一例赤大袋鼠梭菌性肠炎的诊断和病原分离鉴定.pdf

Chinese Journal of Wildlife 2024，45（2）：403-408Chinese Journal of Wildlifehttp：/一例赤大袋鼠梭菌性肠炎的诊断和病原分离鉴定董俊斌1，李静2，丁玉林1，王文龙1，高娃3，郑秉武4，张迪5，王金玲1*（1.内蒙古农业大学兽医学院，农业农村部动物疾病临床诊疗技术重点实验室，呼和浩特，010010；2.内蒙古自治区科学技术厅，呼和浩特，010000；3.内蒙古自治区蜱媒人畜共患传染病重点实验室，河套学院医学系，巴彦淖尔，015000；4.呼和浩特市动物园，呼和浩特，010050；5.内蒙古通辽市科尔沁区畜牧水产工作站，通辽，028000）摘 要通过临床症状、尸体剖检、组织病理学、毒素实验和细菌分离鉴定的方法确诊了1例由A型产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）引起的赤大袋鼠（Macropus rufus）梭菌性肠炎的自然病例。动物园1只成年赤大袋鼠突然精神沉郁、厌食，于20 h后死亡，尸体角弓反张，腹围膨大。尸体剖检和组织学检查表明：胃肠道、肝脏和肾脏出现具有梭菌性肠炎证病意义的病变。小白鼠毒素实验结果显示，血样肠内容物内有急性致死性毒素。从出血的肠黏膜面分离到单一、有芽孢、粗大的革兰阳性杆菌，经产气荚膜梭菌毒素基因型多重PCR鉴定为A型产气荚膜梭菌。研究结果可为赤大袋鼠梭菌性肠炎的诊断和防控提供依据。Diagnosis and Pathogen Isolation of a Case of Clostridial Enteritis in Red KangarooDONG Junbin1，LI Jing2，DING Yulin1，WANG Wenlong1，GAO Wa3，ZHENG Bingwu4，ZHANG Di5，WANG Jinling1*稿件运行过程收稿日期：2023-12-06修回日期：2024-01-25关键词：赤大袋鼠；梭菌性肠炎；出血性坏死性胃肠炎；A型产气荚膜梭菌Key words：Red kangaroo（Macropus rufus）；Clostridial enteritis；Hemorrhagic necrotizing gastroenteritis；Clostridium perfringens type A中图分类号：S858.9文献标识码：A文章编号：2310-1490（2024）-02-0403-06DOI：10.12375/ysdwxb.20240220基金项目：内蒙古自治区科技重大专项课题（2021ZD0012）第一作者简介：董俊斌（1975），女，副教授；主要从事兽医病理学相关工作。E-mail：*通信作者：王金玲，E-mail：wangjinlin-野 生 动 物 学 报第45卷（1.College of Veterinary Medicine，Inner Mongolia Agricultural University，Key Laboratory of Clinical Diagnosis and Treatment Technology in Animal Disease，Ministry of Agriculture and Rural Affairs，Hohhot，010010，China；2.Inner Mongolia Science and Technology Agency，Hohhot，010000，China；3.Inner Mongolia Key Laboratory of Tick-Borne Zoonotic Infectious Disease，Department of Medicine，College of Hetao，Bayan Nur，015000，China；4.Hohhot Zoo，Hohhot，010050，China；5.Workstation for Animal Husbandry and Aquaculture in Horqin District，Tongliao，028000，China）Abstract：A natural case of clostridial enteritis in a red kangaroo（Macropus rufus）caused by Clostridium perfringens type A was diagnosed by clinical symptoms，necropsy，histopathology，toxin testing and bacterial isolation and identification.An adult red kangaroo was suddenly depressed and anorexic，and died 20 hours later，with opisthotonos and the expanded abdominal circumference in zoo.Necropsy and histologic examination revealed lesion