华蟾素通过抑制谷胱甘肽合成酶表达诱导肝癌细胞发生铁死亡的作用机制研究.pdf

基金项目:国家自然科学基金青年项目(.)滨州医学院高层次人才科研启动基金项目(.)作者简介:兀琦女硕士研究方向:中药药理学:.通信作者:张加余男博士教授研究方向:中药质量控制及体内代谢:.杨爱琳女博士副教授研究方向:中药药理学:.华蟾素通过抑制谷胱甘肽合成酶表达诱导肝癌细胞发生铁死亡的作用机制研究兀琦杨静依陈启梅王安美孙艺轩张加余杨爱琳(滨州医学院药学院山东 烟台)摘要:目的 研究华蟾素()通过抑制谷胱甘肽合成酶()表达诱导肝癌细胞发生铁死亡的作用机制 方法 不同浓度华蟾素(、)分别与铁螯合剂()或还原型谷胱甘肽()联合处理肝癌细胞 采用 检测细胞活性 采用活性氧()、丙二醛()和 检测试剂盒检测华蟾素()干预后肿瘤细胞内、和 含量 通过实时荧光定量()和 检测华蟾素处理对肝癌细胞 表达的影响 并采用 干扰技术探究在肝癌细胞中 对 含量及肝癌细胞增殖的影响 结果 与单独使用华蟾素相比铁螯合剂 能够部分逆转华蟾素对肝癌细胞的增殖抑制作用 与对照组相比华蟾素干预组能够增加肿瘤细胞内的 和 含量降低 含量 同时研究显示 能够部分逆转华蟾素对肝癌细胞的增殖抑制作用 深入机制研究发现华蟾素能够抑制 蛋白表达 干扰实验的结果表明下调 蛋白表达能够降低 水平 敲低 能够削弱 对华蟾素增殖抑制的逆转作用且敲低 能够在一定程度上抑制肝癌细胞的生长并增强华蟾素的增殖抑制作用 结论 华蟾素能够诱导肝癌细胞发生铁死亡其机制与干预 水平有关 该研究为华蟾素临床应用提供理论基础并对中药抗肿瘤新药开发起到积极的推动作用关键词:华蟾素肝癌铁死亡谷胱甘肽合成酶中图分类号:.文献标志码:文章编号:():./.():().()()().()()().().药学研究 .:癌症是导致人类死亡的主要原因之一据 年 项目研究表明肝癌的死亡率位居世界第三占癌症总死亡率的.肝细胞癌()是原发性肝癌最常见的一种类型 早期发现可通过手术切除、射频消融术、肝移植等方法治疗然而大多数肝癌患者确诊时已为中晚期 截至目前化疗依旧是晚期肝癌治疗的主要方法但在临床治疗中化疗往往会引起一系列不良反应例如肝功能异常、高血压、腹泻等因此迫切需要开发新的有效、低毒性抗肝癌药物中医药有着悠久的历史近年来在抗肿瘤领域引起广泛关注 中医药能够增强化疗疗效提高生存期 华蟾素是从蟾蜍科动物中华大蟾蜍或黑眶蟾蜍()蟾蜍干皮中提取所得其主要活性成分为蟾蜍二烯内酯、生物碱和肽类 华蟾素胶囊、华蟾素注射液等广泛应用于临床肝癌的治疗 临床研究表明华蟾素联合化疗药物能够显著提高晚期癌症患者药物疗效和生活质量 另外有研究表明华蟾素能够通过抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡、抑制上皮间充质转化和抑制肿瘤血管生成等多方面机制发挥抗肿瘤功效铁死亡是由于失去对膜脂质过氧化的控制而导致的细胞死亡的形式其发生过程中伴随铁依赖性脂质累积、谷胱甘肽过氧化物酶()功能异常、活性氧()升高和还原型谷胱甘肽()含量下降 是人体内重要的抗氧化剂能够清除活性氧 此外有研究表明 合成障碍导致脂质活性氧累积导致铁死亡发生 催化 谷氨酰半胱氨酸与甘氨酸反应生成还原性 不受 反馈抑制的调节 另有资料显示在肝癌细胞中核糖核苷酸还原酶 肽()依赖于 刺激 合成从而抑制铁死亡且有研究表明通过药物诱导铁死亡为目前肿瘤治疗的新策略及研究热点 关于华蟾素能否诱导肝癌细胞发生铁死亡及作用机制目前鲜有报道本研究从铁死亡角度探讨华蟾素抑制肝癌细胞生长的机制 材料与方法.