硝酸银对白鲜试管无菌苗生长和药用成分含量的影响.pdf

第4 5卷 第4期2 0 2 3年1 2月 延 边 大 学 农 学 学 报A g r i c u l t u r a lS c i e n c eJ o u r n a l o fY a n b i a nU n i v e r s i t y V o l.4 5 N o.4 D e c.2 0 2 3收稿日期:2 0 2 3-1 1-0 3 基金项目:延边大学科技计划项目(延大科合字(2 0 1 9)第1 6号);吉林省科学技术厅自然科学基金项目(2 0 2 3 0 1 0 1 2 7 8 J C)作者简介:王梦文(1 9 9 3),女,山东淄博人,硕士研究生,研究方向为植物次生代谢产物的调控,E-m a i l:1 1 6 3 1 4 4 7 2 4 q q.c o m通信作者:南桂仙(1 9 7 8),女(朝鲜族),吉林延吉人,博士,讲师,E-m a i l:n a n g u i x i a n y b u.e d u文章编号:1 0 0 4-7 9 9 9(2 0 2 3)0 4-0 0 3 6-0 6 D O I:1 0.1 3 4 7 8/j.c n k i.j a s y u.2 0 2 3.0 4.0 0 6硝酸银对白鲜试管无菌苗生长和药用成分含量的影响王梦文,杜佳霖,董 睿,李鹏博,李 铜,金光德,南桂仙*(延边大学 农学院,吉林 延吉1 3 3 0 0 2)摘要:探究硝酸银(S i l v e rn i t r a t e,A g NO3)对白鲜生长及药用成分含量的影响,为药用植物白鲜的次生代谢调控提供理论依据。该研究以白鲜种子为试验材料,待种子萌发后移至添加不同浓度A g NO3的M S培养基中,处理3 0d后记录白鲜幼苗的根长、侧根数、鲜重和干重净增量,以不加A g NO3的M S培养基为对照(c o n t r o lt r e a t m e n t,C K),并采用高效液相色谱仪(H i g hp e r f o r m a n c e l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y,H P L C)测定白鲜幼苗中白鲜碱、梣酮、黄柏酮含量。结果表明:经1 0m o l/LA g NO3处理后显著促进了白鲜幼苗根的生长,0.5m o l/LA g NO3处理后显著提高了白鲜幼苗的侧根数、鲜重、干重净增量和黄柏酮含量,5 0m o l/LA g NO3处理后显著提高了白鲜碱含量,1m o l/LA g NO3处理后显著提高了梣酮含量。通过主成分分析,该试验筛选出的A g-NO3诱导子最佳浓度为0.5m o l/L。关键词:白鲜;药用成分;硝酸银;次生代谢调控中图分类号:S 5 6 7.2 3 9 文献标识码:A E f f e c t o f s i l v e rn i t r a t eo ng r o w t ha n dm e d i c i n a l c o m p o n e n t c o n t e n t o f i nv i t r oc u l t u r e dD i c t a m n u ss e e d l i n gWANG M e n g w e n,DUJ i a l i n,D ONGR u i,L IP e n g b o,L IT o n g,J I NG u a n g d e,NANG u i x i a n*(A g r i c u l t u r a l C o l l e g eo fY a n b i a nU n i v e r s i t y,Y a n j iJ i l i n1 3 3 0 0 2,C h i n a)A b s t r a c t:I nt h i ss t u d y,s i l v e rn i t r a t e(A g NO3)w a su s e da sa ne l i c i t o rt op r e l i m i n a r i l yi n v e s t i g a t et h ee f f e c to ng r o w t ha n dm e d i c i n a l c o m p o n e n t so f i nv i t r oc u l