阻断PI3K_AKT_mTOR信号对白血病HL-60细胞的影响.pdf

医学分子生物学杂志,2024,21(3):254-258 J Med Mol Biol,2024,21(3):254-258DOI:10.3870/j.issn.1672-8009.2024.03.010资助项目:湖北省卫生健康委联合基金(No.WJ2019H475)通讯作者:汤晶(电话:[phone],E-mail:)This work was supported by a grant from the Hubei Provincial Health Commission Joint Fund Project(No.WJ2019H475)Corresponding author:TANG Jing(Tel:[phone],E-mail:)阻断 PI3K/AKT/mTOR 信号对白血病 HL-60 细胞的影响郭琛,汤晶黄石市第二医院检验科,黄石市临床检验技术重点实验室 湖北省黄石市,435000【摘要】目的 探讨阻断 PI3K/AKT/mTOR 信号对白血病细胞的影响。方法选取急性粒细胞白血病细胞 HL-60,随机分为空白对照组、低浓度组、中浓度组和高浓度组,其中空白对照组给予生理盐水,低、中、高浓度组分别给予 10、25 和 50?mol/L 浓度的 PI3K/AKT/mTOR 信号阻断剂 GDC-0349 处理,采用CCK-8 法检测各组细胞增殖情况,流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况,蛋白质印迹检测 PI3K/AKT/mTOR信号、凋亡相关蛋白表达。结果 高浓度组细胞培养 24、48 和 72 h 时吸光度值(A)明显低于低浓度组和中浓度组(P0.05);低浓度组、中浓度组和高浓度组细胞凋亡率明显高于空白对照组(P0.05),其中高浓度组细胞凋亡率明显低于低浓度组和中浓度组(P0.05);高浓度组 P110、AKT 和 mTOR 蛋白相对表达量明显低于空白对照组、低浓度组和中浓度组(P 0.05);低浓度组、中浓度组和高浓度组 Bcl2 和Caspase3 蛋白相对表达量明显低于空白对照组(P0.05),高浓度组 Bcl2 和 Caspase3 蛋白相对表达量明显低于空白对照组、低浓度组和中浓度组(P 0.05)。结论阻断 PI3K/AKT/mTOR 信号可抑制白血病 HL-60 细胞增殖,促进细胞凋亡。【关键词】PI3K/AKT/mTOR 信号;白血病;增殖;凋亡【中图分类号】R552Effect of Blocking PI3K/Akt/mTOR Signaling Transduction on Leu-kemia HL-60 CellsGUO Chen,TANG JingDepartment of Laboratory,Huangshi Key Laboratory of Chinical Laboratory Technology,SecondHospital of Huangshi,Huangshi,Hubei,435000,China【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of blocking PI3K/Akt/mTOR signaling onleukemia cells.MethodsAcute myeloid leukemia cell line HL-60 was selected,cells were ran-domly divided into 4 groups:blank control group,low concentration group,medium concentrationgroup and high concentration group.Cells in the blank control group was given normal saline,cellsin the low concentration group,medium concentration group and high concentration group were trea-ted with 10,25 and 50?mol/L PI3K/Akt/mTOR signaling blocker GDC-0349.CCK-8 method wasused to detect the cell proliferation.Cell apoptosis was detected by flow cytometry,and the expres-sion level of PI3K/Akt/mTOR and apoptosis related proteins were detected by Western blot-ting.Results Compared with those in the low and medium concentration groups,the absorbanceratios(A values)of cells in the high concentration group at 24,48 and 72 h time-points were