替加氟-焦脱镁叶绿酸A胶束的制备.pdf

基金项目:厦门医学院大学生创新创业训练计划资助项目(.)厦门医学院自然科学基金项目(.)福建省科技计划项目青年项目(.)作者简介:李逸龙男研究方向:药剂学:.通信作者:张志强男博士讲师研究方向:新型药物递送系统:.替加氟焦脱镁叶绿酸 胶束的制备李逸龙郭艺彬王琛段美涛张志强(厦门医学院药学系福建 厦门)摘要:目的 以替加氟和焦脱镁叶绿酸 为原料合成缀合物并将其制备成胶束实现光动力治疗和化疗的协同抗肿瘤作用 方法 以丁二酸酐连接替加氟衍生物与焦脱镁叶绿酸 通过核磁共振氢谱、质谱进行结构表征通过溶剂挥发法制备载药胶束以载药量、形貌、粒径、电位、体外抗肿瘤活性等对载药胶束进行制剂学评价 结果 替加氟焦脱镁叶绿酸 复合物的结构得以确证通过马尔文激光粒度仪和透射电镜验证所制备载药胶束粒径为.粒度均一载药胶束可持续释药 以上且激光照射可加速药物释放载药胶束经激光照射可增强体外抗肿瘤效果值为.其细胞毒性相较于单独给药替加氟增加至.倍 结论 替加氟焦脱镁叶绿酸 前药负载的胶束可实现替加氟的缓释作用并可通过光动力治疗联合化疗有效提高替加氟体外抗肿瘤效果关键词:光动力治疗化疗替加氟胶束抗肿瘤中图分类号:文献标志码:文章编号:():./.():.:目前应用于临床的癌症治疗方式主要有手术、化疗、放疗 其中化疗药物氟尿嘧啶及其衍生物(如替加氟)相对于其他化疗药物心脏毒性较小肾毒性和骨髓抑制较弱 然而氟尿嘧啶类药物给药剂量较大存在一定副作用 对氟尿嘧啶药物进行结构修饰可以提高其抗肿瘤活性并减少副作用进而改善其临床应用光动力疗法是一种新兴的抗肿瘤疗法由于其药学研究 .非侵入性、靶向治疗特性和低毒或无毒性而备受关注化疗药物与光敏剂共同负载的递药系统可实现化疗与光动力治疗联合抗肿瘤效果 光动力治疗不仅可辅助化疗增强靶向特异性二者协同作用还可清除残余肿瘤细胞并抑制损伤血管的再生能够有效增强抗肿瘤效果并降低副作用 但是化疗药物与光敏剂共同负载的递药系统存在一定局限性化疗药物的突释往往导致化疗失败或副作用增强光敏剂的突释导致光毒性和光动力治疗无效 国内外研究表明通过化学键将化疗药物与光敏剂连接不仅可以提高药物半衰期以增加药效还可实现药物缓释、按需药物释放、降低副作用等优势焦脱镁叶绿酸()为第二代光敏剂常用作光动力治疗的光敏材料 相较于第一代光敏剂其激发波长更长组织穿透性更强因此荧光成像效果与活性氧产生量都有所提高 将 与焦 化学键合对于 在增加其体内作用时间的基础上可避免因聚集引起的荧光淬灭效果对于 不仅可实现通过激光照射控制药物释放还可延长其体内循环时间避免提前释药引起的毒副作用两亲性聚合物自组装形成的聚合物胶束具有内部疏水和外部亲水的核壳结构可同时负载亲水性药物和疏水性药物是抗肿瘤药物的良载体其中聚合物材料泊洛沙姆、等中 结构可增加药物递送系统在体内的稳定性并延长体内循环时间常用来延长所负载药物的体内半衰期聚乙二醇维生素 琥珀酸酯()不仅具有两亲性结构不但能形成胶束负载药物还可有效抑制 糖蛋白外排作用进而实现肿瘤多药耐药的抑制效果 虽然 相较于其他种类抗肿瘤药物副作用较弱但是仍然具有较明显的骨髓抑制、胃肠道反应基于化疗药物和光敏剂化学结合特点和聚合物胶束递药系统用于抗肿瘤药物递送的优势本研究通过 反应、酸酐开环反应及两步酯化合成 前药并将其制备成胶束用于肿瘤化疗联合光动力治疗实现降低副作用的同时增强抗肿瘤效果 目前已有化疗药物与光敏剂化学结合的相关研究但是针对替加氟化学修饰研究较少且尚无替加氟与光敏剂结合的其它研究本研究为改善氟尿嘧啶类化疗药物疗效及降低其毒作用提供了有效解决手段与研究思路 仪器与试药.仪器 加热磁力搅拌器(德国 集团)旋转蒸发仪(瑞士 公司)三重四极杆质谱仪、制备液相色谱仪、高效液相色谱仪(日本岛津公司)激光粒度仪(英国马尔文帕纳科公司)透射电子显微镜(日本日立公司)酶标仪(瑞士帝肯公司).试药替加氟、丁二酸酐()、甲醛、泊洛沙姆、聚乙二醇维生素 琥珀酸酯()购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司焦脱镁叶绿酸()购自上海源叶生物科技有限公司 试剂、小鼠乳腺癌 细胞购自上海中乔新舟生物科技有限公司其他试剂购自厦门市绿茵试剂玻仪有限公司 方法.