一种筛选水稻Mutmap%2B突变位点的简易方法.pdf

命科学版），2 0 2 4，45（1）：2 7-32.引文格式：王延妍，颖颖，王子瑞，等种筛选水稻Mutma突变位点的简易方法.扬州大学学报（农业与生Jan.2024Journal of Yangzhou University(Agricultural and Life Science Edition)2024年1月Vol.45 No.1扬州大学学报（农业与生命科学版）期第45卷第DOl:10.16872/ki.1671-4652.2024.01.004一种筛选水稻Mutmap十突变位点的简易方法王延妍，李颖颖，王子瑞，毛馨晨，唐家琪，于恒秀，张超（扬州大学农学院江苏省作物基因组学和分子育种重点实验室植物功能基因组学教育部重点实验室，江苏扬州2 2 50 0 9）摘要：利用基因组重测序技术进行基因定位目前已在水稻功能基因组学研究中得到广泛应用。其中，Mutmap十技术因无需进行杂交操作，且无需背景亲本的基因组信息，具有更广阔的应用前景。然而，目前Mutmap十技术筛选候选突变位点的方法依赖于复杂的数据计算，要求研究者具有较高的生物信息学知识。根据Mutmap十的实验原理，设计一种简单的筛选候选突变位点的方法。该方法对混池测序的表型池与非表型池的突变指数分别加以限定，即表型池突变指数等于1，非表型池突变指数小于0.5。对测序所得突变位点进行简单排序，即可得到候选突变位点。运用该筛选方法，从6 个水稻不育突变体成功克隆突变基因，并对其中1个突变体进行了细胞学表型的验证。该方法可简化Mutmap+技术的数据分析流程，便于将Mutmap+技术更好地运用到水稻功能基因组学研究中。关键词：水稻；Mutmap十；突变位点筛选；基因克隆中图分类号：S511文献标志码：A文章编号：16 7 1-46 52（2 0 2 4)0 1-0 0 2 7-0 6A simple method to screen rice mutation sites in Mutmap+WANG Yanyan,LI Yingying,WANG Zirui,MAO Xinchen,TANG Jiaqi,YU Hengxiu,ZHANG Chao(Jiangsu Key Laboratory of Crop Genomics and Molecular Breeding/Key Laboratory of Plant Functional Genomics of the Ministry of Education/College of Agriculture,Yangzhou University,Yangzhou 225009,China)ABSTRACT:Genome re-sequencing technology is widely used in rice gene mapping and functional genomics studies.Mut-map+,a versatile method based on genome re-sequencing,has a broader application prospects because of its independenceof hybridization and genomic sequence of parental variety.However,current procedure to screen candidate mutation sitesof Mutmap+depends on complex data calculation,which requires a high level of bioinformatics knowledge.In this study.we designed a simple method to screen mutation sites in Mutmap+.This method defines the mutation index of phenotypepool and non-phenotype pool.The mutation index of phenotype pool is equal to l,and the mutation index of non-pheno-type pool is less than O.5.By simply sorting the mutation sites obtained from sequencing,candidate mutation sites can beobtained.Using this screening method,we successfully cloned mutated genes from six rice sterile mutants and verified thecytological phenotype of one of the mutants.This method can simplify the data analysis process of Mutmap+technology,so as to better apply it to the research of rice functional genomics.KEY WORDS:rice;Mutmap+;mutation sites screen;gene cloning以水稻突变体为材料克隆突变基因，解析基因影响突变表型的分子机制，是水稻功能基因组学研究的重要途径。