学位论文-替莫唑胺的工艺条件探索与质量控制研究.pdf

替莫畦胺工艺条件探索与质量研究目录一、选背景-5-二、合成工艺探索尸8 1.反应流程2.1替莫哇胺重氯盐的合成.22誉英嚏酸的合成.-9-33替莫嚏胺的精制.-9-三、结构确认及质量控制.-10-1.普其嚏联第构确认-10-1.1 元素分析.-10-12红外吸收光谱(I R).-10-1.3 紫外吸收光谱(UV).-11-1.4 核磁共鬃光谱(NMR).-12-1.5 质谱(MS).-15-2起始府料及中间体的拄制-16-2.1 起始原料阿卡一水合物质置控制标准.-16-2.2 起始物料甲氨基甲嵌氯质量标准.-17-2.3 中间体替英理胺重融盐质量标准.-18-3.1.外观.-19-32.吸收系数.-19-33.溶解度.-19-3.4.烙点.-20-33.超 HKTOA-DSC).-20-3.6.引湿性磷.-21-4.蹒-4.1.紫外吸收光谱42 红外吸收光谱2121&检查_-22-5.1.有物质.-22-52.二甲亚砚溶液澄清度与颜色.32-53.穰失量.-32-5.4.水分.-32-5S 炽灼残渣.-32-56 重金属.-32-5.7.氯化物.-32-替莫哇胺工艺条件探索与质量研究 si残留溶剂检测.33-4444M45 毒内L2.工 48.&8.&值机心四、总结-48-多考文*-54致谢.-55替莫嚏胺工艺条件探索与质:研究替莫哇胺的工艺条件探索与质量控制研究南京大学化工学院万艳武摘要替莫嗖胺是近年来出现的一种治疗脑胶质瘤有较好疗效的新药，其优点是具有较宽的抗肿瘤谱、可口服、易于透过血脑屏障、安全、与 其它药物没有叠加毒性、可用于对亚硝基朦耐药的患者，因而引起广泛 的关注。文献报道替莫陛胺的合成方法较多，存在反应步骤长、收率低 或不利于工业化大生产等缺点。本文采用阿卡一水合物与亚硝酸钠反应 制备替莫嚏胺重氮盐中间体；甲胺基甲酰氯与三乙胺以二氯甲烷为溶剂 在低温下生成异氟酸甲酯，异氟酸甲酯不经过分离，直接加入替莫哇胺 重氮盐反应得到替莫唆胺，过量的异氯酸甲酯通过加入过量的乙醇完全 破坏；替莫理胺的精制我们采用二甲亚麻加热溶解后放冷析晶，再用无 水乙醇洗涤后加热回流30分钟，最后放冷至室温，过滤，干燥得到成品。最终生产的7批样品收率在41y4%,经质量检验，各项指标完全符合药 用要求。该合成方法简单,质量易于控制，反应过程中没有分离及纯化异M 酸甲酯，避免了直接使用异断酸甲酯带来的危害，具有很高的理论和实 际应用价值。本文还对上述工艺得到的替莫哇胺进行结构确认：包括元 素分析、红外吸收光谱、紫外吸收光谱、质谱、核磁共振谱等，最终结 果显示我们合成的替莫陛胺与其结构式完全一致。在质量研究部分，我们测定了替莫哇胺的一般理化性质，包括外观、嗅味、紫外吸收系数、常见溶剂中的溶解度、熔点、热分析和引湿性等.有关物质采用HPLC法,用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以流动相 A（0.5%醋酸）和流动相B（甲醇）进行梯度洗脱，检测波长为254nm；并对有关物质检查方法进行了验证：替莫嚏胺已知杂质阿卡和重氮盐的 定量限分别为0.37和0.61ng；替莫哇胺和中间体、强降解杂质、工艺杂 质都能达到很好的分离，表明方法具有很好的专属性；杂质阿卡、重氮 盐在定量限杂质标准的120%的范围内呈良好的线性；加样回收率均在 95%105%的范围内：多次测定或不同人员、仪器、实验室测定结果能得 普莫哇胺工艺条件探索与质量研究到良好的重现；通过将色谱条件的柱温、流速、有机相比例、不同批号 的色谱柱等条件进行小的变动，考察同一批次样品有关物质测定系统适 应性是否符合要求，测试结果表明该方法的耐用性也很好。根据本品的 合成工艺以及所用溶剂的毒性，需要检测的残留溶剂为乙醇、二氯甲烷、二甲亚网、甲胺基甲酸乙酯，我们采用GC法，并对上述溶剂的检测也 进行了方法学验证。由于本品为无菌原料，我们参照中国药典，对内毒 素和微生物限度也提出了控制要求。含量测定亦采用HPLC法，用十八烷 基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇0.5%冰醋酸溶液（10：90）为流动相 进行等度洗脱，检测波长为254nm；对其测定方法的回收率、精密度、耐用性等项目也进行了验证。质量研究结果表明，我们提出的质量标准 是合理可行的，完全能控制替莫哇胺的质量。