t u r e dD i c t a m n u ss e e d l i n g s t op r o v i d ea t h e o r e t i-c a lb a s i s f o rt h er e g u l a t i o no fs e c o n d a r ym e t a b o l i s mi nm e d i c i n a lp l a n t s.T h es t e r i l i z e dD i c t a m n u ss e e d sw e r e i n o c u l a t e d i n M Sm e d i u ms u p p l e m e n t e dw i t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fA g NO3.A f t e r3 0d a y so fc u l t u r e,r o o t l e n g t ha n d l a t e r a l r o o tn u m b e r,s h o o t f r e s ha n dd r yw e i g h tw e r er e c o r d e d,a n dt h ec o n t e n t so fd i c t a m n i n e,f r a x i n e l l o n ea n do b a c u n o n ew e r ed e t e r m i n e db yh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y(H P L C).T h er e s u l t s h o w e d t h a t r o o t l e n g t hw a so b v i o u s l y i n c r e a s e da f t e r t r e a t m e n tw i t h1 0m o l/LA g-NO3,b u t t h en u m b e ro f l a t e r a l r o o t sa n ds h o o t f r e s ha n dd r yw e i g h tw e r ep r o m o t e db y0.5m o l/LA g-NO.T h eh i g h e s tc o n t e n t so fm e d i c i n a lc o m p o n e n t sw e r ef o u n da td i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fA g NO3,n a m e l y,o b a c u n o n ec o n t e n ta t0.5m o l/LA g NO3,d i c t a m n i n ec o n t e n ta t5 0m o l/LA g NO3,a n df r a x-i n e l l o n ec o n t e n t a t 1m o l/LA g NO3.P r i n c i p a l c o m p o n e n ta n a l y s i sc o n f i r m e d5 0m o l/La st h eo p t i m a l 第4期王梦文,等:硝酸银对白鲜试管无菌苗生长和药用成分含量的影响A g NO3c o n c e n t r a t i o n.K e y w o r d s:D i c t a m n u s;m e d i c i n a l i n g r e d i e n t s;s i l v e rn i t r a t e;s e c o n d a r ym e t a b o l i s mr e g u l a t i o n 白鲜(D i c t a m n u sd a s y c a r p u sT u r c z.)属芸香科白鲜属多年生宿根草本植物,其根部入药,又称白鲜皮、山牡丹等,经常用于治疗湿热疮毒、黄水淋漓、湿疹、风疹等疾病1,还被证实有抗炎、抗真菌、止血、抗癌等药理作用2,因此,其需求量不断增加。近年研究表明,白鲜碱等生物碱类,黄柏酮、梣酮等柠檬苦素类化合物为白鲜主要有效成分3,具有多种生物活性。