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颅内注射不同剂量神经生长因子治疗脑出血的实验研究 （1徐州医学院江苏徐州221000）（2徐州医学院第二附属医院神经内科江苏徐州221006）【摘要】目的研究颅内应用神经生长因子（nervegrowthfactor，NGF）对大鼠脑出血（intracerebralhemorrhage）后血肿灶周围神经元的保护作用，并探讨不同剂量之间的差别。方法雄性SD大鼠，采自体血（50l）注入右侧尾状核制作脑出血模型。根据不同注射剂量随机分为4组，生理盐水组（Control组）、0.5ug-NGF组、1.0ug-NGF组、1.5ug-NGF组。各组分别通过颅内原位注射等体积（2ul）生理盐水、NGF0.5ug、NGF1.0ug、NGF1.5ug。治疗一周后进行神经功能评分（NDS）；采用免疫组织化学技术观察血肿周NEURON阳性细胞的表达。结果NDS评分：颅内注射不同剂量NGF组与单纯注射生理盐水的脑出血组相比，可明显改善神经功能缺损评分，差异有统计学意义（P0.05），其中，以1.0ug-NGF组及1.5ug-NGF组最为明显，而这两者之间相比无统计学差异。Neuron阳性细胞数：颅内注射不同剂量NGF组与单纯注射生理盐水的脑出血组相比，血肿灶周围的Neuron阳性细胞数明显增多，差异有统计学意义（P0.05），其中，以1.0ug-NGF组及1.5ug-NGF组增加明显，而这两者之间相比无统计学差异。结论颅内注射NGF能够改善脑出血后神经功能缺损及血肿灶周围神经元的损伤；高剂量NGF治疗效果优于较低剂量。【关键词】脑出血神经生长因子颅内注射不同剂量【中图分类号】R743.34【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2014）12-0391-03ExperimentalStudyonNeverGrowthFactor(NGF)InjectedinDifferentDosesbyIntracerebralinjectedinTreatingIntracerebralHemorrhage(ICH)LIUTeng-fei1,ZHANGQing-xiu2,LVYou2,XIAOLi-jie2,WEIXiu-e,RONGLiang-qun2(1.XuzhouMedicalCollege,Jiangsu,Xuzhou,221000;2.DepartmentofNeurogy,TheNo.2AffilicatedHospitalofXuzhouMedicalCollege,Jiangsu,Xuzhou,221006)【Abstract】ObjectiveInvestigatetheprotectiveeffectofIntracerebralinjectingNerveGrowthFactor(NGF)onIntracerebralHemorrhageofrats,anddiscussthedifferencesamonginjectingindifferentdose.MethodsThecerebralhemorrhage(ICH)modelwasinducedbystereotaxicinfusionof50lautologousbloodintotherightstriatum.pidetheminto4groupsaccordingtodifferentingdose,namelycontrolgroup,0.5ug-NGFgroup,1.0ug-NGFgroup,1.5ug-NGFgroup.Eachgroupisinjectedthesamedose(2ul)ofnormalsaline,ngf0.5ug,ngf1.0ug,ngf1.5ugbyIntracerebralinjection.NeurologicalDeficitScale(NDS),immunohistochemicaltechniquewereusedtodetecttheexpressionofNEURON,1weekafteradministrationrespectively.ResultsNDSscore:GroupsofIntracerebralinjectingdifferentdosengfhaveapparentdecreasewithpurelyinjectingnormalsalinegroupinNDSevaluation,andthedifferenceisstatisticallysignificance(p0.05),especiallythatofthe1.0ugand1.5uggroups,butthetwogroupshavenostatisticallysignificance.Neuronpositivecells:GroupsofIntracerebralinjectingdifferentdosengfhaveapparentimprovementwithpurelyinjectingnormalsalinegroupinthenumberofNeuronpositivecellsinperihematomaregion.andtheimprovementisstatisticallysignificance(p0.05),especiallythatofthe1.0ugand1.5uggroups,butthetwogroupshavenostatisticallysignificance.Conclusion:Intracerebralinjectingofngfcantreatthedefectofneurologicalfunctionandneurondamagearoundperihematomaregionafterintracerebralhemorrhage.Highdoseofngfhasbettertreatmenteffectthanlowerdose.