传统的图位克隆方法需进行定位群体构建、连锁标记筛选、精细定位及候选基因验证等步骤，存在耗时长、效率低等缺点2 。随着二代测序技术的发展及测序成本的降低，基于基因组重测序的分群分析测序法（bulked segregantanalysis-sequencing，BSA-s e q）被广泛应用于目的基因的定位。BSA-seq利用存在表型差异的亲本构建分离群体，选取极端表型个体混池测序。通过比较混池中等位收稿日期：2 0 2 3-0.6-2 1基金项目：江苏省自然科学基金资助项目（BK20200951）作者简介：王延妍（2 0 0 2 一），女，江苏镇江人，扬州大学学生，主要从事水稻育性调控基因的克隆研究。*通信作者，张超，扬州大学讲师、博士，主要从事水稻功能基因组学研究：E-mail：c h a o z h a n g y z u.c d u.c n。28第45卷扬州大学学报（农业与生命科学版）基因频率，定位与目标性状相关联的变异位点。根据群体材料和目标性状的不同，BSA-seq又分为Mutmap、M u t ma p+、Q T L-s e q 及 Mutmap-gap 等多种类型3.6 2012年，Terauchi等3 在水稻中创造性地采用Mutmap法定位调控重要农艺性状的基因位点。Mutmap技术流程大致如下：经甲基磺酸乙脂(EMS)诱变获得性状稳定遗传的水稻突变体；突变体与背景亲本回交，然后自交得到F代分离群体；在F中取突变表型单株（2 0 30 株）组织进行等量DNA混池高通量测序；计算各突变位点的突变指数（某突变位点测到的次数除以该位点测到的总次数）。通过计算突变指数在全基因组的变化规律，寻找候选基因并进行验证。与传统图位克隆方法相比，Mutmap所需群体数量较少，且无需开发分子标记。更重要的是，Mutmap所用分离群体来自突变体与背景亲本杂交所得，可排除由杂交亲本序列差异导致的性状变异，使表型鉴定更加准确。目前，Mutmap法已广泛应用到作物基因的克隆过程，在作物功能基因组学研究中发挥重要作用7-10 1。在Mutmap的基础上，Fekih等4 建立了Mutmap+技术。该方法利用杂合家系中的突变表型单株和非突变表型单株各2 0 30 株分别进行混池测序。计算所有突变位点在2 个混池中的突变指数并将2 个指数作差，得到突变指数差。目标突变及其附近突变应具有较高的突变指数差值，据此可从众多突变位点中筛选候选突变位点并进行功能验证。Mutmap十技术无需通过杂交创制分离群体，而是用自交分离群体进行重测序，相对于Mutmap法更加简便。同时，Mutmap十不要求精确组装的野生型基因组序列作对照，大大降低测序成本并拓宽突变来源。因此，Mutmap十在植物功能基因组学研究中具有更广阔的应用前景。在得到2 个混池在所有突变位点的突变指数之后，常规Mutmap+筛选方法是计算2 个混池突变指数的差值。然后固定窗口大小及步长，计算每个窗口中突变指数差的平均值并对其在染色体上的分布进行作图。结合群体类型及混池单株个数进行置换检验，以一定置信水平以上的窗口为候选区间，从而得到候选突变位点。然而，由于测序深度的不均一性、测序偏差及相邻突变的相引相斥性的影响，常造成无法获得候选突变位点的情况。此外，上述突变筛选过程涉及复杂的统计学运算，非生物信息学专业人员如果进行相关参数的调整具有一定的难度。鉴此，本研究设计一种简单的Mutmap十突变位点筛选方法，在获得突变指数的前提下对突变指数进行简单排序，以快速确定候选突变位点。1材料与方法1.1突变体材料EMS诱变水稻品种日本晴，分单株收取M1代种子，2 0 19 年正季于江苏镇江市新民洲水稻基地分家系种植M2代。挑选具有不育表型分离的家系10 0 个（编号A1一A100），每个家系分单株收取6 株正常结实率单株的种子储存备用。2 0 2 0 与2 0 2 1年于扬州大学校内水稻基地取部分突变体材料分家系种植（每个家系2 0 株），筛选表型可稳定遗传材料。1.2测序样品准备2022年夏季，将表型稳定遗传的A5、A 7、A 8、A 18、A 19 及A20材料扩大种植，其中A5家系113株，A7家系9 2 株，A8家系110 株，A18家系7 9 株，A19家系130 株，A20家系137 株。