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植物叶片衰老
摘要：叶片衰老是植物发育后期的一个重要特征。在生产上当植物叶片衰老或是异常时，光合作用减退，将极大程度地限制植物产量潜力的发挥，农业生产中造成许多作物减产。本文结合植物叶片衰老发育的过程，从叶片衰老过程中各个组织水平细胞结构变化、细胞生理生化变化、植物激素以及基因调控等方面对叶片衰老的机理进行综述，并提出今后研究的方向。
关键词：植物叶片衰老，机制，调控，环境因素
1.叶片衰老过程
叶片衰老最显著的形态变化就是叶片颜色的变化，在衰老过程中，生理生化指标的变化是其衰老过程的反应，可用来判断衰老的过程及其程度，而衰老的机理是导致这些生理生化指标变化的基础（张宝来，2013）。
研究表明，根据植物叶片生理生化变化的早迟、强弱、方向和幅度，一般将衰老过程划分为三个阶段：诱导期、抵抗期和加剧期。三个衰老阶段表现出不同的生理生化变化特征。一阶段的变化较大，第二阶段为趋于平稳的变化，第三阶段变化剧烈。即第三、第一、第二阶段的生理生化变化速率依次降低。在衰老诱导阶段，叶片受到衰老信息的刺激，存在于体内的衰老机制得到激发，生理生化变化表现为幅度较大的应激反应，呈现出通过生理生化变化来去除衰老信息作用的趋向。在衰老抵抗阶段，是叶片内衰老机制和防衰老机制相互激烈作用的时期，因而表现出生理生化变化速率较小的特点。但是，衰老机制逐渐处于主导地位，使生理生化变化逐渐向衰老的方向发展，真正意义的衰老是从这一阶段开始的。在剧烈衰老阶段，体内的防衰老机制已失去作用或不复存在，因而生理生化变化表现为变幅很大的衰老特征，最终导致死亡（Eng-Chong Pua Michael R.Davey,2010）
2．叶片衰老的细胞结构和生理功能的的变化
研究表明，植物叶片在衰老过程中表现为下述典型特征：叶绿素的降解明显快于合成，蛋白质迅速丧失，RNA大量水解，叶片在形态上表现为黄化现象。
 2.1细胞结构的变化
  叶细胞在衰老阶段显示出一些独特的结构和生化变化。叶片衰老过程中细胞结构变化的一个显著特点是细胞内细胞器的解体顺序。最早的结构变化发生在叶绿体，即在基粒结构的改变和内容以及形成一种被称为质体小球的脂滴。与之不同的是，和基因表达有关的细胞核和线粒体直到衰老，其结构还保持完整（周峰，2012）。这反映了叶细胞需要在案衰老过程中保持功能直到衰老的后期，可能是为了有效调动细胞材料。在叶片衰老的最后阶段，PCD典型的特征为如控制液泡崩裂，染色质浓缩，DNA梯状条带被发现在不同种类植物的自然衰老的叶片中，包括拟南芥、烟草。这些观测显示叶片衰老涉及到细胞活动最终导致PCD。最终，原生质和液泡明显的衰变出现。原生质膜的完整性缺失导致细胞内平衡破坏，从而在衰老叶片中结束了一个细胞的生命。
2.2细胞代谢的变化
植物叶片衰老时的典型生理生化特征是：蛋白质含量显著下降，核酸含量降低，细胞保护酶活性下降及膜脂过氧化程度加重，光合功能衰退和细胞内部的激素平衡发生改变（张海娜等，2007）。 衰老叶片中细胞的生物学变化首先伴随着降低合成代谢。所有细胞中多核糖体和核糖体的含量降低相当早，反应了蛋白质合成的降低。随之而来导致rRNAs和tRNAs合成降低（周峰，2012）。氨肽酶和內肽酶活性伴随叶片衰老进程显著上升，表明二者参与了叶片衰老过程中蛋白质的降解。与蛋白质含量表现趋势相同，在叶片衰老过程中，RNA含量不断降解，但DNA含量和DNase活性无明显变化（朱诚，2000）。
 当叶片衰老时，细胞内自由基产生和清除的平衡受到破坏，自由基积累量增多，加剧了细胞膜脂过氧化。研究表明，叶片衰老过程中，植物体内保护酶系统，如超氧化物歧化酶（SOD