in gastrointestinal tract，liver，and kidney that were suggestive of clostridial enteritis.Results of the mouse toxin test in revealed acute lethal toxin in the hemorrhagic intestinal contents.A single，bacillus-producing，bulky gram-positive bacillus was isolated from the mucosal surface of the hemorrhagic intestine and identified as Clostridium perfringens type A by multiplex PCR of the toxin genotype of C.perfringens.This study can provide a basis for the diagnosis，prevention and control of C.perfringens enteritis in red kangaroos.梭菌性肠炎也叫魏氏梭菌病，是由产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）引起的人和动物多发的肠道疾病，本病以急性、致死性和出血性肠炎为主要特征。产气荚膜梭菌过度生长，伴随着细菌外毒素的释放，导致感染动物胃或肠黏膜严重出血和坏死1。动物的梭菌性肠炎常见于牛2、马鹿（Cervus canadensis）3、野牦牛（Bos mutus）4、鹿（Cervidae）5和羊驼（Vicugna pacos）6等反刍动物，也有猪7、家兔8和马9等发生此病的报道。产气荚膜梭菌分泌的毒素有20多种，单一菌株产生特定毒素，根据菌株携带毒素的情况将其分为 7 个基因型：A 型（）、B 型（、）、C型（、+/-cpe）、D型（、+/-cpe）、E型（、+/-cpe）、F型（、cpe）和G型（、netB）10。赤大袋鼠（Macropus rufus）属有袋目（Marsupialia）袋鼠科（Macropodidae），产于澳大利亚，是袋鼠科中体型最大的一种11，以群居活动为主，生活于草原地带，以各种草类、野菜等为食12。目前，在国内外还未见赤大袋鼠梭菌性肠炎病例的报道。本研究通过多种方法确诊了1例赤大袋鼠梭菌性肠炎的死亡病例，为该类疾病的诊断和防治提供参考。1材料与方法1.1材料1.1.1实验动物1只病死老年赤大袋鼠，由大青山野生动物园提供。6只6周龄昆明种小白鼠（SPF级），购于斯贝福（北京）生物技术有限公司。1.1.2产气荚膜梭菌5种毒素基因特异性引物选取产气荚膜梭菌阳性菌株，根据已有文献1314设计、四种毒素基因引物，引物信息见表1。1.2方法1.2.1尸体剖检对病死赤大袋鼠进行尸体剖检，观察和记录大体病变。剖检过程中分别取心、肝、脾、肺和肾等全身各组织器官（1.5 cm1.0 cm1.0 cm），放入 10%福尔马林溶液中固定。1.2.2病理组织切片制备和观察对固定24 h的组织进行修块、脱水、透明、石蜡包埋、切片（厚度为3 m）、苏木素-伊红染色（HE）、封片和烤片，并在显微镜下观察。404董俊斌等：一例赤大袋鼠梭菌性肠炎的诊断和病原分离鉴定第2期1.2.3小白鼠毒素实验取空肠血样内容物3 mL，加2倍生理盐水稀释后，3 000 r/min离心5 min，取上清液，均匀分成2份，1份60 加热30 min，1份不加热。取6只小白鼠随机分为2组，3只/组。2份上清液分别腹腔注射于一组小白鼠，1.2 mL/只，观察结果至接种后24 h。1.2.4细菌分离和鉴定1.2.4.1细菌分离用接种环无菌挑取赤大袋鼠出血的肠黏膜组织，接种于硫乙醇酸盐液体培养基（FTG）内，37 厌氧培养 68 h，取培养物接种于梭菌选择性培养基（TSN培养基），37 厌氧培养68 h，观察菌落生长情况。挑取菌落制备涂片，革兰染色，镜检。1.2.4.2细菌毒素基因型多重PCR鉴定取纯培养的12个产气荚膜梭菌菌落，置于100 L蒸馏水中97 煮沸10 min，10 000 r/min离心10 min。取上清液用于 PCR 模板。PCR 反应体系：25 L 2Taq Master Mix酶，引物上、下游各1 L，DNA模板5 L，补水至 50 L混匀后进行扩增。PCR反应条件：95 预变性 7 min；94 变性 1 min，55 退火 1 min，72 延伸 1 min，35 个循环；72 再延伸 10 min；4，30 min。PCR程序结束后在2%琼脂糖凝胶上电泳，110 V 30 min结束后，在凝胶成像系统观察结果。2结果2.1临床病史大青山野生动物园的1只成年雄性赤大袋鼠突然精神沉郁、厌食，于第2天清晨死亡，病程20 h。2.2剖检病变病死赤大袋鼠尸体角弓反张，腹围膨大（图1），肛门周围毛上附着少量污红色稀便。血液呈黏稠的黑红色，凝固不良。腹壁腹膜表面有弥漫性分布的出血斑点，胃浆膜面散在大小不等的出血点。脾脏表面分布大小不等的黑红色轻度隆起病灶。