【关健词替莫哩胺阿卡一水合物替莫哇胺重氮盐异毓酸甲酯合 成结构确认有关物质残留溶剂含量测定质量标准替莫哇胺工艺条件探索与质量研究Temozolomide synthesis conditions and quality control exploration Chemical Engineering College,Nanjing University,Yanwu WanAbstract Temozolomide has been emerging in recent years as a primary treatment for malignant glioma.I t is also effective to a wide spectrum of tumors,can be taken orally,is easy through the bloodbrain barrier security,and no superposition of toxicity when taken with other drugs,can be used for patients with nitrosourea-resistant,词lich caused widespread concern.There are many synthesis metheds of Temozolomide reported,加ich have a long reaction steps,low yield or not suitable for industrial mass production and other disadvantageous.I n this paper,dacarbazine monohydrate is prepared fbr the intermediates of temozolomide diazonium salt with sodium nitrite.Methylaminoformyl chloride and triethylamine in dichloromethane as solvent at low temperatures generate metiiylisocyanate,methyl isocyanate without separation directly mixes with temozolomide diazonium salt for temozolomide.Excess methylisocyanate is destroyed by the addition of excess ethanol completely.Purification of temozolomide:temozolomide is dissolved in hot dimethyl sulfoxide,then cooled to room temperature for crystallization,and then washed,refluxed fbr 30 minutes by ethanol,and finally cooled to room temperature,filtration,drying to get the product.Final production yield of 7 batehes is ftom 41 to 44%.By the quality inspection,the indicators are in full compliance with medical requirements.The synthetic method is simple,easy to control quality,and there is no side ration,separation and purification of methylisocyanate,avoiding the direct use of methylisocyanate harm,with high theoretical and practical value.This paper also received the process of temozolomide for structural confumation,including elemental analysis,R UV absorption