sig-nificantly lower(P0.05).The apoptosis rates of cells in the low,medium and high concentrationgroups were significantly higher than that of cells in the blank control group(P0.05),and theapoptosis rate of cells in the high concentration group was significantly lower than those of cells inthe low and medium concentration groups(P0.05).The relative expression levels of P110,Aktand mTOR in the high concentration group were significantly lower than those in the blank controlgroup,low and medium concentration groups(P0.05).The relative expression levels of Bcl2 andCaspase3 proteins in the low,medium and high concentration groups were significantly lower thanthat in the blank control group(P0.05).The relative expression levels of Bcl2 and Caspase3 inthe high concentration group were significantly lower than those in other groups(P0.05).Con-clusion Blocking PI3K/Akt/mTOR signaling can inhibit the proliferation and promote the apopto-sis of HL-60 cells.【Key words】PI3K/Akt/mTOR signal;leukemia;proliferation;apoptosis 急性粒细胞白血病主要表现为粒细胞的恶性增殖,患者临床表现为感染和出血,病情恶化容易导致患者死亡,大约 10%的病例进展缓慢,以老年人多发1。随着化疗方案的更新,急性粒细胞白血病的治疗效果和 5 年无病生存率都有所增长,但无复发率和总生存率均低于 25%2。近年来,寻找特异性的药物靶向治疗成为白血病研究焦点。PI3K/AKT/mTOR 信号通路涉及蛋白质,脂质和核苷酸 的 合 成 过 程3。研 究 发 现4,PI3K/AKT/mTOR 信号路径的异常激活与白血病的形成有关。白血病起始细胞对 PI3K/AKT/mTOR 信号通路的异常激活可能导致白血病的复发和细胞耐药性产生5。使用 PI3K/AKT/mTOR 抑制剂作为治疗白血病单一药物或与常规化学疗法联合靶向治疗具有重要意义。为了探讨阻断 PI3K/AKT/mTOR 信号对白血病细胞的影响,本研究选取急性粒细胞白血病细胞 HL-60 进行研究。1 材料与方法1.1 细胞选取急性粒细胞白血病细胞 HL-60,购自于上海吉凯基因化学技术有限公司。1.2 试验方法1.2.1 细胞培养 将 HL-60 细胞置于含 10%胎牛血清的 RPMI-1640 培养基,在37 和5%CO2的环境下进行培养,实验使用处于对数生长期的细胞。1.2.2 细胞处理 将5 mg GDC-0349 溶解于2.2097mL 的 DMSO 中,来回摇动混合制成5 mmol/L 的存储溶液,-20 保存。用 PBS 将储备溶液稀释至相应浓度(10、25 和50?mol/L)的工作溶液,向细胞悬液中加入各种药物浓度,轻轻搅拌,再在37、5%CO2的培养箱中放置指定时间,随后收集细胞。1.2.3 CCK-8 法检测空白组:100 L 含 10%胎牛血清的 1640 培养基;A 值:包含不同浓度的GDC-0349 HL-60 细胞和 CCK8 溶液的孔的吸光度。对照组:100 L 含 0.1%DMSO 的 HL-60 细胞悬液;A 值:含有 10%胎牛血清和不含 HL-60细胞的 CCK8 溶液的孔的吸光度。实验组:100 L 分别含 10、25 和 50 mmol/L的 GDC-0349 的 HL-60 细胞悬液;A 值:HL-60 细胞和含有 0.1%DMSO 的 CCK8 溶液的吸光度。96 孔板周围添加100 L PBS 以减少边缘效应,并在培养箱中培养。在0、12、24、48 和72 h 时,向各组加入10 L CCK-8,避免气泡并在培养箱中额外培养2h。最后,使用酶标仪测定450 nm 波长的吸光度。细胞增殖抑制率(%)=实验组 A-空白组 A/对照组 A-空白组 A100%。1.2.4 流式细胞仪检测经处理的 HL-60 细胞经离心后用 PBS 清洗,再重悬于含 100 L 1 bind-ing buffer 的流式管中。加入 5 L Annexin,在室温下避光孵育15 min。