肾脏严重淤血和水肿，呈暗红色，切面髓质有散在和密集呈细线状排列的灰色结晶样物，肾乳头部位结晶样物密集。肝脏轻度淤血和水肿，呈暗红色至黑红色，表面局灶性病变（土黄色），胆囊明显扩张。心肌色彩混浊无光，心脏横径明显增宽，心肌质软，右心室质软、扩张明显，左右心室内充满黑红色凝固不良的带有气泡的血液。肺脏呈粉红色，回缩良好，膈叶表面散在或密集大小不等的出血斑点，肺泡性肺气肿。空肠后段浆膜面呈污黑红色，肠系膜静脉因严重淤血怒张，局部浆膜面散在大小不等的出血斑点。空肠后段不同程度出血，肠黏膜表面散在或密布黑红色出血斑点，严重区域肠腔内充有大量污浊的黑红色血样液体，肠黏膜弥漫性出血，表面粗糙呈黑红色（图2，图3）。胃浆膜面及附近系膜出血呈黑红色，胃底部黏膜增厚，因严重弥漫性出血呈大面积黑红色（图4）。2.3组织病理学变化严重出血性坏死性胃肠炎，胃和空肠黏膜层和局部黏膜下层弥漫出血和水肿（图5），黏膜层上三分之二组织坏死，上皮细胞完全脱落，严重区域肠黏 膜层全部坏死，黏膜下层淋巴滤泡严重出血和坏死表1产气荚膜梭菌毒素基因引物信息Tab.1 Primer information of Clostridium perfringens toxin gene基因GeneAB引物名称Primer nameCPA-FCPA-RCPB-FCPB-RETX-FETX-RITXa-FITXa-RITXb-FITXb-R引物序列Primer sequence5-TTACTGCCGTTGATAGCG-35-TCATTTCCTGGGTTGTCC-35-TTTCCGGTTAGATACTCGAT-35-ACAGTTTCTTTCACGCTCCA-35-CTCATAATGTCCCTTCAC-35-CTCATCTCCCATAACTGCT-35-AATGGCGATGAAAAGCCTACAC-35-GCATAACCTGGAATGGCTGATA-35-CTTCTAGTGATACCGCTTCAC-35-CTGGATATGCTGCAACTAAAGG-3产物长度/bpProduct length475513272692111405野 生 动 物 学 报第45卷（图6）。肺轻度充血和水肿，肺泡腔内可见大量中性粒细胞和少量巨噬细胞，部分巨噬细胞出现“吞红”现象。急性肾小球肾炎，肾脏水肿，肾小管上皮普遍肿胀，局部整个肾小管上皮发生明显的透明变性。坏死性肝炎，肝脏淤血和水肿，肝细胞板上肝细胞排列松散，窦状隙壁溶解，破坏明显，肝细胞广泛散在性坏死，出现大小不等的坏死灶，无炎性细胞浸润，部分未坏死的肝细胞呈明显微泡性脂肪变性。急性炎性脾肿，脾脏严重充血和出血，淋巴细胞数量稀少，白髓数量少，体积缩小，红髓内淋巴细胞所剩无几。其他组织器官不同程度的变质性变化。2.4小白鼠毒素实验不加热组小白鼠于接种后1318 h全部死亡，加热组小白鼠接种后24 h未见异常。实验结果表明血样肠内容物内有致死性毒素。图1尸体角弓反张，腹部膨大Fig.1 The dead body with an enlarged abdominal circumference showed opisthotonos图2空肠出血性肠炎Fig.2 Jejunal hemorrhagic enteritis图3出血性坏死性肠炎Fig.3 Hemorrhagic necrotic enteritis图4胃底部黏膜严重出血Fig.4 Severe bleeding in the bottom of the gastric mucosa图5出血性坏死性胃炎：胃黏膜层因严重出血和坏死呈均质红染Fig.5 Hemorrhagic necrotizing gastritis：the gastric mucosal layer shows homogeneous red staining due to severe bleeding and necrosis406董俊斌等：一例赤大袋鼠梭菌性肠炎的诊断和病原分离鉴定第2期2.5细菌培养和鉴定2.5.1细菌培养在TSN培养基上生长出大量黑色圆形小菌落，菌落涂片可见大量单一的革兰阳性粗大杆菌（图7）。2.5.2产气荚膜梭菌毒素基因型多重 PCR鉴定产气荚膜梭菌毒素基因型多重 PCR 结果显示（图8），获得475 bp长的毒素基因目的条带，病原菌鉴定为A型产气荚膜梭菌。3讨论本病例赤大袋鼠临床症状表现为精神沉郁、厌食和排稀便，发病急，死亡快，尸体角弓反张。这些临床症状和家兔15、犊牛16感染梭菌性肠炎的表现相似。梭菌性肠炎具有证病意义的病变是胃肠道严重出血性坏死性炎。本病例赤大袋鼠剖检显示其患严重的出血性坏死性胃肠炎，胃、空肠黏膜层和局部黏膜下层弥漫出血和水肿，黏膜层组织坏死，上皮细胞脱落，黏膜下层淋巴滤泡出血和坏死；肠腔内有大量污浊的黑红色血样液体，肠黏膜弥漫性出血，呈黑红色。其他动物梭菌性肠炎也表现出相似的胃肠道出血性坏死性变化，如家兔梭菌性肠炎肠道肿胀充气，致使肠壁变薄而透明，肠黏膜上有大量出血点，胃黏膜脱落，出现溃疡灶15；犊牛梭菌性肠炎的空肠和回肠出现坏死性肠炎16。梭菌性肠炎肝脏和肾脏的病变也具有证病意义。本病例赤大袋鼠肾脏严重淤血和水肿，急性肾小球肾炎，切面髓质、肾乳头部位有结晶样物密集，肾小管上皮发生明显的透明变性。