胞培养板中，分别以0、5molL-、10 molL-、2 0 molL-、40molL-的ATB、A T H 和ATB+ATH组合分别处理MDA-MB-231细胞2 4h和7 2 h,以49 0 nm处的吸光度值设置细胞增殖率为10 0%，计算Antcin类化合物对乳腺癌细胞致死率。1.2.6划痕试验将2 10 4个孔-1（7 0 L)MDA-MB-231细胞接种到具有无硅细胞培养插人物的6 孔培养板中，培养24h后取出插人物,用PBS洗涤孔中细胞,加入2 mL无FBS的RPMI培养基和一定浓度的ATB、A T H 分别继续培养12 h、2 4h 和48 h,以5molL-ITAM处理组为阳性对照（下同）,并在0 h、12 h、2 4 h 和48 h用倒置显微镜对细胞生长情况进行记录,以监测细胞在培养皿中的迁移情况,并通过软件ImageJ分析处理组与对照组相比的细胞迁移百分比。1.2.7Transwell 侵袭试验10LMatrigel基质放于聚碳酸酯膜滤膜上,37保温2 h使其凝固；收集培养好的MDA-MB-231细胞经无FBS的RPMI培养基洗3次并调整细胞浓度温叶艳等：牛樟芝种质资源分析及其Antcin类化合物对乳腺癌细胞的影响为10 4个mL-(200L）,加人一定浓度ATB、A T H。底部腔室中加入7 0 0 L含FBS的RPMI培养基作为趋化因子。细胞在培养箱中培养2 4h后,用4甲醇固定滤膜上的细胞15min，采用Giemsa染色溶液染色30min后用PBS洗涤若干次。最后，通过显微镜(200)拍摄照片,并用软件ImageJ分析细胞数量。1.2.8成球试验将2 0 0 LMatrigel作为粘性层滴注在6 孔细胞培养板上，并在37 下保温2 h使其凝固。制备以10 4个孔-1（2 mL)MDA-MB-231细胞接种到RPMI培养基中，待细胞完全沉降后，用含5%基质凝胶的完全培养基代替RPMI培养基,培养时间共15d,每3d 更换1次培养基，结束后用PBS洗涤表面细胞后采用Giemsa染色溶液染色30 min，最后用PBS洗涤若干次，自然晾干后在显微镜下记录结果。1.2.9数据处理每项试验均设置3个重复，使用软件GraphpadMAC001AC002AC003AC004AC005AC006T0031000bp图2 供试菌株ITS扩增的PCR谱带MAC00LAC002 AC003 AC004AC005 AC006 T0037prism5.01对数据进行统计分析，结果以平均值标准差表示，使用ANOVA方差分析与t检验对数据进行统计评估，所有统计分析结果中*表示在P0.05）,且5molL-1ATB处理和2 0 molL-1ATH处理菌株1201008020000.4524 h72h510ATB浓度（m)Concentration of Anticn B图8 ATB和ATH组合模式对MDA-MB-231细胞毒性的影响0.56Cooffioiont图7UPGMA聚类图谱在2 4h和7 2 h条件下对细胞毒性的作用无显著性差异(P0.05);当ATB浓度高于10 molL-l和ATH高于5molL-时,细胞活力在7 2 h内以剂量依赖性方式逐渐降低(P0.05)。因此,本研究采用5 molL-ATB和2 0 molL-ATH组合,10 mol-L-ATB、40 molL-IATH的非细胞毒性浓度进行后续研究(图8)。120-24 h-72h10080604020015400.66120100101505ATH浓度（um)Concentration of Anticn H0.7704005+55+105+205+4010+510+1010+2010+40ATB+ATH浓度（m）Concentration of Anticn B and H24h-72h温叶艳等：牛樟芝种质资源分析及其Antcin类化合物对乳腺癌细胞的影响2.5Antcin类化合物对细胞迁移的影响如图9 所示，ATB+ATH组在48 h时的闭合面积与0 h时的相比仅减小13.30%，而与阴性对照0 h9组（Neg）相比减小了48.2%（P0.05)(图10-b)。