其中,白鲜碱具有强心、抗虫、抗真菌等活性4-5,黄柏酮具有抗癌、抗肿瘤的细胞毒性等活性6-7;梣酮具有良好的护肝作用,同时具有抗菌、杀虫等活性8-1 1。在中国、韩国和日本多用于治疗皮肤疾病1 2。由于对野生白鲜的过度开发,导致白鲜产量供不应求,如何合理利用药用资源提取更多的次生代谢产物是该试验的目的与初衷。目前,诱导子在药用植物次生代谢产物的提升方面被广泛应用,诱导子从来源上可分为外源性和内源性,根据性质可分为生物型和非生物型1 3。利用不同诱导子影响白鲜幼苗以提高其药用成分含量(白鲜碱、梣酮、黄柏酮)和次生代谢产物的研究报告愈发增多。其中,A g NO3作为常用的外源诱导子,已应用于药用植物促进其生长和提升次生代谢产物的研究。但是,目前其对于白鲜生长和次生代谢产物调控的研究鲜有报道。张志军等1 4的研究表明,A g NO3对马铃薯幼苗的根长有促进作用;许建民等1 5的研究表明,A g NO3对草莓组培苗的生长有促进作用,郭双等1 6研究表明,A g NO3可提高颠茄毛状根中的生物碱含量。该试验以白鲜种子作为试验材料,探究经不同浓度A g NO3处理后对白鲜试管无菌苗生长以及药用成分含量的影响,以期为白鲜次生代谢产物调控研究与规模化生产提供理论基础。1 材料与方法1.1 材料该试验的植物材料为白鲜种子,采收于安图白鲜栽培地。仪器和试剂:SW-C J-1 F D超净工作台(上海新苗医疗器械制造有限公司)、1 2 6 0高效液相色谱仪(H i g h P e r f o r m a n c e L i q u i d C h r o m a t o g r a p h y,H P L C,美国安捷伦公司)、S B-1 2 0 D超声波清洗机(宁波新芝生物科技有限公司)、乙醇、甲醇(色谱纯)、A g NO3(上海麦克林生化科技股份有限公司)、蒸馏水、M S培养基粉(青岛高科技工业园海博生物技术有限公司)、白鲜碱标准品、黄柏酮标准品、梣酮标准品(上海源叶生物科技有限公司),无特殊标记外的试剂均为分析纯。1.2 方法1.2.1 试验设计将消毒后的白鲜种子点在M S培养基中,待种子发芽后分别移到附加不同浓度A g NO3诱导子的M S培养基中培养,浓度分别为0.1、0.5、1、5、1 0、5 0、1 0 0、1 5 0m o l/L,以不加诱导子的M S培养基为对照(C K),每个培养基点1 0粒种子,4个培养基为1组,重复3次,培养3 0d后观察白鲜幼苗生长情况,其中添加A g NO3诱导子的培养基先暗培1 0d再进行光照,C K培养方式相同。培养温度(2 41),光照时间1 4h/d。1.2.2 计算方法该试验对白鲜幼苗根长、侧根数、鲜重净增量、干重净增量进行测量。其中,在测定根长时一组为2 0个幼苗根长平均值,在统计侧根数时一组为2 0个幼苗侧根数平均值,上述每个处理重复4次。鲜重净增量=处理后1 0棵幼苗鲜重-处理前1 0粒种子鲜重;干重净增量=处理后1 0棵幼苗干重-处理前1 0粒种子干重。1.2.3 检测方法与色谱条件该试验采用加热回流装置和高效液相色谱法检测白鲜中的白鲜碱、梣酮、黄柏酮含量。检测方法参考贾 晓 龙1 7的 试 验 方 法,色 谱 条 件:色 谱 柱 为YMC-T r i a r t-C 1 8(2 5 0mm4.6 0mm,5m);流动相为甲醇(5 5):水(4 5),流速1m L/m i n;白鲜碱、梣 酮 检 测 波 长 为2 3 6 n m,黄 柏 酮 检 测 波 长 为2 1 2n m1 8;色谱柱温度2 5;进样量1 0L。1.3 溶液的制备1.3.1 标准品母液将5 0m g白鲜碱、梣酮、黄柏酮标准品加入甲醇中定容至5 0m L,制得浓度为1m g/m L的母液。1.3.2 待测样品溶液将植物样品放入烘干箱5 5烘干34h,温度提高到1 0 0烘干12h,冷却后研磨,取1.0g样品,放入锥形瓶中,加入甲醇2 5m L,加热回流1h,水浴温度6 0,冷却取混合液补充少量甲醇并通过73延 边 大 学 农 学 学 报第4 5卷 0.2 2m微孔过滤,即得样品待测液。每个浓度重复3次。