肝脏轻度淤血和水肿，出现坏死性肝炎。病死赤大袋鼠肾脏和肝脏的病变特征和家兔梭菌性肠炎病变15相似，患病家兔肾脏和肝脏均出现充血和肿大，并伴有肝细胞坏死。本病例赤大袋鼠剖检脾脏出现炎性脾肿，心脏出现心功能不全。这些病变与家兔发生的梭菌性肠炎病变相似，患病家兔脾脏肿大，为深褐色，心脏表面血管怒张，呈树枝状15。本病例中产气荚膜梭菌毒素基因型经多重PCR图6出血性坏死性肠炎：黏膜下层淋巴滤泡严重出血和坏死Fig.6 Hemorrhagic necrotizing enteritis：severe hemorrhage and necrosis of submucosal lymphoid follicles图7袋鼠肠黏膜纯培养的革兰阳性产气荚膜梭菌（1 000）Fig.7 Coarse gram-positive Clostridium perfringens were in the impression smear of duodenal mucosa（Gram s stain1，000）M.DL2000 DNA Marker；1.阳性对照；2.赤大袋鼠肠黏膜培养菌；3.阴性对照。M.DL2000 DNA Marker；1.Positive control；2.Red kangaroo intestinal mucosa culture bacteria；3.Negative control.图8毒素PCR扩增结果Fig.8 Multiplex PCR results of gene407野 生 动 物 学 报第45卷获得了毒素基因目的条带，病原菌判定为A型产气荚膜梭菌。梭菌性肠炎的防控难度较大。Artursson等17报道产气荚膜梭菌肠毒素（CPE）可以突破肠道间的紧密连接，引起食源性疾病。A型产气荚膜梭菌所产生的芽孢能够长时间存在于外界环境中，对环境造成污染，并会随动物饮食进入其消化系统。动物肠胃内益菌数量较多时，对梭菌肠炎病原体的抵抗能力就较强，不会发病。动物自身免疫力下降或者产生应激（长途运输、幼畜断奶或更换饲料）时，会导致消化系统功能紊乱、菌群失调，引起动物发病；宿主年龄变大或者疾病等诱发因素也可引起梭菌性肠炎的发生18。本案例中，年龄偏大、自身免疫力下降可能是赤大袋鼠发病的主要原因。定期进行疫苗免疫或在饲草料中添加磺胺咪片等可以预防动物梭菌性肠炎的发生19。参考文献：1 SIMPSON K M，CALLAN R J，VAN METRE D C.Clostridial abomasitis and enteritis in ruminants J.Veterinary Clinics of North America-Food Animal Practice，2018，34（1）：155-184.2 陈锦辉，郭宏军牛产气荚膜梭菌性肠炎的诊治 J 中国兽医杂志，2016，52（6）：49-50.CHEN J H，GUO H J.Diagnosis and treatment of Clostridium perfringens enteritis in cattle J.Chinese Journal of Veterinary Medicine，2016，52（6）：49-50.3 冉多良，黄嘉驷，苏艳，等马鹿产气荚膜梭菌性肠炎的诊治J.中国兽医杂志，2005，41（4）：54.RAN D L，HUANG J S，SU Y，et al.Diagnosis and treatment of Clostridium perfringens enteritis in red deer J.Chinese Journal of Veterinary Medicine，2005，41（4）：54.4 韩志辉野牦牛魏氏梭菌性肠炎的诊治 J 中兽医医药杂志，2001，20（2）：27-28.HAN Z H.Diagnosis and treatment of wild yak Clostridium perfringens enteritis J.Journal of Traditional Chinese Veterinary Medicine，2001，20（2）：27-28.5 ASCHFALK A，VALENTIN-WEIGAND P，MLLER W，et al.Toxin types of Clostridium perfringens isolated from free-ranging，semi-domesticated reindeer in NorwayJ.The Veterinary Record，2002，151（7）：210-213.6 ROSADIO R，LONDOE P，PREZ D，et al.Eimeria macusaniensis associated lesions in neonate alpacas dying from enterotoxemia J.Veterinary Parasitology，2010，168（1/2）：116-120.7 陈永云猪梭菌性肠炎诊治 J 中国畜禽种业，2016，12（12）：48.CHEN Y Y.Diagnosis and treatment of porcine Clostridium