aNeg2.7Antcin类化合物对细胞成球作用的影响如图11所示，乳腺癌细胞在无任何干预的情况下经培养15d后具有显著的成球现象，而通过添加ATB、A T H 和ATB+ATH均能显著抑制MDA-MB-231细胞的成球，从而抑制癌细胞在体内成瘤。bATB+ATHATB6000ATHTAM4000qunu020009Antcins(uM)图10 ATB和ATH化合物对MDA-MB-231侵袭的抑制作用(2 4h)NegATB+ATHATBATHTAM图11ATB和ATH化合物对乳腺癌细胞成球的抑制作用于鉴定真菌物种及属内物种间系统发育关系,ITS序3讨论列上的5.8 S、18 S和2 8 SrRNA基因具有极大保守采用ITS-RFLP、I SSR和BOX-PCR技术对收集性，且绝大多数真核生物在此区域都表现出极为广泛到的牛樟芝菌株进行分类,其中BOX-PCR 和ISSR技的序列多态性 2 ,然而限制性内切酶的筛选是该技术术能通过特定的引物区分不同菌株间的差异，且研究的重点，笔者筛选EcoRI、D r a I、Bs p D I、A p a l I、结果不受生长阶段和形态限制，大大增加了鉴定的准MspA1I等常见限制性内切酶对ITS片段进行处理，确性和科学性，从分子水平为牛樟芝的准确分类、鉴由于供试牛樟芝菌株之间相似度较高,所选限制性内定提供了科学依据。ITS-RFLP分子标记技术一般用切酶难以分辨出明显差异,因此进一步筛选更高效的10内切酶用于区分该菌株片段是今后研究重点。Antcin类化合物是牛樟芝中的主要活性物质，对癌细胞增殖、侵袭和转移等均有显著作用13。目前，已有研究表明，单一Antcin类化合物（Antcin A，A n t c i n C,A n t c i nK和 Antcin H)对治疗小鼠风湿关节炎、肥胖、脑出血、抗炎症等病症具有显著疗效4。然而对于 ATB 和ATH叠加后的协同作用却少有研究，文章对MDA-MB-231中细胞活力、细胞迁移以及细胞侵袭的影响研究表明,ATB+ATH组在48 h时的闭合面积与Oh时相比仅减小13.30%，而与阴性处理组相比减小了48.2%（P 0.0 5）;且ATB+ATH、A T B和ATH均能显著抑制MDA-MB-231细胞的侵袭（P0.05）,能显著抑制MDA-MB-231细胞的成球，从而抑制癌细胞在体内成瘤,因此，ATB+ATH协同作用能有效抑制乳腺癌细胞的增殖。生物活性化合物通过对免疫系统的有益作用以及对癌细胞的直接细胞毒性作用,对癌症治疗产生间接影响，从而有效抑制癌细胞的黏附、迁移和侵袭 15。4结论通过多种DNA分子标记技术开展牛樟芝种质资源研究，规范菌种市场显得尤其重要。本研究收集了6株牛樟芝菌株并对其进行亲缘分析；从中分离出的牛樟芝Antcin类化合物ATB和ATH对乳腺癌细胞的转移、侵袭等具有显著抑制作用，能为其在动物试验和临床应用提供理论依据。致谢：感谢中国台湾中兴大学树木代谢组学和天然药物开发实验室王升陽教授、Kumar博士和王雅昀博士对本研究细胞实验进行指导。参考文献：1李晶，冯娜，王升陽，等.牛樟芝化学成分及其药理作用研究进展 J.生物技术通报,2 0 2 1,37(11)：14-31.2 Gokila V M,Senthil K K J,Liao J W,et al.Antcin C fromAntrodia cinnamomea protects liver cells against free 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