spectroscopy,mass spectrometry,nuclear magnetic resonance spectroscopy.The final results show that the temozolomide fully consists with its structure.I n the component of quality reseach,we determined temozolomides general physical and chemical properties,including appearance,odor,UV absorption coefficient,the solubility of common solvents,melting point,thermal analysis and hygroscopicity and so on.Related substances is detemined by HPLC,with octadecyl silane bonded silica as a filler,the mobile phase A(0.5%acetic acid)and mobile phase B(methanol)gradient elution and detection wavelength 254nm.Related substances method has been verified:limits of quantitation were 0.37 and 0.61ng of temozolomide known impurities Dacarbazine and diazonium salt;temozolomide,intennediates and impurities of Strong degradation achieve good sq)aration,indicating that the method has good specificity;dacarbazine,diazonium salt impurities show good linearity between the limit of quantification 120%range;recoveries of known impurities varies between 95%to 105%range;multiple determination or different personnel,instruments,laboratoiy results can get a good measurement reproducibility;with chromatography conditions slight variation such as flow rate,the proportion of organic phase,different batches of columns,we detemined 替莫嚏胺工艺条件探索与质量研究_the related substance of same batch to ascertain whether the system suitability meets the requirements,test results show that the method is also very good durability.According to the synthesis process and toxicity of used solvents,residual solvents required detection are ethanol,dichloromethane,dimethyl sulfoxide and methyl ethyl amine,we used GC method to detect them,and had analysis confinned.Because the product is sterile raw materials,endotoxin and microbial control requirements also raise the limits refering to the Chinese Phannacopoeia.Assay is