环境化学物的一般毒性及其评价省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx

第二节 急性毒性及其评价方法Acute Toxicity Testing第1页一、急性毒性概念o急性毒性：是指机体(人或试验动物)一次或二十四小时内屡次接触外源化学物后在短期内所产生毒性效应。o o包含外观改变、大致形态改变、行为方式及死亡效应，最主要观察指标是LD50 第2页试验动物接触化学物方式或路径不一样，“一次”含义也有所不一样o经口和注射接触，“一次”是指在瞬间将受试化学物输入试验动物体内 o经呼吸道吸入与经皮肤接触，“一次”是指在一个特定期间内试验动物连续地接触受试化学物过程 第3页二、急性毒性试验目标 1.测试和求出受试化学物致死剂量(通常以LD 50 为主要参数)，并对该外源化学物进行急性毒性分级 2.经过观察动物中毒作用表现、毒作用强 度和死亡情况，初步评价毒物对机体毒效应特征、靶器官、剂量反应关系和对人体产生损害危险性 第4页 3.为亚慢性及慢性毒性试验研究以及其它 毒理试验提供接触剂量和观察指标选择依据 4.为毒作用机理研究提供线索，了解中毒 效应特征（包含症状，生理、生化与组织病理损伤）5.研究化学物急性中毒诊疗、预防和抢救 治疗办法第5页三、急性毒性试验方法关键点(一)试验动物选择 选择试验动物标准：o 尽可能选择急性毒性反应与人近似动物 o 易于喂养，试验动物操作方便 o 繁殖生育力较强，数量较大能够保障供给 o 价格较低，易于取得动物 o惯用试验动物为大白鼠和小白鼠第6页第7页性别 急性毒性试验所用动物应该是雌、雄各半 假如在研究中发觉待测化学物对雌、雄动物毒性大小有显著差异时，应分别求出雌性与雄性动物各自LD 50 值 假如试验是为致畸试验作剂量准备，也可仅做雌性动物LD 50 试验第8页试验动物分组和数量 在利用不一样方法测定化学物LD 50 时，试验设计中对动物数要求不一样 霍恩氏法测 LD 50 时要求有 4个剂量组，每组4或 5只动物 改进寇氏法、概率单位法、Bliss法测定则要求57个 剂量组，每组10只动物或10只以上对于不一样化学物测定应依据其对应试验规程确定试验动物数量第9页动物分组标准：均衡性和随机性 o均衡性：要求各组动物平均体重及体重离散度尽可能一致。详细来说是：（1）试验动物体重不应超出全体试验动物平均体重10-控制离散度（2）每组之间平均体重相差不应超出 5 -控制均衡性o随机性：每只动物分散到各组去机会是均等，以防止成见或系统误差第10页试验动物预处理o适应性喂养一周，选择生理健康动物 o凡经口染毒时，要求试验前要对动物禁食，以确保胃内无食物，降低食物对化学物毒性干扰n大鼠、小鼠大鼠、小鼠隔夜进食；染毒后禁食隔夜进食；染毒后禁食4hn大动物大动物每日早晨喂食前染毒每日早晨喂食前染毒n染毒后继续禁食染毒后继续禁食24h，但在禁食时要保障饮水，但在禁食时要保障饮水第11页(二)受试物及处理 o受试物接收、分样、保管、称重、配制 以及在此过程中严格质量确保影响急性 毒性试验 o受试物剂型：水溶液、混悬液、油溶液第12页(三)染毒方法1.经口(胃肠道)染毒：（1）灌胃：空腹 灌胃后2-3 h复食 灌胃体积不超出体重1-2：小鼠为 0.21.0ml/只或0.10.5ml/10g较适当 大鼠为5ml/只(通惯用0.51.0ml/100g）家兔为10ml/2kg体重，狗不超出50ml/10kg 第13页灌胃器具制作灌胃器具制作 o取l2号普通注射针头，首先将针头尖部去掉，然后用细锉刀把去掉部分锉平、锉光，再用沙纸磨光滑，有条件时可在针尖处点焊成球型。加工成有20度弧度灌胃针，连接1ml或5ml注射器，即成为大小鼠灌胃器。第14页灌胃操作方法灌胃操作方法o先固定动物,即用右手将小鼠尾巴提起，置于鼠笼或粗糙平面上，当小鼠向前挣扎时，用左手拇指和食指捏住小鼠两耳后颈背皮肤，翻转小鼠置于掌心，拉直后肢，以小指压住小鼠尾巴即可。