用1 binding buffer 清洗后,再次离心,将细胞悬浮在含 400 L 1 bindingbuffer 的流式管中,加入5 L PI,随后用流式细胞仪进行细胞凋亡分析。1.2.5 蛋白质印迹测 实验组细胞收集后,使用加入 PMSF 的 RIPA 裂解缓冲液在冰上裂解 20 min离心后取上清。利用 BSA 法测定蛋白浓度,取等量蛋白进行SDS-PAGE 分离,后转移到 PVDF 膜上。使用 5%脱脂奶粉的 TBST 在室温下封闭 1 h,用 TBST 洗涤3 次后,在 4 下一抗孵育过夜(除了 Bcl2 和GAPDH 抗体的稀释比为 1 500 外,所有的一抗(Caspase3,P110,AKT 和 mTOR)的稀释比均为11 000),用 TBST 洗涤 3 次,用 HRP 标记的二抗孵育(用 TBST 15 000 稀释)45 min,用 TBST 洗涤 3 次,加入 ECL 曝光。1.3 统计学处理采用 SPSS22.0 软件,A 值、细胞凋亡率等以均数 标准差(x s)表示,F 检验分析组间差异,检验水准?为 0.05。2 结果2.1 各组细胞增殖情况比较各组随培养时间延长,A 相对值有所升高(P0.05);低浓度组、高浓度组细胞培养 24、48 和72 h 时 A 相对值明显低于低浓度组和中浓度组(P0.05)(表 1)。2.2 各组细胞凋亡情况比较低浓度组、中浓度组和高浓度组细胞凋亡率明显高于空白对照组(P 0.05),其中高浓度组细胞凋亡率明显低于低浓度组和中浓度组(P 0.05)。(表 2、图 1)。552医学分子生物学杂志,2024,21(3):254-258 J Med Mol Biol,2024,21(3):254-258表 1 各组细胞增殖情况比较组别24 h48 h72 h低浓度组0.81 0.090.86 0.110.88 0.12中浓度组0.68 0.08a0.70 0.12a0.79 0.13a高浓度组0.52 0.08ab0.57 0.11ab0.63 0.13abF7.84410.16513.322P0.0010.0010.001 注:与低浓度组比较,aP0.05;与中浓度组比较,bP0.05。表 2 各组细胞凋亡情况比较组别细胞凋亡率(%)FP空白对照组7.80 2.11低浓度组15.51 2.32a中浓度组24.41 2.20ab高浓度组36.90 4.82abc32.2540.001 注:与空白对照组比较,aP0.05;与低浓度组比较,bP0.01;与中浓度组比较,cP0.05。A:空白对照组;B:低浓度组;C:中浓度组;D:高浓度组。图 1 各组细胞流式细胞仪检测图2.3 各组细胞 PI3K/AKT/mTOR 信号相关蛋白质比较高浓度组 P110、AKT 和 mTOR 蛋白质相对表达量为明显低于空白对照组、低浓度组和中浓度组(P0.05)(表 3 和图 2)。表 3 各组细胞 P110、AKT 和 mTOR 蛋白质相对表达量比较组别P110 蛋白质相对表达量AKT 蛋白质相对表达量mTOR 蛋白质相对表达量空白对照组0.31 0.080.71 0.110.78 0.10低浓度组0.28 0.090.40 0.10a0.41 0.12a中浓度组0.29 0.070.32 0.11ab0.33 0.12ab高浓度组0.20 0.04abc0.20 0.07abc0.15 0.03abcF8.89414.46517.655P0.0010.0010.001 注:与空白对照组比较,aP0.05;与低浓度组比较,bP0.05;与中浓度组比较,cP0.05。A:空白对照组;B:低浓度组;C:中浓度组;D:高浓度组图 2 蛋白质印迹检测图2.4 各组细胞凋亡蛋白质比较低浓 度 组、中 浓 度 组 和 高 浓 度 组 Bcl2 和Caspase3 蛋白质相对表达量明显低于空白对照组(P0.05),高浓度组 Bcl2 和 Caspase3 蛋白质相对表达量明显低于空白对照组、低浓度组和中浓度组(P0.05)(表 4、图 3)。表 4 各组细胞 Bcl2 和 Caspase3 蛋白质相对表达量比较组别Bcl2 蛋白质相对表达量Caspase3 蛋白相对表达量空白对照组0.34 0.120.82 0.13低浓度组0.25 0.090.33 0.12a中浓度组0.20 0.070.17 0.05ab高浓度组0.11 0.04abc0.10 0.03abcF11.64013.844P0.0010.001 注:与空白对照组比较,aP0.05;b 与低浓度组比较,bP0.05;与中浓度组比较,cP0.05。652郭琛,等.阻断 PI3K/AKT/mTOR 信号对白血病 HL-60 细胞的影响A:空白对照组;B:低浓度组;C:中浓度组;D:高浓度组。图 3 蛋白质印迹检测图3 讨论急性粒细胞白血病发展迅速,及时早期干预控制凝血是治疗急性粒细胞白血病患者的关键。急性粒细胞白血病通常伴有信号通路异常激活,因此为了改善急性粒细胞白血病患者预后,近年来也出现了针对急性粒细胞白血病靶向治疗的研究。在急性白血病中检测 PI3K/AKT/mTOR 途径异常激活率高达 85%,该途径异常激活是白血病细胞增殖重要因素6。阻断 PI3K/AKT/mTOR 通路可能有助于抑制血液恶性肿瘤的凋亡和增殖7。