）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD以及谷胱甘肽还原酶（GSH）等和一些小分子抗氧化物质活性和数量显著降低。细胞膜脂氧化产物丙二醛（MDA）含量增多（华春，2003）
与叶绿体快速衰老相比，叶片衰老时在呼吸速率上的表征是，衰老初期快速下降，而后急剧上升，再迅速下降，这种现象和叶片中乙烯含量的动态变化具有高度的对应性（陈洪国，2006）。
 3.植物激素参与叶片衰老的调节
  激素对植物叶片衰老过程具重要的调节作用，其中细胞分裂素(CTK)、赤霉素(GA)、生长素(IAA)、多胺等激素具有延缓衰老的作用，而脱落酸(ABA)、乙稀(ETH)、茉莉酸(JA)、茉莉酸甲酯(MeJA)等具有促进衰老的作用。
 自Richmond等（RICHMOND，1957）发现激动素处理苍耳叶片可阻止蛋白质降解、抑制叶绿素降解，进而延缓叶片衰老后，细胞分裂素(CTK)成为研究衰老调节的最常用激素。三唑酮(细胞分裂素类物质)对绿豆幼苗叶片、茶树离体叶片等的衰老也具有类似的作用（郭振飞，1998；杨远庆，2001）。细胞分裂素类物质延缓叶片衰老、延长叶片功能期及增产的效应可能与活性氧代谢有关，用4PU-30(一种苯脲类高活性CTK) 处理月季切花，可明显降低花瓣内SOD、CAT活性下降的速度，同时减小负氧离子产生速率和MDA积累量（陈杭芳，
2004）。
近年来,利用细胞分裂素合成酶基因IPT转化调控叶片衰老已成为叶片衰老的分子遗传学调控研究的一个重要方面。Gan等（GAN，1995）以在拟南芥衰老过程中特异表达的SAG12
启动子与IPT基因构建PSAG12-IPT嵌合基因，转化获得的转基因烟草植株叶片衰老和光合功能衰退均减缓，且叶片发育正常，形态与野生型无明显差异。 尹路明（尹路明，2001）
在研究多胺与激动素对稀脉浮萍离体叶状体衰老的影响中指出外源多胺的作用与细胞分裂素类物质相似，多胺和激动素均可抑制稀脉浮萍离体叶状体在暗诱导衰老过程中的叶绿素损失，且多胺的作用大于激动素。多胺延缓衰老的作用在植物中普遍存在，目前人们已发现多胺可延缓许多双子叶和单子叶植物如豌豆、菜豆、芜菁、烟草、大麦、小麦、玉米、水稻等离体叶片衰老。离体叶片衰老时，水解酶如核糖核酸酶和蛋白酶活性迅速增加，叶绿素含量逐渐下降，而外源多胺可抑制上述过程（段辉国，2006）。赵福庚（赵福庚，1999）指出，一定浓度的多胺及其前体物均具有明显抑制叶绿素、蛋白质降解的作用，即外源多胺具有延缓离体叶片衰老的作用。钙作为植物生长发育的第二信使亦得到广泛认可。
自从20世纪70年代钙调节蛋白(尤其是钙调素，CaM) 被发现以来，人们逐渐认识到钙不仅具有胞外功能，而且具有胞内功能。外源Ca2+不仅能够增加胞外Ca2+，改变细胞间隙离子环境，而且可以调节细胞活力从而在一定程度上起到延缓衰老的作用。梁颖等（梁颖，1997）研究表明，适宜浓度的Ca2+能够抑制叶绿素降解，从而抑制植物组织衰老。王亚琴等（王亚琴，2003）指出胞外高浓度的Ca2+可稳定原生质膜，延缓膜的衰老，从而降低乙烯的生成；而进入细胞内的Ca2+则可激活CaM第二信使系统，促进一系列酶的活化和细胞膜的膜质过氧化作用，加速乙烯合成。
最近发现油菜素内酯(BR)缺陷型拟南芥的叶片衰老缓慢，因此BR被认为是一种可操纵的延缓叶片衰老的生长调节物质。
  与以上几种激素的作用相反，脱落酸和乙烯可促进植物叶片衰老。脱落酸影响细胞膜的透性，加速叶片衰老（魏道智，1998）。试验表明正在发育中的果实和种子合成的ABA可诱导叶片衰老，胁迫诱导叶片ABA积累和外施ABA均可促进叶片衰老（李付振，2005）。Guinn 等（GUINN，1993）研究棉花大田叶片衰老过程中光合作用和ABA、细胞分裂素的关系时发现，细胞分裂素含量的下降和ABA含量的上升是启动棉花叶片衰老的主要因素。董志强等（董志强，2005）研究指出，棉花在盛花期后，功能叶中ABA含量上升。衰老叶中ABA含量由盛花期至结铃后期呈下降趋势。