试验药物华蟾素胶囊(批号:)来自于陕西东泰制药有限公司.细胞系人肝癌 细胞().试剂 基础培养基、胎牛血清()、青霉素链霉素混合液和.的胰蛋白酶(美国康宁公司)细胞活性检测试剂、还原型谷胱甘肽(批号:北京百瑞极生物科技有限公司)铁螯合剂(批号:公司)检测试剂盒、和氧化型谷胱甘肽()检测试剂盒、检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)蛋白浓度测定试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)(批号:)和(批号:)(美国 公司)标记的羊抗鼠二抗(美国 公司).仪器 型多功能酶标仪(美国 公司)型实时荧光定量(德国罗氏公司)电泳仪电源(北京六一生物科技有限公司)多功能荧光化学发光成像仪(公司)震荡型恒温金属浴(上海恒科有限公司).方法.细胞培养与细胞活性检测将细胞培养在含 基础培养基、和 的青霉素链霉素的完全培养基中放入含 的 恒温培养箱中进行培养 通过细胞活性检测实验研究华蟾素对人肝癌 细胞增殖的影响 首先将 细胞(.个/孔)铺于 孔板中 后吸出上清将细胞与华蟾素药液、单独或者分别与 、药学研究 .联合处理 之后吸出上清每孔加入 工作液将培养板放入培养箱敷育 后用酶标仪在 波长下进行检测.细胞 含量检测 将肝癌细胞铺于 孔板中待细胞密度达到 时进行药物干预设置华蟾素浓度为、培养 细胞样品处理方法:用胰蛋白酶消化后加入 完全培养液吹打收集细胞 离心 移除上清将细胞用 清洗再次离心 移除上清加入 细胞样品采用反复冻融的方法进行裂解细胞将其放入 冷冻 后取出冷冻的细胞放置于 金属浴融化 反复冻融 次后收集上清 之后根据 检测试剂盒说明书对细胞样品进行检测 含量通过样品的蛋白浓度归一化蛋白浓度由 蛋白测定试剂盒测定.细胞内 含量检测将肝癌细胞铺于 孔板中待细胞密度达到 时进行药物干预设置华蟾素浓度为、培养 之后根据试剂盒说明书对细胞样品进行处理检测 含量通过细胞数量进行归一化.细胞内 水平测定将肝癌细胞铺于 孔板中待细胞密度达到 时进行药物干预设置华蟾素浓度为、培养 之后收集细胞悬浮于稀释好的()中放置于 培养箱中避光敷育 并每间隔 颠倒混匀一下使探针与细胞充分接触 敷育结束后用无血清 基础培养基洗涤细胞 次以充分去除未进入细胞内的探针 最后将细胞悬浮于 中在 内进行流式细胞仪上机检测 采用 软件分析荧光强度.实时荧光定量 ()将肝癌细胞铺于 皿中待密度达到 时进行药物干预设置华蟾素药物浓度为、培养 使用.()根据试剂盒说明书进行总 抽提 使用 分光光度计测定 浓度 使用 进行 逆转录 以下引物用于:():():():():.肝癌细胞用不同浓度的华蟾素药液(、)处理 细胞用预冷的 洗涤两次加入细胞裂解液充分裂解后收集细胞裂解物 在 凝胶上分离细胞裂解物之后转移到 膜上 膜在 下用含 脱脂牛奶的 缓冲液封闭过夜 第 天将膜与特异性一抗()在 下孵育过夜将膜用 缓冲液洗涤 然后与 偶联的二抗()在 下孵育过夜 最后用 缓冲液洗涤 后使用 超敏发光液检进行蛋白检测并通过凝胶图像系统(美国)显示条带.