【Keywords】IntracerebralhemorrhageNevergrowthfactorDifferentdosesIntracerebralinjection脑卒中是目前世界范围内的常发病、多见病，其中，脑出血在我国占急性脑血管病的30，在脑出血后三个月生活能力的随访研究发现，能独立生活的患者仅占全部脑出血患者的2835%1。而目前尚无特效的治疗脑出血的手段及方法，因此，积极探索脑出血有效的治疗措施，改善患者的预后，提高患者的生活治质量，有着极其重要的医学价值和社会意义。神经生长因子（nervegrowthfactor，NGF）是第一个被发现的神经营养因子家族成员，其在周围神经系统神经元的发展和表型维护以及中枢神经系统胆碱能神经元的功能完整性方面发挥重要作用2-3。但是NGF的分子量较大，约140KD，很难通过血脑屏障，即使有微量通过受损的血脑屏障进入中枢神经系统，也很难发挥其药效4。因此，国外针对AD及PD的探索性临床研究发现，NGF通过大剂量、颅内局部应用可明显改善中枢神经系统退行性疾病的症状5。我们科室前期的基础及临床研究发现，微创清除血肿和重组水蛭素治疗脑出血可改善脑出血的预后6，那么微创血肿清除联合颅内局部应用NGF是否能更好的改善脑出血病人的神经功能缺损症状？在探讨这一问题之前需要明确NGF颅内局部应用是否能改善脑出血后神经功能的缺损症状？因此，本实验采用自体血制作大鼠脑出血模型，并分为三种剂量组颅内注射NGF治疗大鼠脑出血，来探讨颅内局部应用NGF对大鼠脑出血后的保护作用，以及不同剂量之间的差别，为下一步进行微创血肿清除联合颅内局部应用NGF治疗脑出血的研究提供理论支持。1材料和方法1.1实验动物健康雄性SD清洁级大鼠，体重（25010）g，由徐州医学院实验动物中心提供。1.2主要试剂和仪器鼠神经生长因子（舒泰神生物制药有限公司），小鼠抗大鼠Neuron单抗（Novus公司），超敏即用型二步法试剂盒、浓缩型DAB试剂盒（北京中杉金桥生物试剂公司），其他试剂均为国产分析纯。石蜡切片机（德国莱卡公司），恒温干燥箱（浙江嘉兴新胜电器厂），KOPF脑立体定位仪（美国KOPF公司），OLYMPUS光学显微镜（日本）等。1.3动物模型制备脑出血模型参照朱文焕等7的方法制作。术后单笼饲养，自由进食、饮水。麻醉复苏后进行Longa评分8，1-3分者入组，共入组32只大鼠，其余舍弃。1.4实验动物分组和处理32只SD清洁级大鼠，采自体血（50l）注入右侧尾状核制作脑出血模型。根据不同注射剂量随机分为4组，生理盐水组（Control组）、0.5ug-NGF组、1.0ug-NGF组、1.5ug-NGF组。各组分别通过颅内原位注射等体积（2ul）生理盐水、NGF0.5ug、NGF1.0ug、NGF1.5ug。颅内注射方法参照脑出血模型颅内注血，将大鼠固定于立体定位仪上，用微量注射器经原颅孔垂直进针，深度同前。每天注射1次，脑出血术后连续治疗1周。1.5行为学观察治疗1周后进行神经功能缺损评分9。1.6取材、切片、染色大鼠术后治疗1周后，水合氯醛麻醉后开胸，4%多聚甲醛300ml灌注，然后断头取脑，以进针点为中心冠状位取5mm厚的脑组织块，放入4%多聚甲醛固定液固定过夜，流水冲洗2.5h，然后梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，行尾状核连续石蜡切片（片厚5?m），切片在42温水中贴于载玻片上，60烘烤2h，37过夜后备用，免疫组织化学染色，脱水、透明、封片、镜检。1.7图像分析及数据统计学处理普通显微镜4010倍镜下观察血肿周围阳性细胞。ImageProPlus6.0图像分析软件进行测量分析，数据用均数标准差表示。Graphpadprism软件作图。应用SPSS13.0对数据进行统计分析处理，计量资料若满足其应用条件，多组间差异比较采用单因素方差分析，组间差异比较采用t检验，若资料呈偏态分布且经变量转化后仍不满足参数检验条件则采用非参数检验方法。P0.05表示差异有统计学意义。2结果2.1神经功能缺损评分造模及治疗一周后由两人进行双盲评分，然后各组间进行统计分析。颅内注射不同剂量NGF组与单纯注射生理盐水的脑出血组相比，可明显改善神经功能缺损评分，差异有统计学意义（P0.05），其中，以1.0ug组及1.5ug组最为明显，而这两者之间相比无统计学差异，提示颅内注射NGF能够改善脑出血后神经功能缺损，高剂量NGF治疗效果优于较低剂量（见表格1、图1）。表1治疗一周后各组神经功能评分（x-s）GroupsNDSscorecontrolgroup7.501.410.5ug-NGFgroup5.251.671.0ug-NGFgroup3.751.281.5ug-NGFgroup3.370.92注:与生理盐水组比较：P0.05；与0.5ug-NGF组比较：P0.05。