每个材料在表型分离家系中取所有突变表型单株及相同数量的非表型单株叶片（A5两个混池各30 株，A7各2 0 株，A8各2 5株，A18各2 2 株，A19各31株，A20各37 株），等组织量混合成2 个样品池，送上海生工生物工程公司进行高通量测序1.3高通量测序及数据分析高通量测序及数据分析由北京诺禾致源科技公司重测序研究部完成，每个样品数据量为10 G。测序数据经质控过滤后与日本晴参考基因组（http：/r i c e.p l a n t b i o l o g y.ms u.e d u/p u b/d a t a/Eu k a r y o t i c _Pr o-jects/o-sativa/annotation-dbs/pseudomolecules/version-7.0/all.dir/）比对。以参考基因组为参照，分别计算2 个子代池的突变指数。SNP指数的全基因组分布图采用TBtools-II 绘制11.4花粉母细胞染色体观察取减数分裂时期的水稻幼穗，固定于卡诺固定液（乙醇、乙酸体积比为3：1）。将合适时期的花药29王延妍等：种筛选水稻Mutma突变位点的简易方法第1期置于载玻片上，滴加少许醋酸洋红，盖上盖玻片，观察并确定所处减数分裂时期。将样品脱色后置于液氮速冻，去掉盖玻片。样品晾干后，滴加4，6 二基-2-苯吲哚（DAPI)进行染色，盖上盖玻片，利用荧光显微镜（A2，德国Zeiss公司）进行染色体观察。2结果与分析2.1设定候选突变位点的筛选参数传统Mutmap十是基于表型池与非表型池的突变指数作差进行候选突变位点的筛选。本研究按照遗传学原理，提出分别对表型池与非表型池的突变指数进行限定的筛选参数（图1）。针对隐性单基因突变，筛选参数如下：突变表型易于区分，表型池应全为突变单株，因此候选位点的突变指数等于1；野生型单株候选位点突变指数等于0，杂合突变体单株候选位点突变指数的期望值为0.5。非表型池为野生型单株与杂合突变体的混合，因此候选位点的突变指数小于0.5。非突变等位non-mutation allele突变位点causal mutation非表型池表型池non-phenotypic poolphenotypic pool自交并按表型分类selfing and phenotyping突变指数=0mutation index=o突变指数=1mutationindex=l突变指数=0.5mutationindex=0.5突变指数 0.5突变指数=1mutation index0.5mutation index=1图1突变位点筛选原理示意图Fig.1Schematic diagram of mutation site screening2.26个不育突变体的基因定位首先对各突变材料进行遗传分析。6 个不育材料（A5、A 7、A 8、A 18、A 19 及A20）的突变表型均符合3：1（可育：不育）的分离比（6 个材料x3：1分别为0.14、0.52、0.30、0.34、0.0 9、0.2 9），表明不育表型均由基因的隐性突变所致。将各材料测序所得的所有突变位点及在2 个混池中的突变指数整合于Ex-cel表格中，运用上述参数进行筛选（表1）。以A5材料为例，2 个混池测序得到突变位点共2 8 40 1个（SNP位点2 38 0 4个，插人及缺失突变459 6 个）。在Excel表格中以表型池突变指数降序排序，筛选得到在表型池中突变指数等于1的突变位点48 2 0 个。这些突变位点中，有46 8 5个位点在非表型池中的突变指数也等于1，推测这些突变位点是由所用日本晴亲本与参考基因组的固有序列差异导致的。48 2 0 个突变位点再以非表型池突变指数升序排序，得到在非表型池突变指数小于0.5的突变位点4个。4个突变位点位于水稻第7 号染色体10 16 Mb的区间内，且均为SNP突变。根据水稻基因组注释数据库信息，30第45卷扬州大学学报（农业生命科学版）4个SNP位点中有1个位于基因编码区（chr7-12885357，位于LOC_Os07g22850，突变导致单个氨基酸发生替换），2 个位于基因内含子区（chr7-10250362，位于LOC_Os07g17360；c h r 7-157 54538，位于LOC_Os07g27150），1个位于基因间区（chr7-12515865）。有文献12 13 报道，LOC_O.07g22850为水稻II型聚酮合酶的编码基因OsPKS2，参与水稻花粉外壁发育过程。