一些药物,如碳酸酐酶 12(CA)抑制剂,能够减少 mTORC1活性 并 减 少 c-myc 蛋 白 表 达。TPD7 和 小 檗 碱(TAB)的组合也能够抑制 mTOR 和 AKT,进而限制白血病细胞的增长8。此外,先前的研究还显示9-11,PP242 和 AZD8055 这两种 mTOR 途径抑制剂通过引起 G1阶段阻滞和细胞凋亡,有效抑制白血病细胞的增殖。这些抑制剂同时阻止 mTORC2下游的 AKT 在丝氨酸 473 位点和 S6K 的磷酸化。这些发现突显了 PI3K/mTOR 通路作为急性粒细胞白血病新疗法靶点的潜力,指出针对特定细胞通路靶点可有效抑制此类白血病的进展。GDC-0349 是 一 种 有 效 选 择 性 ATP 竞 争 性mTOR 抑制剂,但尚未在急性粒细胞白血病中报告过12。本实验采用 CCK8 法研究发现低浓度组、中浓度组和高浓度组细胞培养 24、48 和 72 h 时 A值依次降低,凋亡率依次升高,比较有统计学差异。这表明 GDC-0349 可以通过控制时间和浓度抑制 HL-60 细胞增殖,控制浓度方式促进 HL-60 细胞凋亡。Bcl2 家族蛋白通过控制细胞色素 C 的释放调节线粒体外膜的通透性,从而激活胞质中的caspase 并引发凋亡。作为一种防止细胞凋亡的因子,Bcl2 能够阻止细胞色素 C 从线粒体进入胞质溶胶,有助于抑制凋亡过程13。Caspase3 在细胞凋亡实施阶段起到关键作用,当 Caspase3 被激活时,它可以被视为凋亡非侵入性生物指示物14。低浓度组、中浓度组和高浓度组 Bcl2 和 Caspase3蛋白相对表达量明显低于空白对照组,高浓度组Bcl2 和 Caspase3 蛋白相对表达量明显低于空白对照组、低浓度组和中浓度组。这一发现进一步证实了 Bcl2 和 Caspase3 蛋白在细胞凋亡过程中作用。GDC-0349 可 以 通 过 下 调 Bcl2 的 表 达 并 激 活Caspase3 来加速 HL-60 细胞凋亡。在 AKT/mTOR 信号通路中,被激活 AKT 能够通过对多种下游目标蛋白进行磷酸化,从而推动细胞增殖并阻止细胞凋亡15。mTOR 是 AKT 最关键下游目标蛋白。它能感应细胞微环境中营养水平和生长因子活跃度,进而控制蛋白质降解与合成代谢,以及细胞增长和代谢过程16。AKT 在 Thr308位点磷酸化导致 TSC1 和 TSC2 失活。这进一步导致Rheb 在 GTP 结合区域积累,从而刺激 mTORC1 活化。随后,mTORC1 磷酸化并激活了 S6K,同时也磷酸化并抑制了 eIF4E 活性、4EBP117。所以,mTORC1 活 化 导 致 蛋 白 质 翻 译 与 合 成 增 强。mTORC2 能够通过在 AKT473 位点丝氨酸进行磷酸化来 启 动 AKT,作 为 AKT 上 游 调 控 者;而mTORC1 则作为 AKT 下游调控因子18。因此,mTOR 参与了 AKT 的上游和下游信号转导。高浓度组 PI3K/AKT/mTOR 信号相关蛋白相对表达量为明显低于空白对照组、低浓度组和中浓度组。说明高浓度 GDC-0349 可以抑制 AKT/mTOR 途径中相关蛋白的表达,通过限制蛋白质翻译,可以进一步阻止急性粒细胞白血病细胞生长。有研究发现,当 mTOR 抑制剂 PP242 与柔红霉素共同使用时,它们之间产生协同效应,从而加强了柔红霉素对白血病治疗效果,而 PP242 也可以有效地抵消柔红霉素的不良反应19-20。我们的研究创新性选择 PI3K/AKT/mTOR 信号抑制剂GDC-0349 对白血病 HL-60 细胞增殖和凋亡能力研究,为了找到更好的治疗方案,在随后的研究中,我们可以将其与常规化学治疗剂组合以观察其组合对白血病细胞的影响。综上所述,阻断 PI3K/AKT/mTOR 信号可抑制白血病 HL-60 细胞增殖,促进细胞凋亡。参考文献1 冯永笑,赵晓亮,张丑丑,等.过表达 miR-186 对白血病HL-60 细胞增殖和凋亡作用机制的研究J.兰州大学学报(医学版),2023,49(02):26-32.2 张玲,高楠,王勤,等.急性淋巴细胞白血病患儿发生医院感染的相关影响因素J.实用癌症杂志,2023,38(11):1839-1842.3岳俊刚,陈芳.急性淋巴细胞白血病儿童血清 miR-1301-3p 和 PODXL 表达水平及其临床价值研究J.现代检验医学杂志,2023,38(06):64-70.752医学分子生物学杂志,2024,21(3):254-258 J Med Mol Biol,2024,21(3):254-2584 张翠,马丽,彭荣,等.JAK2、GSTM1 基因多态性与急性淋巴细胞白血病患儿化疗期间感染的关联J.中华医院感染学杂志,2022,32(22):3482-3486.5 陆小琴,雷娇娇,刘雨欣,等.lncRNA XIST 通过 miR-375-Notch1 轴调控急性 T 淋巴细胞白血病细胞增殖、侵袭的实验研究J.实用肿瘤学杂志,2022,36(05):404-410.6许京淑,朱晓健,李松.亚硒酸钠抑制 PI3K/AKT/mTOR 信号通路诱导白血病细胞 HL-60 凋亡的机制研究J.海南医学,2018,29(3):300-304.7 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