measured also by HPLC with octadecyl silane bonded silica as a filler;methanol-0.5%acetic acid solution(10:90)as mobile phase isocratic elution,detection wavelength 254mn;its detennination recovery,precision,durability have also been verified.Quality results show that our quality standards is reasonable and feasible,fully able to control the quality of temozolomide.Key words Temozolomide,dacarbazine monohydrate,diazonium salt,methyl isocyanate,synthesis,structure confirmation,residual solvents,assay,quality standards-4-替莫嚏胺工艺条件探索与质量研究一、选题背景替其陛胺（Temozolomide）是近年来出现的一种治疗脑胶质瘤有较好疗效的新药,其优点是具有较宽的抗肿瘤谱、可口服、易于透过血脑屏障、安全、与其它药物没有 叠加毒性、可用于对亚稍基服耐药的患者，因而引起广泛的关注。替莫隆胺不仅对脑 胶质痛有较好的疗效，对白血病、黑色素瘤、淋巴病和实体痛也有较好疔效。它由英 国癌症研究战略技术公司开发，Schering-Plough公司生产，1997年在欧盟CPMP 一 致推荐下得到批准，并于1998年在欧洲上市。1999年1月美国FDA专家顾问小组一致推荐加速替其畦胺的批准，并于1999 年8月11日通过FDA批准在美国上市。同时该公司已向16个国家包括加拿大、澳 大利亚、新西兰、瑞士、挪威、南非和巴西等国家提出上市申请.注射用替莫嚏胺于 2009年2月27日通过FDA批准在美国上市。目前国内仅批准了江苏天士力帝益药 业有限公司的原料及其胶囊的生产.替莫哇胺原料监演I期于2008年8月已到期，经 查询本品种国内无化合物专利及品种保护期限制。根据文献报道，替莫嚏般的合成路线概括起来主要有以下几种：路线一叫 Cancer Research Campaign Technology Limited 公司报道了用 4氨基氨基甲酰基咪嗖盐酸盐（阿卡盐酸盐）与亚硝酸钠反应制备4重班基4H咪嘤甲觥 胺，4重气基4H咪畦5甲酰胺与异锐酸甲酯反应得到替莫唆胺产品。该路线收率较 高，但异显酸甲酯为高毒、易爆的化学品，不易储存与运输，不利于大规模的工业化 生产.Scheme 1路线二：由于异瓶酸甲酯高毒、易爆、不易储存与运输的缺点，Dr.Reddy*s Laboratories公司报道了使用N甲基N,N二苯基服在高温下裂解（260匕）制备异机 替莫畦胺工艺条件探索与质量研究_酸甲酣，并将蒸慵得到的异飙酸甲酯直接与4重氮1基4H咪哇-5甲酰胺反应得到替 莫畦股.该路线虽然将异锐酸甲酯现制现用，但高温裂解危险性大，不利于大规模生Scheme 2路线三叫江苏天士力帝益药业有限公司采用甲胺基甲酰氯在甲苯中同三乙胺反 应，将反应液直接精馅得到异锐酸甲酯。同Dr.Reddy*s Laboratories公司专利类似，异象酸甲酯的精慵存在爆炸，泄露等危险，不利于工业放大.Scheme 3路线四网：Schering公司报道了用阿卡盐酸盐与4硝基氯甲酸苯品反应制得化合 物3,化合物3与甲基肿反应得到化合物4,化合物4在四氢吠喃和乙脑的混合溶剂 中以高碘酸氧化制备普莫哇胺。该路线的虽然避免了使用异氨酸甲酯，但甲基肿为潜 在的致癌物质，并且该路线反应步骤较长，总收率低.替莫陛胺工艺条件探索与质量研究路以五5kSchering公司报道了用化合物7同N,N二（N甲基氨基甲酰基）甲 咪反应得到化合物8化合物8与亚硝酸钠反应得到化合物9,化合物9在浓硫酸中 水解得到替莫哇胺。该路线虽然避免了使用异斌酸甲酯，但反应步骤长，收率低，异 毓酸叔丁酯为高毒化学品.路线六1叫 CI PLA公司报道了用阿卡盐酸盐与甲胺基甲酰氯反应合成化合物10,化合物10与亚硝酸钠反应合成普莫嚏胺。该路线虽然避免了使用异1K酸甲酯，但需 要使用大量的二氯甲烷进行连续的液液萃取得到替莫哇胺，生产效率低，成本高.