表1Mutmap+突变位点的筛选Tab.1Screening of mutation sites in Mutmap+位点数目筛后数目非表型池指数表型池指数位点信息材料位置mutationnumberafternon-phenotypicphenotypicpositionmaterialpositionnumberscreeningindexindexinformationA5284014Chr7-102503620.38（6/16)1(13/13)LOC-Os07g17360（内含子区）Chr7-125168650.36(5/14)1(13/13)基因间区Chr7-128853570.27(6/22)1(16/16)OsPKS2（错义突变）Chr7-157545380.31(5/16)1(9/9)LOC_Os07g27150（内含子区）A7297482Chr6-106772930.38(8/21)1(16/16)基因间区Chr11-274897200.4(8/20)1（2 5/2 5)OsGPAT3（错义突变）A827.0283Chr7-206643740.17(2/12)1（9/9)基因间区Chr7-210942880.08(1/12)1(14/14)基因间区Chr7-213196300.33（6/18)1（2 0/2 0)DTCI(无义突变)A18275042Chr4-239573770.31(5/16)1(13/13)CRC1(错义突变)Chr4-273202900.23(3/13)1(12/12)LOC_Os04g46100（内含子区）A19291932Chr1-400221410.2(5/25)1(22/22)OsMSP1（无义突变）Chr1-403658220.23(6/26)1(31/31)基因间区A20307563Chr8-1273880.21（5/2 4)1(16/16)基因间区Chr8-27377620.28(5/18)1(19/19)LOC-Os08g05250内含子Chr8-33037890.46(11/24)1(24/24)OsSPO11-2（剪接点突变）对材料A7、A 8、A 18、A 19 及A20的测序数据继续进行筛选。材料A7测序得到2 9 7 48 个突变位点，筛选后剩余2 个突变位点，其中chr11-27489720位点突变造成水稻甘油-3-磷酸酰基转移酶编码基因OsGPAT3的错义突变。有研究14-15报道OsGPAT3突变会导致水稻雄性不育。材料A8测序得到27028个突变位点，筛选后剩余3个突变位点，其中chr7-21319630位点的突变使水稻DTC1（d e f e c t i v e t a-petum celldeath 1)基因发生无义突变，造成蛋白质翻译的提前终止。DTC1是绒毡层细胞程序化死亡的的调控因子，与OsMT2b互作，抑制OsMT2b的活性氧清除活性，进而调控绒毡层细胞程序化死亡16 。材料A18测序得到2 7 50 4个突变位点，筛选后剩余2 个突变位点，其中chr4-23957377位点的突变造成水稻联会复合体中央元件蛋白编码基因CRC1的错义突变。有研究17 表明CRC1基因突变导致水稻减数分裂同源重组无法起始，造成水稻不育。材料A19测序得到2 9 19 3个突变位点，筛选后剩余2个突变位点，其中chr1-40022141位点的突变造成水稻OsMSP1基因发生无义突变。该基因参与水稻性母细胞数目及花粉育性调控18 。材料A20测序得到30 7 56 个突变位点，筛选后剩余3个突变位点，其中chr8-3303789位点的突变造成水稻OsSPO11-2基因发生剪接位点的突变（基因第2 个内含子起始处GT突变为AT）。该基因突变导致水稻减数分裂过程无法形成二价体，从而产生败育表型19 1为了比较该筛选方法与常规滑窗法的筛选效率，利用常规滑窗法对A19及A20材料在全基因组的突变指数差（非表型池突变指数减去表型池突变指数)进行作图。由图2 可知，A19在候选位点附近（水稻1号染色体40 Mb，箭头所示）没有明显低峰。A20材料在候选位点附近（水稻8 号染色体3Mb，箭头所示呈现低峰，但未达到显著水平。可见，本研究的筛选方法较常规滑窗法具有更高的筛选效率。2.3A18定位结果的细胞学观察为进一步验证定位结果，选取A18材料进行细胞学观察。前人17 研究表明水稻CRC1蛋白参与减数分裂DNA双链断裂（double-strandbreak，D SB）的形成；crcl在减数分裂终变期呈现2 4个单价体的表型，单价体在减数分裂后期I发生不均等分离，造成配子遗传物质的不均衡。本研究对日本晴与材料A18纯合突变体花粉母细胞染色体进行观察。由图3可知，日本晴减数分裂终变期呈现12 个二价31王延妍等：种筛选水稻Mutm变位点的简易方法第1期A19chrlchr2chr3chr4chr5chr6chr7chr8chr9chr10chr11chr120.6-M(xopul-dNS)vintervalCI,95-CI.99-0.6-0.10.2030400102030010.203001020300102030010203000102030010200102001020.01020:3001020基因组位置genomicposition/MbA20chr01chr02chr03chr04chr05chr06chr07chr08 chr09chr10chr11chr120.6-(xepuI-dNS)WAMinterval-CI.95CI.990.3-VM-0.6-,010203040001020300102030001020.30010203001020300102030010200102001020010203001020基因组位置genomicposition/Mb图2材料A19与A20全基因组SNP指数差分布Fig.2Genome wide(SNP i n d e x)d i s t r i b u t i o n o f A 19 a n d A 2 0黑色曲线表示1Mb为窗口，1kb为步长的SNP指数差平均值；红色线与蓝色线分别为置信水平为9 5%和9 9%的置换检验阅值线；蓝色箭头指示实际候选突变位点。