替加氟焦脱镁叶绿酸 复合物的合成及表征 通过 反应将 与甲醛连接生成含有末端 结构的 再通过酯化反应分别连接丁二酸酐()和乙二醇()生成末端含有 的 和末端含有 的 最后再通过酯化反应使 与 连接形成含有光敏剂 和化疗药物 的 前药 合成路径如图 所示.的合成 精密称取 .置于厚壁耐压瓶加入甲醛溶液 于 油浴下反应 反应完成后加入甲醇旋蒸除水每次加入 直至水被完全除尽即得羟基化替加氟衍生物 精密称取 .以适量四氢呋喃()溶解精密称取丁二酸酐().以 溶解后滴加至 溶液中量取三乙胺().滴加至上述反应液中于室温下搅拌反应 并以薄层色谱法()监测反应进度反应完成后旋蒸除去溶剂剩余物以 二氯甲烷()复溶后以硅胶色谱柱层析分离流动相为甲醇 (/)收集目标产物合并之后旋蒸除去溶剂得替加氟丁二酸衍生物.产率.的核磁归属如下:():.().().().().().().().().().().().的合成精密称取 药学研究 .加入 溶解 另取.、.以 溶解后滴加至 溶液中室温下活化 后量取乙二醇().加入至反应溶液中于 下反应 监测反应进度 反应完成后旋蒸除去溶剂以 复溶以硅胶色谱柱层析分离流动相比例为甲醇(/)合并目标产物有机相旋蒸除去溶剂得 .产率为.核磁归属如下:():.().().().().().().().().().().().()图 合成路线.替加氟焦脱镁叶绿酸 的合成 精密称取.以二甲基亚砜().溶解避光备用 精密称取 .以 溶解后加入至 溶液中室温下避光孵育 精密称取 .以 溶解后加入至上述反应液室温下避光反应 以 监测反应进度待反应结束后旋蒸除去溶剂以 复溶后以硅胶色谱柱层析分离流动相比例为甲醇 (/)收集目标产物有机相合并后旋蒸除去有机溶剂后再以乙腈将粗产物溶解使用制备液相进行纯化流动相比例为乙腈 水()流速:制备柱:(.)波长:和 收集含目标产物的流动相合并后旋蒸除去乙腈经冻干后得到 粉末产率.的核磁归属如下:().().().().().().().().().().().().().().().().().().().().().().().().().().().胶束的制备及测定.胶束的制备采用溶剂挥发法制备载药胶束:精密称取 .、维生素 琥珀酸酯.、泊洛沙姆 .溶于 无水乙醇逐滴滴加至 的去离子水中避光搅拌 至无水乙醇完全挥发既得 载药胶束溶液.粒径和 电位的测定以马尔文激光粒度仪对所制备的胶束进行粒径和 电位进行测定:吸取胶束溶液 以去离子水稀释至浓度为 取稀释后的溶液 置于样品测定池内以马尔文激光粒度仪进行扫描测定.形貌学表征以透射电子显微镜对所制备的载药胶束进行成像分析具体如下:取 载药胶束 滴加入磷钨酸染液适量染色 后滴于铜网自然晾干后使用透射电镜对胶束微观形态观测并拍摄记录.体外药效学评价.体外释药研究 按“.”项下方法制备 胶束取 胶束、胶束(份)置于 透析袋内并向其中加入 值为.的磷酸盐缓冲液 将透析袋浸入 磷酸盐缓冲液中并开始计时 为考察激光照射条件下 胶束产生的活性氧对药物释放的影响使用 激光器对激光照射组进行照射()药学研究 .激光器工作模式为连续模式每次照射 分别于、进行激光照射 分别于、取 释放介质并补充空白释放介质于 离心 后取 上清液使用 检测.体外抗肿瘤活性研究 将对数生长期的 细胞以胰酶消化离心除去培养基将细胞重悬于 培养基内取 m 细胞悬液以台盼蓝染色并以细胞计数器计数计算细胞浓度 将计数后的细胞稀释至 以每孔 m 接种于 孔板置于培养箱内培养 至细胞贴壁生长 将细胞分为空白组(含培养基不含细胞)对照组(含细胞和培养基)和实验组(含细胞、培养基、药物)除去培养基实验组分别加入 m 以完全培养基稀释的 胶束溶液、胶束溶液、胶束溶液 激光照射()(按照负载 计浓度为.、.、.、.、)其他各组加入 空白培养基培养 后向每孔加入 试剂 继续培养 后以酶标仪于 下测定吸光度值 并按照公式()计算细胞存活率细胞存活率()()其中 为实验组吸光度为空白组吸光度为对照组吸光度 结果与讨论.的合成结构确证图 为 的 图谱 如图 所示芳香区同时出现了 的特征峰(.、.、.)和 的特征峰(.)在脂肪区同时出现了 的特征峰(.、.)和 的特征峰(.、.、.、.、.)