1.4 线性关系的考察分别吸取适量的白鲜碱、梣酮、黄柏酮标准品母液分别置于2 0m L容量瓶中,加入甲醇定容,分别得到不同质量浓度的白鲜碱、梣酮、黄柏酮标准品溶液,此时白鲜碱的质量浓度为5、1 0、1 5、2 0、2 5、3 0、3 5、4 0、4 5、5 0、5 5、6 0g/m L;梣酮的质量浓度为5、2 5、4 5、6 5、8 5、1 0 5、1 2 5、1 4 5g/m L;黄柏酮的质量浓度为1 5、4 5、7 5、1 0 5、1 3 5、1 6 5、1 9 5g/m L。取得不同质量浓度的白鲜碱、梣酮、黄柏酮标准品溶液后,在1.2.3的色谱条件下测定峰值。以质量浓度X为横坐标,峰面积值Y为纵坐标,绘制标准曲线,并计算不同浓度的标准品质量浓度对峰面积的回归方程(表1)。表1 白鲜碱、梣酮、黄柏酮标准品质量浓度对峰面积的回归方程T a b l e1 R e g r e s s i o ne q u a t i o nf o r t h ep e a ka r e ao f t h ed i c t a m n i n e,f r a x i n e l l o n ea n do b a c u n o n e s t a n d a r d s标准品名称回归方程白鲜碱y=1 3 4.6 9x-2 3.2 5 9(R2=0.9 9 98)梣酮y=2 4.3 3 1x+7 4.9 8(R2=0.9 9 91)黄柏酮y=2 1.9 1x+1 1.1 3 9(R2=0.9 9 95)1.5 精密度试验分别取0.1m g/m L的白鲜碱、梣酮、黄柏酮标准品母液,在1.2.3的色谱条件下,连续进样5次进行检测,白鲜的峰面积平均值为13 4 84 1 6.6 6 7、梣酮的峰面积的平均值为10 0 19 7 7.5 6、黄柏酮的峰面积平均值19 9 92 8 9.3 3 3,相对标准偏差R S D分别为1.6 7%、1.5 9%、1.3 8%,均2%,结果说明精密度好,符合分析要求。1.6 重复性试验称取同一浓度处理的白鲜幼苗,按照“1.3.2”流程制作供试样品溶液,在1.2.3色谱条件下,连续进样5次,测定并计算白鲜碱、梣酮、黄柏酮含量的R S D,均 2%,结果表明重复性很稳定,符合分析的要求。表2 检测供试验品中白鲜碱、梣酮、黄柏酮含量的重复性试验T a b l e2 R e p e a t a b i l i t y t e s t o fd i c t a m n i n e,f r a x i n e l l o n ea n do b a c u n o n ec o n t e n t s进样次数/次白鲜碱/(gg-1)梣酮/(gg-1)黄柏酮/(gg-1)12 7 2.6 61 3 4.2 23 7 5.8 022 7 2.5 61 3 2.5 63 7 2.8 232 7 3.8 21 3 3.3 13 7 5.6 542 7 3.3 81 3 4.6 53 7 1.9 852 7 5.7 11 3 2.6 13 7 5.8 8平均值2 7 3.6 31 3 3.4 63 7 4.4 2R S D/%0.50.70.71.7 试验数据分析该试验采用E x c e l进行数据汇总,S P S S2 6统计软件对试验数据进行单因素方差分析和主成分分析。2 结果与分析2.1 不同浓度A g N O3对白鲜试管无菌苗生长的影响2.1.1 不同浓度A g NO3对白鲜试管无菌苗根部生长的影响不同浓度A g NO3处理后白鲜试管无菌苗根的生长和侧根数均出现了显著差异(表3)。白鲜幼苗的根长和侧根数随着A g NO3浓度的增加呈现先提升后减少的趋势。表3 不同浓度硝酸银对白鲜幼苗根部生长的影响T a b l e3 E f f e c t so fd i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n so f s i l v e rn i t r a t eo nr o o t g r o w t ho fD i c t a m n u ss e e d l i n g s浓度/(m o lL-1)根长/c m侧根数/条01.4 10.5 3 e0.10.1 2 d0.15.6 40.3 6 d2.2 80.3 3 a0.56.3 40.2 8 c d2.4 30.3 0 a16.4 70.3 3 c d2.3 40.2 0 a58.3 50.2 9 a2.2 10.1 2 a1 08.7 50.5 2 a2.1 60.1 2 a5 07.4 80.1 7 b1.8 00.5 8 b1 0 07.0 10.1 4 b c0.4 60.3 2 c1 5 06.6 20.9 0 b c0.9 00.0 7 c 注:表中数字后的字母表示不同浓度硝酸银处理下的差异显著性(P1,积累贡献率为9 3.4 8%,因此可代表原来的所有指标绝93延 边 大 学 农 学 学 报第4 5卷 大部分信息。