路线七：Ste危no报道的合成路线与CI PLA公司的合成路线相似，虽然避免了 使用异肌酸甲酯，但最终产品需要树脂柱处理，收率低，成本高.Scheme 7路线八：Gerrit.J anKoomen等人报道了以5.硝基咪嚏为起始原料，通过多步反 应合成化合物17,化合物17在366nm光照下发生光化学反应得到替其嘎胺。该合成 方法路线长，总收率低，不利于工业化生产。-7-普莫哇胺工艺条件探索与质量研究Scheme 8(i)HMO3,AgO;Q。WON,NaHCOj,MeOH,HjO;(N)diydrapyran p-TsOH EtOAc;(I vJHjJO%PVQ EtOAc.I t；MNalOc%O.EtOAc；(*ftDCM-HOAc；OrlOTFA-HCAc-MeOH;cone.HC 卜 HOAc;M acetone41：10000几乎不溶50 mg冰装酸10ml全溶1：200微溶从表32的试验结果可以看出，本品在二甲亚碾1中略溶，在水中微溶，在冰醋酸仪器型号：YRI Z天津大学精密仪器厂测试条件：样品已在真空干燥箱（60C）中干燥至恒重，依法（中国药典2010 年版二部附录VIC）测其熔点。取样品S0908100U9进行试验，样品从185c左右开 始变黑，同时毛细管壁可见粉红色物质生成，剩余黑色残留物继续加热至250c未见 融化。该样品熔点不易测定。35 热分析QGA-DSC）仪器型号：Perkin-Elmer Pyris 1吹扫气：氮气升温速率：TGA:20.0C/min,DSC:10.0 r/min温度范围：TGA:25-700t,DSC:50-300rTGA图谱见图3J,样品自室温至180C保持恒重，这表明样品不含有结晶水和 残留溶剂。随后样品开始分解，200c左右样品失重剧烈，在约210C失重有所减缓，至700c失重约78%.样品的DSC图谱见图32,样品在205c有吸热峰。图 3-1 TGA 图（批号 RS0908100119），O-20-替莫陛胺工艺条件探索与质量研究图 3-2 DSC 图（批号 RS0908100U9）3.6.引湿性试验按药物引湿性指导原则（中国药典2010版二部附录XIX J）进行。试验方法：取一定量的供试品，置已精密称重（mi）的具塞玻璃瓶（外径为50mm，高 为15mm）中，精密称重（叫）；把称量瓶敞口置于适宜的人工气候箱（设定温度为 25七1七，相对湿度为80%t2%）内，放置24小时，再盖好称量瓶盖子，精密称重（m3）,按下表计算和判断结果。引湿性判断标准增重百分比=叱xlOO m2-m判断标准：极具引湿性：吸湿增重力5%；有引湿性：吸湿增重215%；略有引湿性：吸湿增重022%；潮解：吸收足量水分形成液体。试验结果:人工气候箱：KBF-720综合药品稳定性试验箱设定温度为25C,相对湿度为80%将样品按上述方法进行引湿性试验，S0908100U9的吸湿增重为0.22%,说明本品 略有引湿性。4.鉴别4.1.紫外吸收光谱取本品，加冰醋酸溶液（5-1000）定量稀释成每1ml中约含10ug的溶液，照分 光光度法（中国药典2010年版二部附录W A）于200400nm的波长处测定吸收度,在254与330nm的波长处有最大吸收，在240与279nm的波长处有最小吸收。利用 最大和最小吸收波长作为鉴别。-2/-替莫嗖胺工艺条件探索与质量研究4Z红外吸收光谱 本品的红外光吸收图谱应与对照品的图谱一致（中国药典2010年版二部附录I VC）.4.3.HPLC用含量测定项下记录的色谱图中，供试品溶液主峰的保留时间与对照品溶液主峰的 保留时间一致，可以作为鉴别。5.检查5.1.有关物质照高效液相色谱法（中国药典2010年版二部附录V D）测定。5.1.1.仪器与试剂5.1.1.L 仪器高效液色谱仪：Pump：Agilent1200 Quatpump,编号：DE62971056Detector：Agilentl200 DAD,编号：DE64261384工作站：Agilent Chemstaion5.1.1.2.试剂醋酸：批号：09051810414,来源：南京化学试剂有限公司甲醇：批号：93366,来源：江苏汉邦科技有限公司水：本公司自制纯化水替莫嚏胺对照品批号：RS0908100119,来源:本公司，含量：100.0%,水分：0.02%.5.1.2.