转染将肝癌细胞铺于 孔板中待细胞密度达到 进行转染 将 与 培养液 混合在一起用枪轻轻吹匀 将 加到 培养液 中与加有 的 培养液混合在一起室温静置 之后将 孔板中的培养基弃掉加入 培养液 将含有 的 溶液 补齐至每孔 体系放入细胞培养箱中 后将上清替换为 完全培养基 序列如下:():.统计学方法所有数据统计及分析作图采用 数据比较采用 检验.表明组间差异具有统计学意义 结果.华蟾素诱导肝癌细胞发生铁死亡前期通过研究发现华蟾素能够明显抑制肝癌细胞的生长为了研究华蟾素抑制肝癌细胞生长的形式采用细胞铁螯合剂 干预不同浓度华蟾素处理的细胞结果显示 能够部分逆转华蟾素对人肝癌 细胞的增殖抑制能力 细胞用不同浓度华蟾素药液(、)或与()联合处理 采用 检测细胞活力结果见图 由此可见华蟾素能够通过诱导人肝癌 细胞发生铁死亡的形式抑制增殖药学研究 .图 华蟾素对肝癌细胞铁死亡的影响注:与 华蟾素药液组相比 .华蟾素能够增强肝癌细胞 和脂质过氧化水平 铁死亡的直接表现是诱导细胞内 累积和脂质过氧化诱导的细胞损伤 因此首先通过流式细胞术检测人肝癌 细胞经过华蟾素处理后的 水平 用浓度为、的华蟾素药液处理 细胞 后用 染色并通过流式细胞仪分析结果显示 细胞经华蟾素处理后荧光强度增强说明华蟾素能够诱导 细胞产生(见图)为了进一步研究华蟾素是否通过铁死亡介导的脂质过氧化诱导细胞发生损伤通过检测细胞内 水平发现用华蟾素药液(、)处理 细胞 检测 水平与对照组相比 细胞内 水平显著升高(见图)暗示细胞脂质过氧化程度和细胞损伤的加重图 华蟾素对肝癌细胞活性氧()和丙二醛()的影响 注:与 华蟾素药液组相比 .华蟾素通过降低肝癌细胞 水平抑制细胞增殖 前期文献报道 能够避免细胞发生氧化性损伤更重要的是铁死亡途中伴随着 的损失除了 检测铁死亡的脂质过氧化的指标还有 合成的变化 细胞中存在多个对抗铁死亡的防御途径其中最主要的一个是由 所介导的通过 特异性催化过氧化脂质来抑制铁死亡的发生 用华蟾素药液(、)处理 细胞 检测 水平相比空白对照组华蟾素干预组 水平显著降低(见图)为了进一步探究华蟾素是否通过下调 水平抑制肿瘤细胞生长 细胞用不同浓度华蟾素药液(、)或与()联合处理 采用 检测细胞活力 结果显示 能够部分逆转华蟾素对肝癌细胞的增殖抑制作用(见图)综上华蟾素可能通过降低肝癌细胞内的 水平诱导铁死亡从而表现出抑制肝癌生长的作用图 华蟾素对肝癌细胞谷胱甘肽()含量的影响 注:与 华蟾素药液组相比 .华蟾素能够抑制肝癌细胞 水平 能够催化 谷氨酰半胱氨酸与甘氨酸反应形成 我们首先检测华蟾素对人肝癌 细胞中的 水平的影响 用华蟾素药液(、)处理 细胞 采用 检测 的 水平 如图 所示与对照组相比华蟾素干预后肝癌细胞 的 水平降低表明华蟾素干预导致 的转录抑制 此外 细胞采用、的华蟾素药液处理 通过 检测 蛋白水平华蟾素给药干预后肝癌细胞中 蛋白表达减弱(见图)图 华蟾素对肝癌细胞中谷胱甘肽合成酶()水平的影响 注:与 华蟾素药液组相比.药学研究 .抑制肝癌细胞 水平能够降低 产生 接下来我们研究在肝癌细胞中 是否影响 产生 用靶向()或阴性对照()的 转染肝癌 细胞 通过 检测敲低 后 细胞 蛋白水平的变化 如图 所示 敲低 能够显著抑制 细胞 的蛋白表达 同时我们对 细胞敲低 后其 含量进行检测结果表明敲低 组与 组相比细胞内 含量降低(见图)以上结果表明华蟾素可能通过抑制肝癌细胞 水平进而抑制 的产生图 敲低 对肝癌细胞 含量的影响 注:与阴性对照相比 .