对小麦叶片的研究表明，乙烯对叶片衰老没有直接作用，但具有促进和延缓叶片衰老的多条作用途径，对叶片衰老的最终影响取决于各途径实现的程度（朱中华，1998）。综上所述，植物衰老是众多激素相互协调平衡的结果。如IAA、GA和ABA可调节乙烯的合成，GA可促进IAA的作用，ABA对抗IAA等（王建勇等，2011）。
4.叶片衰老的分子机制
  所谓衰老相关基因一般是指叶片自然衰老过程中表达量增加的基因（Nam，1997）。研究表明，叶片衰老是一个主动的受特定基因调控的过程。衰老过程中，细胞中总RNA含量下降，许多基因停止表达。衰老相关基因包括编码降解生物大分子酶的基因，如核糖核酸酶、蛋白酶、脂酶；另外，还包括转移营养功能的基因如谷氨酰胺合成酶基（glutamine synthetase genes，GS）等。
4.1与蛋白降解相关的基因
  Lohman等从玉米、拟南芥和油菜中分离得到的3个与衰老相关的蛋白酶基因，其序列与谷类的特异蛋白酶—半胱氨酸蛋白酶的基因序列相似，它们在叶片衰老过程中可能起转移贮藏蛋白的作用。另外，在衰老叶片中鉴定到的SAG12编码的蛋白序列与木瓜蛋白酶的序列相似，这个基因在衰老叶片中特异表达（Gan et al，1995），其发现对于研究抗衰老基因工程有很大作用。
  Buchanan-Wollaston和Ainsworth(Ainsworth,1997)发现了油菜中半胱氨酸蛋白酶基LSC790，这一基因在叶片发育的所有阶段，如开花、发芽等过程中均有表达，它编码的蛋白质序列与从拟南芥中分离得到的干旱诱导的半胱氨酸蛋白酶RD19的序列相似，而且，这个基因合成的与衰老相关的降解酶以非活化状态贮藏在液泡中，一旦衰老开始，这个酶就被激活。
 Skanklin（Shanklin，1995）等推测衰老过程中蛋白降解相关的酶可能定位于叶绿体中。在拟南芥的叶绿体中也曾检测到ClpP和ClpC蛋白酶亚基；另外，鉴定油菜中的两个半胱氨酸蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶氨基酸序列的结果表明，它们都有相似的疏水的N末端，这可能是叶绿体跨膜运输的信号肽序(Buchanan-Wollaston,1997),Buchanan-Wollaston首次在衰老的油菜叶片中采用免疫定位法证实LSC7编码的蛋白酶可能位于衰老叶片的叶绿体中。
 4.2与核酸降解相关的基因
  衰老发生过程中的细胞内DNA含量保持相对稳定，但核糖体RNA含量显著下降，叶片衰老过程中RNA酶活性高（Green，1994）。Lers（Lers，1998）等在番茄衰老过程中分离得到了两个高效的核酸酶cDNA克隆LX、LE，属RNSI类。他们认为核酸酶是一种紧急自救系统，在细胞间隙或细胞内降解RNA，清除磷的毒害。另外，在拟南芥中鉴定到3个核酶基因RNS1、RNS2、RNS3，其中RNS2在衰老时高水平表达，可能起降解RNA和转移衰老叶片中磷的作用；RNS1是细胞外酶，在叶片衰老时含量少，但在磷饥饿时可大量诱导出来。衰老过程中，核酸在核糖核酸酶作用下分解为核苷酸，核苷酸降解为嘌呤和嘧啶。嘌呤和嘧啶转化途径仍不清楚，可能会继续降解，保留其中的氮和碳成分。在衰老叶片中的过氧化物酶体中观察到尿酸酶和黄嘌呤氧化酶水平的提高，表明在这个细胞器中发生了嘌呤代谢。
 4.3与叶绿素分解相关的基因 