色谱条件的确定及测定方法参考（USP Pending Monograph Draft 1For Public Comment Temozolomide）和国 家食品药品监督管理局标准（试行）YBH05922004替莫哩胺，结合本公司的工艺路 线，确定替莫嘎胺有关物质的测定方法如下：检测波长为254nm。另取4-氨基-5-氨基甲酰基咪嚏盐酸盐（简称阿卡）对照品（本色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以流动相A（0.5%醋酸）和流动相B（甲醇）按以下程序进行梯度洗脱：时间（分）流动相A（0.5%醋酸%）流动相B（甲醇%）090108901025505040208050109055901060901022替英陛胺工艺条件探索与质量研究实验用阿卡一水合物代替）、替莫嚏胺对照品、4-重氨基-4H-咪哇-5-甲酰胺（简称 重氯盐）对照品各适精密称定.用稀释液（0.5%醋酸-甲醇（80-20）配制成分 别含阿卡、替莫畦胺、重氨1盐各0.1mg/ml的溶液，作为系统适用性溶液；取替莫哇胺 对照品适量，精密称定，用稀释液配制成含替莫嚏胺l.Oug/ml的溶液，作为有关物质 对照液；另取替莫哇胺样品用稀释液配制成LOmg/ml的溶液作为供试液,以上溶液不 稳定，配制后须立即测定量取上述系统适用性溶液20ul进样，出峰顺序依次为阿卡、重鬣盐和替莫陛胺，要求系统适用性溶液中替莫哇胺峰和重氨盐峰分离度不小于8.0；量取对照液20ul连续进样5针，替莫哇胺峰面积相对标准偏差不超过5.0%,用替莫嚏 胺峰调节仪器灵敏度，使主成分峰的峰高约为满量程10%以上。量取供试品溶液20ul 进样，记录各杂质峰面积，按以下公式计算有关物质含量：（r/r.）X（cycj X（1/F）X100其中：r产供试液各杂质峰面积r产对照液普莫瞠胺峰面积C产对照液替莫哇胺浓度（mg/mD 口=供试液替莫哇胺浓度（mg/ml）F=已知单个杂质校正因子（阿卡为1.80,重氟盐为0.81,其他未知单杂为 1.00）5.1.3.检测波长的确认替莫嚏胺、各步中间体和主要降解杂质的UV图，在普莫畦胺有关物质测定波长 254nm均有较大吸收，考虑到杂质和替莫畦胺吸收的差异，对已知杂质用校正因子法 计算含量.取替莫哇胺粗品及溶液加热破坏条件下的供试品溶液，用上述色漕系统检查降解 产物，经二极管阵列检测器分析，选择4个不同波长下的测定结果比较（见表51）表51.不同波长下的测定结果比较项目原料粗品破坏样品波长（nm）杂质个数纯度（）主峰面积杂质个数纯度（%）主峰面积210197.497449.2386.1013171.4240697.8612139.1384.6211827.0254698.4313443.1384.1013077.4280496.905774.1372.445622.8由表51可以看出，通过对4个不同波长下测定结果的比较，在254nm波长处 梯度运行基线较平稳，测得的杂质个数最多.所以检测波长可以选254nm.5.1.4.有关物质的系统适用性和进样精密度23-替莫陛胺工艺条件探索与质量研究分别配制系统适用性溶液和有关物质对照液进行系统适用性试验,重氮盐峰和替 莫哇胺峰之间分离度为11.9；对照液20ul重复进样5次，峰面积RSD为0.4%,见 图52,均符合系统适用性要求。色谱图见图51。5.1.5.专属性实验5.1.5.1.中间体实验5.1.5.1.1.单独进样稀释液编号保留时间(min)峰面积(mAU*s)17.95432.0627.97031.9037.99031.8148.00331.9258.02231.81平均7.98831.90RSD0.4%0.4%取稀释液进样20uL在3.0分钟处有小溶剂峰，40分钟后有许多梯度峰，但与阿 卡、替莫哇胺、重氮盐和其它未知杂质不重迭，该溶液对样品测试无干扰。5.1.5.1.2.单独进样中间体和样品溶液单独配制替莫陛胺(I mg/ml)、阿卡(0.0015mg/ml)、重氮盐(0.001重氯 盐降解产物(0.0010mg/ml)对照品溶液，单独进样确定保留时间，结果见表53。表5.3中间体试验结果名称最大吸收波长(nm)保留时间(min)相对保留 时间UV图HPLC 图24替莫嗖胺工艺条件探索与质量研究5.1.5.13.配制混样溶液替莫哇股254,3308.401.005-15-11阿卡2402662.090.255-25-12重氟盐246,3145.510.665-35-13重氮盐降解产物248,2785.190.625-45-14未知杂质(溶液加热)26615.741.875-55-21在替莫哇胺有关物质供试液中，分别加入0.15%阿卡和重氮盐，0.01%重氮盐降 解产物进样，见图5-2。