华蟾素诱导肝癌细胞铁死亡部分通过干预 实现 我们进一步研究华蟾素是否部分通过抑制 诱导肝癌细胞铁死亡 细胞(转染 或)用不同浓度华蟾素药液(、.、)或与()联合处理 采用 检测细胞活力 如图 所示敲低 会削弱 对华蟾素增殖抑制的逆转作用 细胞(转染 或)用不同浓度华蟾素药液(、.、)处理 采用 检测细胞活力 如图 所示敲低 在一定程度上能够抑制肝癌细胞的生长并能够增强华蟾素对肿瘤细胞的增殖抑制作用 上述结果表明华蟾素诱导肝癌细胞铁死亡可能通过干预 水平来实现 讨论目前大多数肝癌患者确诊时已为晚期只有患者能够手术治疗 索拉非尼是 批准唯一用于肝癌晚期治疗的药物然而其具有较强的毒副作用因此迫切需要开发新的抗肝癌药物 在临床中中药应用于癌症治疗历史悠久 华蟾素作为中成药已广泛应用于临床治疗肝癌、胃癌和胰图 华蟾素部分通过抑制 诱导肝癌细胞铁死亡 注:与 华蟾素药液组相比 .腺癌等铁死亡是一种独特的细胞死亡方式 研究表明通过药物诱导铁死亡能够抑制肿瘤发生发展其发生的主要机制为多不饱和脂肪酸途径诱导脂质过氧化导致 累积最终造成细胞损伤 是脂质过氧化的副产物是铁死亡的标志物 通过研究发现铁螯合剂 能够部分逆转华蟾素对肝癌细胞的增殖抑制作用我们又进一步检测了铁死亡标志物 与 结果显示华蟾素能够诱导肝癌细胞内 和 的累积可见华蟾素能够诱导肝癌细胞发生铁死亡 缺失可诱导肿瘤细胞铁死亡 研究表明抑制 能够增加脂质 含量增强 对铁死亡的敏感性 合成的变化能够反映铁死亡的脂质过氧化程度 细胞中存在多个对抗铁死亡的防御途径其中最主要的一个是由 所介导的通过 特异性催化过氧化脂质来抑制铁死亡的发生 此外研究证实 能够通过直接降低 水平诱导缺乏药学研究 .的敏感细胞发生铁死亡 因此抑制 合成是诱导铁死亡的主要方法 我们检测华蟾素干预后肝癌细胞内 含量结果发现华蟾素干预后 水平降低且 能够减弱华蟾素对肝癌细胞的增殖抑制作用 因此华蟾素可能通过抑制 诱导人肝癌 细胞发生铁死亡进而表现出抑制肝癌细胞生长的作用 是 生物合成的关键酶研究表明 在肿瘤组织中呈现升高趋势 此外有研究证实抑制 能够降低肝癌细胞活性且 能够减弱由 抑制所诱导的细胞增殖抑制作用 通过研究发现华蟾素能够抑制 水平且敲低 能够抑制 水平 进一步研究结果显示敲低 能够削弱 对华蟾素增殖抑制的逆转作用且敲低 能够在一定程度上抑制肝癌细胞生长并增强华蟾素对肿瘤细胞的增殖抑制作用 综上我们认为华蟾素诱导人肝癌细胞铁死亡可能是通过干预 来实现的 本研究有助于阐明华蟾素复杂的抗肝癌作用为华蟾素应用于肝癌临床治疗提供新的理论支持参考文献:.:.():.陈敏山.中国肿瘤整合诊治指南肝癌(精简版).中国肿瘤临床():.():.罗展雄倪秉强郑青平等.华蟾素注射液对晚期恶性肿瘤患者 淋巴细胞亚群及 细胞的影响.现代肿瘤医学():.朱必胜田红岸舒诚荣等.华蟾素胶囊联合放疗治疗晚期胰腺癌的临床效果观察.中国医药():.张晨宋亚熙贵永贤.华蟾素胶囊联合化疗干预晚期肺癌的价值.实用中医内科杂志():.:.():.():.杨凤娟谭宁张天禹等.谷胱甘肽在肿瘤细胞发生铁死亡过程中的作用研究.世界华人消化杂志():.陈意温海滨谭宁等.在肿瘤中的调控研究进展.