图1治疗一周后各组神经功能评分结果注:与生理盐水组比较：P0.05；与0.5ug-NGF组比较：P0.05。2.2免疫组织化学技术观察血肿周Neuron阳性细胞的表达观察各组血肿周Neuron阳性细胞的表达，Neuron阳性细胞呈圆形或椭圆形黄褐色，靠近血肿周较稀疏，然后各组间进行统计分析。颅内注射不同剂量NGF组与单纯注射生理盐水的脑出血组相比，血肿灶周围的Neuron阳性细胞数明显增多，差异有统计学意义（P0.05），其中，以1.0ug组及1.5ug组增加明显，而这两者之间相比无统计学差异。提示颅内注射NGF能够改善脑出血后血肿灶周围神经元的损伤；高剂量NGF治疗效果优于较低剂量（见图2、图3）。图3免疫组织化学技术观察血肿周Neuron阳性细胞的表达结果注:与生理盐水组比较：P0.05；与0.5ug-NGF组比较：P0.05。3讨论脑出血患者神经损伤难以完全恢复，给患者留下严重的神经功能缺损症状，严重影响了患者的生活质量。因此，脑出血后神经功能的恢复成为临床上的一个棘手的难题。NGF主要在神经元内合成，既往的研究发现，NGF对神经元细胞有促进其增殖、分化、代谢以及支持保护营养的作用10。我们的研究结果发现，颅内注射不同剂量NGF组的大鼠与单纯注射生理盐水的脑出血组的大鼠相比，可明显改善大鼠的神经功能缺损，促进血肿周的Neuron阳性细胞数明显增加，差异有统计学意义（P0.05）。由此我们推测，NGF的颅内应用确实可以改善脑出血大鼠的神经经功能缺损症状，并且促进了血肿周神经元的生长。在中枢神经系统中，NGF分布广泛，在基底节、丘脑、脊髓和视网膜均可检测到其的存在，而含量最丰富的区域是皮层、海马和下垂体11。NGF在中枢神经系统内发挥重要作用，其可通过结合特异性的酪氨酸激酶受体原肌球蛋白激酶受体A(tropomyosinkinasereceptorA,TrkA)发挥生物学功能12。而TrkA可通过激活下游的Ras-丝裂原活化的蛋白激酶（MAPK）、ERK、PI3K-Akt及PLC-在胞浆内发挥作用13-14。NGF还可以结合并激活低亲和力、非选择性的、通过TrkA调节的跨膜糖蛋白p75NTR15-16。而后者又可激活JNK、NF-B和神经酰胺，从而参与细胞凋亡、存活、神经递质的转运等的调节17。半个世纪来，NGF成为大家研究的焦点，研究发现，其在周围神经病理性疾病、糖尿病、HIV感染所致的末梢神经病变、中枢神经系统退行性疾病（如AD、PD）、皮肤溃疡、眼科疾病等疾病的治疗上发挥一定的作用18。但国外的针对AD、PD和糖尿病患者的一些临床前及临床探索性研究发现，NGF可改善一些患者的临床症状，但因为其需要大剂量才能改善患者的症状，以及其对感觉及自主神经系统的生理功能而使NGF在临床上的应用受到了严重的局限性18。NGF处理是怎样有效促进脑出血大鼠血肿周神经元的增加的呢？有研究发现NGF处理可以显著促进内源性神经干细胞（Neuralstemcells,NSCs）的分化10，而PI3KAkt信号通路在NGF诱导的神经干细胞分化中发挥了主要的作用。在神经元细胞中，神经营养因子激活的Akt是由PI3KAkt介导的，NGF处理后，PI3K激酶被激活，促使Akt转位于质膜上，转位于质膜上的Akt通过其308位苏氨酸和473位丝氨酸的磷酸化而被激活19。关于Akt在神经细胞分化中的研究，Namikawa等的研究表明，表达组成性活性的Akt在PC12细胞中促进神经突触的延伸，而且也可以加速运动神经元的再生，MARKUS等在鼠的感觉神经元中也得到了同样的结果，而进一步研究发现。Akt丝氨酸苏氨酸激酶活性是神经营养因子诱导过程中，细胞生存所必需的。因此Akt信号通路可能参与了神经细胞的分化过程20。脑出血大鼠血肿周神经元的增加，也可能与NGF对血肿周神经元凋亡的抑制作用有关，既往的研究发现caspase-3、Bax和TNF-a均参与了细胞凋亡的调节，而NGF通过这三种途径参与抑制神经元凋亡的研究均有报道21-23。然而具体NGF主要通过哪种途径参与抑制神经元凋亡以及参与的机制仍少有报道，这些均需要进一步研究来明确NGF促进血肿周神经元增加的机制。总而言之，通过颅内注射不同剂量神经生长因子治疗脑出血的实验研究，可以明确颅内应用NGF可以通过促进大鼠血肿周神经元的增长来改善大鼠神经功能缺损症状，并且大剂量效果优于小剂量，这为我们下一步微创血肿清除联合颅内局部应用NGF治疗脑出血的研究提供了理论支持，但是本实验选择的不同剂量NGF组别较少，仍需进一步的研究来证明颅内应用NGF治疗脑出血的效果是否存在量效关系。参考文献1MartiniSR,FlahertyML,BrownWM,etal.RiskfactorsforintracerebralhemorrhagedifferaccordingtohemorrhagelocationJ.Neurology,2012,79（23）:2275-2282.2EbendalT.FunctionandevolutionintheNGFfamilyanditsreceptors.JNeurosciRes,1992,32(4):461-470.3AloeL,Bracci-LaudieroL,BoniniS,ManniL.Theexpandingroleofnervegrowthfactor:fromneurotrophicactivitytoimmunologicdiseases.Allergy,1997,52(9):883-894.4AloeL,RoccoML,BianchiP,ManniL.Nervegrowthfactor:fromtheearlydiscoveriestothepotentialclinicaluseJ.JTranslMed,2012,10:239.5AloeL,RoccoML,BianchiP,ManniL.Nervegrowthfactor:fromtheearlydiscoveriestothepotentialclinicaluse.JTranslMed,2012,10:239.6魏秀娥,荣良群.