且其积分相对应谱图中同时还存在 的特征峰.和.以及 的特征峰.、.说明 的成功合成.胶束制备及测定.粒径和电位由于肿瘤组织部位血管形成速度较快血管致密性和完整性较差存在 孔隙当一定粒径范围内纳米粒子经过该血管部位后会通过血管孔隙而到达肿瘤部位并滞留在肿瘤部位形成高渗透和长滞留()效应 所制备的胶束粒径为.可通过 效应实现药物递送系统的被动靶向效果所制备的纳米胶束 电位为.为负电位与血液电性一致因此有利于保持胶束溶液在给药后的稳定性图 核磁共振氢谱图.透射电镜 如图 所示所制备胶束粒径在 之间粒径较为均一与马尔文激光粒度仪测定结果一致该载药胶束溶液可通过 效应实现肿瘤部位的被动靶向效果图 胶束透射电镜图.体外药效学.体外释药研究 半衰期仅为.将 与 连接并负载于胶束体系后可通过缓慢释药和酯键的断裂释放 延长 的释放时间进而延长 作用时间 胶束在未经激光照射的释放介质中释放较为缓慢 内累积释放量为.而经激光照射后释放加速 内释放.释放介质中加入了 的(肿瘤微环境活性氧浓度约为 )其产生的 促进了 从 的解离使 即使在无激光照射条件下也可较快断裂酯键进而释放 经激光照射后 自身产生一定量的 具有自我促进 响应性释药特点激光照射产生的 在前药微环境体系内促进酯键断裂因此进一步加速了药物的释放药学研究 .细胞毒性试验、可以在激光照射下产生能够促进细胞凋亡的 从而可以加速激光照射下的药物释放 因此本文研究了 胶束在激光照射和非激光照射下的细胞毒性选择替加氟胶束作为对照品对载药胶束体外抗肿瘤能力进行评价 如图 和表 所示 胶束对 细胞的毒性较替加氟胶束强且为浓度依赖性当 浓度为 m 时替加氟胶束、胶束、胶束激光照射与 细胞共孵育 后的细胞存活率分别为.、.、.可在细胞内代谢为、甲醛和 和甲醛具有协同的化疗作用因此增加了细胞毒性 相同给药浓度下激光照射组 胶束较非激光照射组胶束细胞毒性较强说明激光照射促进 的产生产生的 与释放的 共同作用促进细胞凋亡因此在激光照射下 可以发挥 和化疗的协同抗肿瘤作用从而促进细胞凋亡图 、激光照射组细胞存活率表 、激光照射组 值分组值/胶束.胶束.胶束激光照射.结论本研究合成了替加氟和光敏剂焦脱镁叶绿酸 的缀合物前药并将其制备成载药胶束 所制备的胶束粒径为.可实现血管内给药后的肿瘤部位被动靶向效果 电位为.可保证其在血液中保持胶束结构稳定 体外释药与抗肿瘤试验结果表明 胶束可缓慢释药且激光照射可促进 的释放在激光照射下 可发挥光动力治疗与化疗协同抗肿瘤作用 激光照射下的 具有以下优点:光动力促进 的释放 在细胞内的代谢产物具有协同化疗作用化疗和 协同促进细胞凋亡总之 胶束可通过缓慢释药、激光照射加速释药、被动靶向至肿瘤部位等特性效提抗肿瘤活性并降低对正常组织的副作用 本研究将为化疗药物与光敏剂的偶联以降低化疗药物毒性并增强抗肿瘤效果提供科研依据和参考参考文献:杨彩玲昌亚慧朱胜妤.常用化疗药物不良反应的预防及护理.中国医药导报():.许士琪朱礼岩郝超等.一种新型含氨基酸基团替加氟前药的合成及其抗肿瘤活性评价.中国药学(英文版)():.():.:.():.:.():.():.:.():.():.(下转第 页)药学研究 .():.():.李鑫洁陈建新鲁艺.锁阳乙酸乙酯提取物对阿尔茨海默病小鼠肠道菌群紊乱的调节作用.中医学报():.():.赵文斌.天麻及其有效物质对阿尔兹海默症模型小鼠的作用机制研究.兰州:兰州大学.林路宁姬丽婷傅云波等.石菖蒲水提物对 小鼠肠道菌群的影响.浙江中医杂志():./.():.():./.():.许青赵晓芹刘彦君等.基于“心与小肠相表里”探讨回肠菌群在七圣丸抗阿尔茨海默病中的变化.中国实验方剂学杂志():.姜洋王燕萍刘雪珍等.基于高通量测序技术研究归脾汤对心脾两虚型轻度阿尔茨海默病患者肠道菌群多样性的影响.新中医():.():.张云龙刘妍徐评议等.基于调控脑肠轴探索解毒化瘀汤改善阿尔茨海默病小鼠认知功能的机制.中国药理学与毒理学杂志():./.():.杨玉芳.当归芍药散对/阿尔茨海默病模型小鼠肠道菌群的影响及分子机制.芜湖:皖南医学院.():.:.():.():.(收稿日期:)(上接第 页).():.():.:.():.().():.():.():.(收稿日期:)药学研究 .