阿卡、重氮盐降解产物、重氮盐和替莫哇胺的保留时间分别 为2.090分钟、5.195分钟、5.499分钟和8.432分钟,；上述中间体之间以及和替莫 理胺相互分离度均不低于1.5,符合实验要求。取替莫哇胺粗品配制成供试品溶液，进样20ul,各杂质和替莫嘎胺分离良好，同 时做峰纯度检测，纯度因子均大于阈值。5.1.5.3.降解实验分别取取替莫哇胺对照品适量，进行溶液室温放置、酸、碱、加热、氧化、光照 等破坏试验，用上述色谱系统检查降解产物，结果见表54：表54降解实验结果项目降解方法总杂(%)物料平衡(%)主峰光谱纯度色谱图起始配制替莫嗤胺溶液立即进样未检出/999.55-17溶液室温放置起始溶液室温暗处放置4.5h后进样0.1199.0999.75-18-25-替莫哇胺工艺条件探索与质量研究破坏取替莫哇胺加入2.0*10Mmo!级氧化钠 溶液破坏3小时中和并稀释成0.5mg/ml 进样3.2695.1999.75-19酸破坏取普莫哇胺加入02noi/L盐酸溶液破坏5 小时中和并稀释成0.5mg/ml进样0.4598.9999.85-20溶液加热破坏配制0.5mg/ml替莫隆胺溶液901水浴加 热4小时后进样15.9091.2999.55-21固体加 热破坏取替莫陛胺适量105c加热破坏4小时后 稀释成0.5mgAnl进样0.0199.7999.35-22氧化破 坏取普英畦胺适量用10%HA破坏4小时 后稀释成OSmg/ml进样0.29993999.65-23溶液光 照破坏配制0.5mgAnl替莫哇胺溶液4500Lux光 照射破坏5小时0.3199.4999.35-24物料斗F衡（%）=（降解试验后样品证施始样品量）*100%由上可以看出，在本色谱条件下，能够很好的检测出替莫陛胺有关物质和破坏性 实验产生的降解产物。物料平衡率均在91.299.7%之间，并且主峰峰纯度因子也均 超过阈值（洌0）因此，可采用上述色谱系统来测定本品中的有关物质及其降解产 物.5.1.6.检测限与定量限分别取阿卡、重氯盐和普莫嚏胺对照品，逐步稀释测定其定量限与检澳I限。定量 限以信噪比S/N=10计算：检测限以信噪比S/N=3计算，具体结果见表5-5：表5-5杂质的检测限与定量限结果杂质阿卡重氯盐替莫理胺定量限037ng0.61 ngl.Ong检测限0.1 I ng0.18ng0.3ng5.1.7.方法耐用性5.1.7.1.有关物质溶液稳定性照有关物质测定法配制替莫哇胺供试品溶液，按如下时间点测试：0小时（初始 点）、2小时、4小时、7小时、12小时、17小时、30小时。结果见表52：表5-6有关物质测定溶液稳定性结果溶液放峰1（阿卡）峰2（重氯盐降 解产物）峰3（普莫畦胺）峰4峰5置保留时间归一化 含量保留时间归一化 含量保留时间归一化 含量保留 时间归一化 含垃保留 时间归一化 含量26替莫哇胺工艺条件探索与质量研究Oh2.0790.00%/7.94899.99%/21,1630.01%2h2.0890.16%S.0020.00%7.95499.71%15.2770.12%21.1790.01%4h2.0910.31%5.0030.01%7.95099.43%15.2750.24%21.1750.01%7h2.0800.51%5.0120.01%7.95799.07%15.2790.40%21.1700.01%12h2.0790.85%5.0140.02%7.95298.45%15.2740.67%21.1720.01%17h2.0791.23%5.0140.03%7.95397.79%15.2710.94%21.1670.01%30h2.0692.11%5.0200.05%7.91396.28%15.2411.55%21.1450.01%平均2.0810.74%5.0110.02%7.94798.67%15.2700.65%21.1670.01%RSD0.35%99.66%0.14%89.44%0.19%1.31%0.09%81.16%0.05%0.00%从上述结果可知，普莫嚏胺有关物质测定溶液室温下很不稳定，随着时间延长,有关物质迅速增加，主要降解产物为阿卡和15分钟处未知峰，故测定时要现配现进,不可长时间放置（配制后5分钟内进样）。5.1.7.2.