Theblackcurveindicatestheaverage（SNPi n d e x）o f w i n d o w s w i t h 1M blength and 1 kb step size;The red and blue lines represent the threshold lines for substitution tests with confidence levels of95%and 99%,respectively;The blue arrows indicate the actual position of candidate mutations.体，而材料A18纯合突变体呈现2 4个单价体。材料A18纯合突变体减数分裂染色体表型与CRC1基因突变表型一致，进一步表明材料A18的不育表型是由CRC1基因突变引起的。3小结与讨论本研究基于Mutmap十技术的原理，设计了一种简单快速筛选突变位点的方法。该方法对表型池与非表型池的突变指数分别进行限定，即表型池突变指数等于1，非表型池突变指数小于0.5。该方法可从数野生型wildtypeA18不育株sterileplantsofA18图3野生型与材料A18不育株减数分裂终变期染色体形态Fig.3Chromosome morphology of wild type andA18 mutants at diakinesis白色信号为染色体；标尺5m。T h e w h it e s ig n a ls a r e c h r o m o-somes;scale bars 5 m.量众多的突变位点中筛选得到候选突变位点。运用该筛选方法，本研究从6 个水稻不育突变体成功定位到候选基因。6 个候选基因均有文献报道参与水稻生殖发育过程。本研究对其中1个突变体进行进一步细胞学观察，发现其减数分裂染色体行为异常，与前人研究结果一致，进一步验证了定位结果的准确性。本方法操作简单，在获得所有突变位点的突变指数之后，运用Excel表格的排序功能即可完成筛选，不需要研究者具备复杂的生物信息学背景知识。将表型池的突变指数限定为1，是充分利用Mutmap十技术表型容易区分的优点。传统图位克隆方法需通过梗杂交配制分离群体，以获取足够多的多态性分子标记进行基因定位。但灿梗品种广泛的基因序列差异会掩盖目的基因突变所引起的表型变异。由于水稻梗杂交存在不育现象，使得这种干扰在育性调控基因的图位克隆中尤为明显。Mutmap+技术是利用自交家系进行群体分型，表型鉴定精准。根据遗传学原理，非表型池中目的位点的野生型纯合体与突变杂合体单株的比例应为1：2（基因型AA、A 之比为1：2）。因此，非表型池的突变指数的期望值为0.33。考虑到测序会存在偏差，本王子斌）（责任编辑32第45卷扬州大学学报（农业与生命科学版）研究将非表型池的突变指数设定为小于0.5。此外，本方法的筛选参数可根据筛选结果进行调节。如果筛选后没有得到任何候选位点（可能取样错误或存在较大测序偏差），可降低表型池突变指数（比如设定为大于0.9），以便获得较好的筛选结果。目前，已有针对重测序数据的简单分析流程及相关软件11.2 0 1，结合本研究所述候选突变位点筛选方法，Mutmap+技术的应用将更加广泛，在水稻乃至植物功能基因组学研究中发挥更大的作用。参考文献：1PETERS J L,CNUDDE F,GERATS T.Forward genetics and map-based cloning approaches JJ.Trends PlantSci,2003,8(10):484-491.2童继平，刘学军，韩傲男，等.水稻功能基因图位克隆研究进展J.中国生物工程杂志，2 0 12，32（3）：115-12 4.TONG J P,LIU X J,HAN A N,et al.Research advance in map-based cloning of genes in rice(Oryza sativa L.)JJ.Ch i n a Bi o t e c h n o l o g y，,2 0 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