主成分1主要综合了侧根数(0.9 3 0)、干重净增量(0.8 3 3)、梣酮含量(0.6 5 9)和黄柏酮(0.7 6 4),代表原始数据信息量的4 9.0 7 5%,主成分2主要综合了根长(0.7 7 8)和白鲜碱含量(0.8 8 6),代表原始数据信息量的2 7.2 5 3%,主成分3为鲜重净增量(0.6 6 4),代表原始数据信息量的1 7.1 5 2%。由A g NO3所有浓度处理后的综合得分排名可知,A g NO3对白鲜生长和3种药用成分总含量促进作用 最 为 明 显 的 浓 度 为0.5m o l/L,其 次 是5m o l/L、1 0m o l/L(表7)。表7 硝酸银各浓度主成分得分及综合排名T a b l e7 P r i n c i p a l c o m p o n e n t s c o r e sa n dc o m p r e h e n s i v e r a n k i n go f s i l v e rn i t r a t ec o n c e n t r a t i o n浓度/(m o lL-1)F 1排名F 2排名F 3排名F排名0-1.7 59-0.5 99-0.1 88-2.5 290.10.2 05-0.3 270.0 54-0.0 760.51.4 61-0.5 080.2 321.1 9110.6 73-0.1 76-0.2 590.2 5550.7 020.2 44-0.0 850.8 621 00.2 340.4 52-0.1 570.5 235 0-0.0 760.4 71-0.1 060.341 0 0-0.3 570.1 250.1 63-0.0 771 5 0-1.1 080.2 930.3 31-0.4 88 注:F 1表示第1个主成分的得分,F 2表示第2个主成分的得分,F 3表示第3个主成分,F表示综合得分。3 讨论与结论药用植物是生产多种天然化合物的高等植物种类1 9,根据主效成分划分为黄酮类、生物碱类等植物2 0。白钢等2 1认为,植物中的特殊药用成分能增强体质、改善脏腑功能。药用植物是中药的重要组成部分,我国对药用植物的需求量非常巨大2 2。白鲜中的药用成分具有清热燥湿、祛风解毒之功,可用于湿热疮毒、黄水淋漓、湿疹、风疹、疥癣疮癞、风湿热痹、黄疸尿赤等2 3。随着白鲜皮的广泛应用,价格呈逐年上涨趋势,在东北三省及内蒙古等地区进行人工栽培,但由于相关生产操作规范不完善,市场流通的白鲜皮饮片有效成分含量不稳定,部分饮片不符合国家标准2 4。冷豆豆等2 5认为,通过诱导子可以调控植物代谢途径和药用含量。A g NO3作为常用的诱导子,是乙烯合成酶A C C的一种抑制剂2 6,A g+不仅可以调控细胞内的抗氧化酶活性2 7,还能促进植物再生、促进根的生长2 8。刘佳等2 9研究发现,A g NO3浓度在5 0、1 0 0m o l/L时,均显著性地提高了托品烷类生物碱的产量;高湖川3 0试验表明,A g NO3浓度在5 0m o l/L时,喜树碱的含量相对增加7 0.2 8%;李婷婷等3 1试验证明,A g NO3浓度在0.4 g/L时,抑制刺梨叶片愈伤组织褐化的效果最好;前人的研究结果表明,A g NO3对植物的次生代谢有调控作用,与该试验研究结果基本一致。但因A g NO3为有毒物质,利用不同浓度的A g NO3处理白鲜种子后白鲜幼苗中A g NO3残留的毒性大小尚未检测,如何消除A g NO3残留的毒性有待研究。此外,A g NO3在5 01 5 0m o l/L时,浓度跨度较大,在这之中是否还有更具体的浓度变化值仍需进一步探究。用不同浓度A g NO3处理白鲜已萌发种子,3 0d后测定了白鲜幼苗根长、侧根数、干重净增量、鲜重净增量和3种药用成分含量,对测定得到的数据进行方差分析结果产生了显著差异。