微创清除血肿和重组水蛭素治疗脑出血后脑水肿的实验研究J.中国实用神经疾病杂志,2008,11(11):14-16.7朱文焕,周岱.大鼠脑出血模型制备的体会J.内蒙古民族大学学报,2009,15(5):13-14.8LongaZ,WeinsteinPR,CarlsonS.ReversiblemiddlecerebralarteryocclusionwithoutcraniectomyinratsJ.Stroke,1989,20(1):84-91.9PeelingJ,DelBigioMR,CorbettD,etal.Efficacyofdisodium4-(tert-butylimino)methylbenzene-1,3-disulfonateN-oxide(NXY-059),afreeradicaltrappingagent,inaratmodelofhemorrhagicstrokeJ.Neuropharmacology,2001,40(3):433-439.10ZhengWH,QuiriunR.Comparativesignalingpathwaysofinsulin-likegrowthfactor-1andbrain-derivedneurotrophicfactorinhippocampalneuronsandtheroleofthePI3kinasepathwayincellsurvival.JNeuorchem,2004,89(4):844-852.11McAllisterAK.NeurotrophinsandneuronaldifferentiationinthecentralnervoussystemJ.CellMolLifeSci,2001,58(8):1054-1060.12HuangEJ,ReichardtLF.TRKreceptors:rolesinneuronalsignaltransductionJ.AnnuRevBiochem,2003,72:609-642.13KlesseLJ,ParadaLF.Trks:signaltransductionandintracellularpathwaysJ.MicroscResTech,1999,45(4):210-216.14ChaoMV,RajagopalR,LeeFS.NeurotrophinsignallinginhealthanddiseaseJ.ClinSci(Lond),2006,110(2):167-173.15ReichardtLF.Neurotrophin-regulatedsignallingpathwaysJ.PhilosTransRSocLondBBiolSci,2006,361(1473):1545-1564.16SchorNF.Thep75neurotrophinreceptorinhumandevelopmentanddiseaseJ.ProgNeurobiol,2005,77(3):201-214.17Levi-MontalciniR.Thenervegrowthfactor:thirty-fiveyearslaterJ.Science,1987,237:1154-1162.18AloeL,RoccoML,BianchiP,ManniL.Nervegrowthfactor:fromtheearlydiscoveriestothepotentialclinicaluseJ.JTranslMed,2012,10:239.19LizcanoJM,AlessiDR.TheinsulinsignlalingpathwayJ.CurrBiol,2002,12(7):R236-R238.20NamikawaK,HonmaM,AbeK,etal.Akt/proteinkinaseBpreventsinjury-inducedmotoneurondeathandacceleratesaxonalregenerationJ.JNeurosci,2000,20(8):2875-2886.21韩贵和,魏威,顾军.Bcl-2基因与神经生长因子（NGF）抑制神经细胞凋亡的研究J.医药前沿,22吕韵,郭建新,李文战等.神经生长因子对实验性脑梗死大鼠神经细胞凋亡的影响J.中国实用神经疾病杂志,2009,12(14):5-6.23邓钰蕾,徐玮,汤芸冬等.NF-B在NGF和TNF-a对A25-35海马神经细胞毒的保护作用中的机制研究J.现代神经疾病杂志,2003,3(6):346-350.基金项目：徐州市科技局立项课题（XM13B092，2013） 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