耐用性通过将色谱条件的柱温、有机相比例、不同批号的色谱柱等进行小的变动，考 察同一批次样品有关物质测定系统适应性，达到对该色谱条件的耐用性考察目的，结果见表5-7.表5,耐用性结果条件变化连续进样峰面积RSD替莫隆胺和重氮盐分 高度起始有机相 比例0.5%醋酸/甲醇(85/15)1.1%8.10.5%酸/甲醇(95/5)0.4%20.2不同批号的 色谱柱Hienomenex Gemini 5um C18 2504.6mtn 编号 494503-42.5%11.7Phenomenex Gemini Sum C18 250*4.6mm 编号 498446-30.4%14.7柱温的改变25c0.3%13.235c0.5%11.8结论：智莫嚏胺有关物质测定中柱温、有机相比例、色谱柱W学作微小改变后，测试结果仍符合系统适用性要求（替莫嚏胺与重氮盐之间的分离度不小于&0,有关物 质对照连续进样峰面积的RSD不超过5.0%）.27替莫陛胺工艺条件探索与质量研究5.1.8.杂质的线性测定 5.1.8.1.阿卡线性测定分别称取阿卡一水合物适量，配制成相对限度浓度为LOQ、50%、90%、100%、120%,分别注入液相色谱仪，记录色谱图，量取峰面积，以蜂面积为纵坐标，进样浓 度为横坐标进行线性回归，得线性方程尸73319x-1.170,0.9996,其中y为峰面积（mAu*S）,x为阿卡浓度（mg/ml）。结果见表5-8表5-8阿卡线性测定结果阿卡线性浓度范围LOQ50%90%100%120%进样浓度（mg/mD1.847E-056.925E-041.246E-031.385E-031.662E-03峰面积(mAu.*S)0.866849.2688.01100.8122.100 04 04 04 04 03 03 03 03 03浓度（mg/ml）5.1.8.2.重氮盐线性测定称取重氮盐适量，配制成相对限度浓度为LOQ、50%、80%、100%、120%,分 别注入液相色谱仪，记录色谱图，量取峰面积，以峰面积为纵坐标，进样浓度为横坐 标进行线性回归，得线性方程y=y=30853x-0.6242,r=0.9990,其中y为峰面积（mAu*S）,x为重氮盐浓度（mg/ml）。结果见表5-9。表59重氮盐线性测定结果浓度范围LOQ50%80%100%120%进样浓度（mg/ml）3.032E-056.743E-041.196E-031.638E-031.964E-03峰面积（mAu.*S）0.878819.6636.3148.5261.28-28-替莫理胺工艺条件探索与质量研究5.1.8.3.未知杂质线性测定最大未知杂质的限度为0.10%。所以称取适量替莫理胺按以下相对浓度配制溶液,LOQ、50%、80%、100%、120%,分别注入液相色谱仪，记录色谱图，量取峰面积,以峰面积为纵坐标，进样浓度为横坐标进行线性回归，得线性方程y=31682x+0.5360,产0.9999,其中y为峰面积（mAu*S）,x为替莫唾胺浓度（mg/ml）。结果见表510。表5-10未知杂质线性测定结果浓度范围LOQ50%80%100%120%进样浓度（mg/mD5.029E-055.029E-048.046E-031.006E-031.207E-03峰面积（mAu*.S）2.21016.4625.9432.1539.05未知杂底战性5.1.8.4.范围确定阿卡、重氮盐和未知杂质的浓度范围在定量限杂质标准的120%之间呈良好的 线性。5.1.9.阿卡和重氮盐加样回收率及含量计算的校正因子向替莫嗖胺样品中加入已知量的阿卡和重氮盐，按照替莫哇胺有关物质的测定方 法，再对阿卡和重氮盐的含量予以测定。选取三个浓度点：杂质定量限，限度的100%,限度的120%；每个浓度点配制三份样品。最后分别计算出阿卡和重氮盐三个浓度点 的平均加样回收率和平均校正因子。结果见表5-11和表5-12.表511阿卡和重氮盐含量计算校正因子测定结果-29-替莫嚏胺工艺条件探索与质量研究浓度阿卡重氯盐实际加入量(g)按0.1%对照计 算加入量(mg)校正因子实际加入量(ag)按0.1%对照计算加入量(mg)校正因子定量限0.0019620.0033661.720.0030940.0025220.820.0019620.0034311.750.0032730.0027050.830.0019620.0033971.730.0029960.0024190.81限度的100%0.16920.29841.760.12990.1033510.800.16920.305