对不同浓度A g-NO3处理下白鲜幼苗的各项指标进行主成分分析,结果表明0.5m o l/LA g NO3处理下各项指标的综合排名最高。参考文献:1 国家药典委员会,中华人民共和国药典M.北京:中国医药科技出版社:2 0 2 0.2 高丽娜,李睿超,周长征,等,白鲜皮化学成分及药理作用研究进展J.中国中药杂志,2 0 2 2.4 7(1 4):3 7 2 3-3 7 3 7.3 白媛媛,唐文照,王晓静.白鲜皮化学成分研究J.中药材,2 0 1 4,3 7(0 2):2 6 3-2 6 5.4 CHOU HC,CHE NJ J,D UHCY,e t a l.C y o t o x i c a n da n t i p l a t e l e ta g g r e g a t i o n c o n s t i t u e n t s f r o m t h e r o o tw o o do fM e l i c o p e s e m e c a r p i f o l i aJ.P l a n t a M e d i c a,2 0 0 5,7 1(1 1):1 0 7 8-1 0 8 1.04 第4期王梦文,等:硝酸银对白鲜试管无菌苗生长和药用成分含量的影响5 Z HAO W,WO L F E N D E R JL,HO S T E T TMANN K,e t a l.A n t i f u n g a l a l k a b i d s a n d l i m o n o i dd e r i v a t i v e s f r o mD i c t a n n u s d a s y c a r p u sS w i t zJ.P h y o c h e m i s t r y,1 9 9 7,4 7(0 1):7-1 1.6 M I L L E R E G,P OR T E R JL,B I NN I E W H,e ta l.F u r t h e rs t u d i e so nt h ea n t i c a n c e ra c t i v i t yo fc i t r u sl i-m o n o i d sJ.J o u r n a l o fA g r i c u l t u r a l a n dF o o dC h e m i s-t r y,2 0 0 4,5 2(1 5):4 9 0 8-4 9 1 2.7 J UN G HJ,S OKDE,K I M YH.P o t e n t i a t i n ge f f e c t o fo b a c u n o n e f r o mD i c t a n m n u s d a s y c a r p u so nc y t o t o x i c i-t yo f m i c r o t u b u l ei n h i b i t o r s,v i n c r i s t i n e,v i n b l a s t i n e,a n dt a x o lJ.P l a n t aM e d i c a,2 0 0 0,6 6(0 1):7 4-7 6.8 徐 强.梣 酮 作 为 肝 病 治 疗 药 物 的 应 用:中 国.C N 2 0 0 5 1 0 0 4 0 8 7 8.9P.2 0 0 6-0 1-2 5.9 卫粉 艳,原 春兰.白 鲜 皮杀 虫 活 性 成 分 的 分 离 与 鉴定J.西北农业学报,2 0 0 6,1 5(0 4):9 3-9 5.1 0 吕敏.梣酮的杀虫活性及作用机理的初步研究D.杨陵:西北农林科技大学,2 0 0 9.1 1 王麦玲,张继文,钱勇,等.白鲜皮杀菌活性成分的研究J.农药,2 0 0 6,4 5(1 1):7 3 9-7 4 1.1 2 K I M H,K I M M,K I M H,e t a l.A n t i-i n f l a mm a t o r ya c-t i v i t i e so fD i c t a m n u s d a s y c a r p u sT u r c z,r o o t b a r ko na l l e r g i cc o n t a c td e r m a t i t i si n d 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