生命的化学():.():.():.全菲杨勇.靶向铁死亡的癌症疗法.药学研究():.田吴爱陈乃清黄丽华等.益母草碱激活/信号通路抑制肾小管上皮细胞铁死亡的作用机制.中国中药杂志():.李艳纯周怡王鑫等.二氢青蒿素通过诱导铁死亡抑制肝癌细胞生长.中国生物化学与分子生物学报():.():.():.():.:.():./.():./.():.徐文慧李沧海姜廷良.铁死亡通路与中药干预机制研究进展.中国中药杂志():.刘鑫玉周洋周建敏等.铁死亡机制及其在肝细胞癌治疗中的应用.生命的化学():.(下转第 页)药学研究 .讨论 术和冠状动脉搭桥等都是治疗冠心病的主要手段而术后支架内再狭窄也是导致心血管事件发生率升高的主要因素 血管内膜炎性细胞浸润、内皮细胞增生、血管平滑肌()迁移至内膜等导致内膜增厚是管腔狭窄的主导因素因而如何抑制血管内膜增厚、防止血管发生再狭窄是心血管疾病的研究热点之一 目前临床上用于 术的药物主要有雷帕霉素、紫杉醇等 此类药物阻止损伤部位血管平滑肌增殖迁移的同时也会干预损伤血管内皮化这就会引起血管迟发性再狭窄以及迟发性血栓的生成导致 术后心血管不良事件的发生 因此寻找安全有效的治疗血管再狭窄药物具有重要的临床研究意义研究发现大鼠球囊损伤后 可引起 增殖、迁移 后内膜增生达到最高峰 模型对照组内膜呈进行性弥漫性增厚其中以平滑肌为主中膜细胞排列紊乱管腔面积明显缩小本研究建立大鼠腹主动脉球囊损伤术模型发现假手术组管壁结构完整血管内膜呈现良好的连续性中膜边缘可见 规则排列 模型对照组大鼠与假手术组相比大鼠主动脉血管内皮剥落内膜明显增厚血管腔变窄 麝香心痛宁组大鼠腹主动脉内皮剥脱、内膜增厚、血管平滑肌迁移等病理现象减少表明麝香心痛宁可抑制腹主动脉球囊损伤大鼠血管内膜增生、和 是反映血管内皮功能的因子 具有舒张血管平滑肌抑制炎症因子和血小板黏附于血管的作用 可促进血管平滑肌细胞增殖并收缩血管 可促进内皮细胞的迁移和增殖 麝香心痛宁可调节血管内皮相关因子的含量从而抑制内膜增生的发展进程 通过检测大鼠血管炎症相关因子 表达发现麝香心痛宁可降低 表达 此外麝香心痛宁可抑制/通路相关因子的表达 综上所述麝香心痛宁具有保护血管内膜、抑制内膜增生的作用并具有抗氧化损伤和抗炎作用 麝香心痛宁抑制血管损伤后内膜增生的药理作用机制可能与其抑制/信号通路相关参考文献:.:.():.赵若琳郭盈盈阮益亨等.中医为主治疗胰腺癌的疗效评价.中华中医药杂志():.薛文静杨一格柴若宁等./信号通路与炎症细胞因子的研究进展.心脏杂志():.李君.人参皂苷 通过/通路保护脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞的机制研究.延吉:延边大学.张琼张向农涂秀华等.麝香心痛宁片治疗冠心病心绞痛(气滞血瘀证)的临床研究.中国临床药理学与治疗学():.():.尉希清刘帅牛珩等.黄芪甲苷通过抑制血小板源性生长因子表达减轻大鼠颈动脉球囊损伤后内膜增生.中国老年学杂志():.瞿凯邱菊辉王贵学等.血管内皮细胞屏障功能的血流动力学调控及其与动脉粥样硬化的关系.中国动脉硬化杂志():.():.(收稿日期:)(上接第 页)彭煜贾默然邵轶群等.白花丹素调控/信号通路诱导膀胱癌细胞铁死亡.中国实验方剂学杂志():./:.():.():.:.():.():.(收稿日期:)药学研究 .