衰老的显著标志是叶片黄化，这主要由于叶绿素的降解早于叶黄素和类胡萝卜素。目前对叶绿素降解有关的酶的研究取得了一定进展(Smart,1994)。通过对野生型和叶绿素降解缺陷突变体的异化产物分析认为，叶绿素降解的可能途径是：叶绿素代谢可能与叶绿体膜蛋白有关，通过一种酶如叶绿素酶移去叶绿醇得到叶绿素酸，再通过脱镁螯合酶除去镁离子，然后，叶绿素环被双加氧酶打开，结合蛋白被释放而降解，残留的叶绿素异化产物转移到液泡中进行进一步的代谢。但是，目前这方面的证据还不十分充分。
4.4脂类再转移基因
植物细胞膜由许多脂类分子组成，衰老叶片中脂类分子可以转移和再利用。给绿色大麦喂饲14C标记的半乳糖脂，发现在黄化过程中这种半乳糖脂大部分都以CO2的形式释放出来，表明衰老叶片中确实存在脂类分子的转移和再利用。另外，叶片衰老时，呼吸商降低，这表明呼吸的底物是脂肪酸而不是糖类。而且乙醛酸循环的关键酶—苹果酸合成酶和异柠檬酸裂解酶的含量在衰老的大麦和黄瓜叶片中都提高（McLaughlin，1994），表明乙醛酸循环在衰老过程中有重要作用。脂类裂解后产生的乙酰辅酶A可以通过乙醛酸循环转化为四碳酸，再通过反向糖酵解或葡糖异生作用转化为碳水化合物，特别是蔗糖。
 4.5与氮转移相关的基因
衰老过程中大分子转移的代谢途径可能是通过葡糖异生作用合成谷氨酰胺、天冬酰胺和蔗糖，从韧皮部转移出酰胺(Buchanan-Wollaston,1997)。植物叶片中有两类明显不同的谷氨酰胺合成酶GS1、GS2，衰老过程中，GS1活性上升而GS2活性下降。GS1的表达主要限制在维管束中，可能是用于谷氨酰胺的转移。Park等(Park,1998)还分离得到了与氮转移相关的基因Psen3和Psen4。
4.6未知功能的于衰老相关的基因
  在许多植物中都发现了促进衰老的与金属硫蛋白相关的基因，目前对这类蛋白的功能尚不清楚。由于叶片衰老是一个氧化过程，叶绿素和膜的降解会产生大量的自由基，因此人们推测衰老叶片中金属硫蛋白的出现可能是保护DNA免受伤害，也可能起贮藏和转移金属离子的作用。与衰老相关的基因的表达可能与硫的代谢有关。Buchanan-Wollaston等发现衰老油菜中编码ATP硫化酶的基因表达量增加，此酶的作用是在半胱氨酸和蛋氨酸合成第一步中出现ATP时活化硫，将游离的半胱氨酸转化成谷胱甘肽，后者在植物受内外胁迫时的反应中起作用。
  Buchanan-Wollaston(Buchanan-Wollaston,1997)在油菜中分离到3个在衰老叶片中表达而在绿色叶片中不表达的细胞色素P450基因。植物中细胞色素P450s 是合成一系列次生代谢物的关键酶，与植物抗病虫等能力有关。这些酶在叶片衰老中的作用尚不清楚，可能与植物衰老信号的诱导刺激、引起植物产生过敏性反应，并催化降解大分子物质产生小分子抗性物质有关。在衰老油菜中还发现了与病原体反应相关蛋白的基因表达的增强，这些基因包括PR1a、几丁酶和一个编码抗真菌相似蛋白的基因。在衰老组织中出现病原相关蛋白（PR）反应组织可能是脆弱性的，表现出它在病原体侵染时有产生防卫系统的功能。衰老叶片易受病原体侵染，此时表达的基因在防卫病原体侵染时的作用仍不清楚。一些PR蛋白的表达很有可能是叶片衰老诱导和控制下产生的，与防病原体侵染没有直接关系。
 5.展望 
总之，植物的叶片衰老不仅受外界环境的调节作用，还受内部机制的协调作用，即受自身遗传基因的支配，并与植物体内多种激素的综合作用密切相关。因此，在控制叶片衰老时，要从外界环境和内部机制中认识叶片衰老的机理，并根据生产发展的需要来调控植物的生长发育，满足人们的需求。
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