perfringens enteritisJ.The Chinese Livestock and Poultry Breeding，2016，12（12）：48.8 马爱华，朱凤霞一例肉兔魏氏梭菌性肠炎的诊治报告 J 畜禽业，2018，29（8）：132.MA A H，ZHU F X.Diagnosis and treatment report of a case of Clostridium perfringens enteritis in meat rabbits J.Livestock and Poultry Industry，2018，29（8）：132.9 DIAB S S，KINDE H，MOORE J，et al.Pathology of Clostridium perfringens type C enterotoxemia in horses J.Veterinary Pathology，2012，49（2）：255-263.10 ROOD J I，ADAMS V，LACEY J，et al.Expansion of the Clostridium perfringens toxin-based typing schemeJ.Anaerobe，2018，53：5-10.11 赵芳菊.赤大袋鼠饲养繁殖及人工育幼 J.畜牧兽医科学（电子版），2019（1）：22-24.ZHAO F J.Breeding and artificial breeding of red kangaroo J.Graziery Veterinary Sciences（Electronic Version），2019（1）：22-24.12 盛志鹏，李钦内固定治疗赤大袋鼠跗跖骨骨折病例 J 中国兽医杂志，2021，57（1）：116-117.SHENG Z P，LI Q.Treatment of tarsometatarsal fracture of red kangaroo with internal fixation J.Chinese Journal of Veterinary Medicine，2021，57（1）：116-117.13 MEER R R，SONGER J G.Multiplex polymerase chain reaction assay for genotyping Clostridium perfringens J.American Journal of Veterinary Research，1997，58（7）：702-705.14 BUESCHEL D M，JOST B H，BILLINGTON S J，et al.Prevalence of cpb2，encoding beta2 toxin，in Clostridium perfringens field isolates：correlation of genotype with phenotype J.Veterinary Microbiology，2003，94（2）：121-129.15 桑雷，孙世坤，陈岩锋，等 一例仔兔魏氏梭菌病的诊治J 中国养兔，2018（6）：32；31.SANG L，SUN S K，CHEN Y F，et al.Diagnosis and treatment of a young rabbit with Clostridium perfringens disease J.Chinese Journal of Rabbit Farming，2018（6）：32；31.16 李继堂，梁淑娟，刘兴福犊牛梭菌性肠炎的诊治 J 中国动物保健，2023，25（6）：42-43.LI J T，LIANG S J，LIU X F.Diagnosis and treatment of Clostridium perfringens enteritis in calves J.China Animal Health，2023，25（6）：42-43.17 ARTURSSON P，KNIGHT S D.Structural biology.Breaking the intestinal barrier to deliver drugs J.Science，2015，347（6223）：716-717.18 MINICH D，MADDEN C，NAVARRO M A，et al.Gut microbiota and age shape susceptibility to clostridial enteritis in lorikeets under human care J .Animal Microbiome，2022，4（1）：7.19 郑秉武，智宇，李彦军，等.一例大林羚肠毒血症的诊断 J.野生动物学报，2022，43（3）：788-792.ZHENG B W，ZHI Y，LI Y J，et al.Diagnosis of a case of enterotoxaemia in a common eland（Tragelaphus oryx）J.Chinese Journal of Wildlife，2022，43（3）：788-792.408