在固定小鼠过程中，不要用力过大，勿握其颈部，以免窒息死亡。o以灌胃器轻轻压其头部，使口腔与食道成一条直线，再将灌胃针沿上腭壁轻轻进入食道，当灌胃针进入约3cm左右时即达胃内。第15页2.经呼吸道接触 在常温、常压下为气态，或在生产过程中 和生活过程中以蒸气、气溶胶、烟、粉尘 状态污染生产与生活环境空气，此时就有 可能经呼吸道吸入。吸入接触分为两种方式：静式吸入 动式吸入第16页3.经皮肤染毒 研究外源化学物经皮肤吸收应该尽可能选择皮肤解剖、生理与人类较近似动物为对象，当前多项选择取家兔和豚鼠 但因为研究化学物经皮肤吸收毒性(求经皮LD 50)所需试验动物较多，使用家兔、豚鼠不够经济，也惯用大鼠代替第17页第18页4.经注射染毒第19页(四)试验程序 1、查阅文件 首先了解分析受试化学物化学结构和其理化性质，依此查阅文件，找出与受试化学物化学结构与理化性质近似化学物毒性资料，并以文件资料中相同动物种系和相同接触路径所测得LD50(LC50)值作为受试化学物预期毒性中值。第20页2、预试验 以此预期毒性中值为待测化学物中间剂量组，再上下各推12个剂量组做预试验（每个剂量组间组距能够大些，有利于找出受试化学物致死剂量范围）依据确定剂量组进行染毒 依据预试验死亡资料确定组距可依据以下公式计算出剂量分组：i=(lgLDi=(lgLD9090-lgLD-lgLD1010)(n-1)(n-1)或：或：i=(lgLDi=(lgLD100100-lgLD-lgLD0 0)(n-1)(n-1)式中i为组距(相邻两个剂量组对数剂量之差)；n为设计剂量组数。第21页3、正式试验 普通来说，依据试验设计所选取LD50计算方法来确定组数。比如改良寇氏法普通设57个剂量组；霍恩法固定设4个剂量组。求得i后，以最低剂量组(LD0或LD10)对数剂量加上一个i值，即是第二个剂量组对数剂量，依这类推直至最高剂量组，查各自反对数即得出各组剂量真实值。1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 oLgLD0 LgLD0+i LgLD0+2i LgLD0+3i LgLD0+4i 第22页 4.症状观察 o(1)观察时间和周期o测定外源化学物LD 50(LC 50)，一般要 求计算试验动物接触化学物之后两周（14天）内总死亡数 o对于一些速死性化学物求其LD 50(LC 50)也可仅计算二十四小时死亡率（有些速杀性化学物二十四小时LD 50 与两周 LD 50 值往往没有差异）o应注明是多少时间LD 50 值，方便于在进行毒性比较时有共同基础第23页（2）中毒体症和发生过程观察 很多化学物在试验动物接触早期往往先出现兴奋现象，有化学物在动物接触早期首先表现为抑制现象 第24页第25页（3）死亡情况和时间分布：计算LD 50 重点观察和统计每只动物死亡时间，尤其是最早出现死亡时间以及各个剂量组动物死亡数。分析中毒死亡时间规律含有一定意义，可为深人研究化学物毒作用机制提供参考。第26页（4）体重：体重能够反应动物中毒后整体改变。体重改变原因很多，若化学毒物刺激或损伤消化道可出现试验动物饮食降低甚至拒食，表现为体重减轻；若化学毒物引发腹泻，将影响食物吸收和利用，体重也会减轻。假如化学毒物影响水摄取或肾功效急性损伤，也可能在体重上反应出来。所以，对存活动物尤其是对低于LD50剂量组存活动物，应在观察期14天内称量其体重改变，方便了解受试物引发毒效应连续时间。第27页（5）病理检验和其它指标观察n凡中毒死亡动物应及时解剖做病理学检验，检验器官有没有充血、出血、水肿或其它改变，并对有改变脏器作病理组织学检验 n对存活动物于观察期结束后应做病理学检验n依据试验需要可进行一些生化指标测定等第28页经典急性毒性试验不足o消耗动物量大o取得信息有限o测得LD50是一个统计近似值o在安全性评价中仅评价动物死亡和简单症状观察是不够，更需要是生理学、血液学及其它化验检验所提供深入细致毒性信息。第29页急性毒性替换试验o固定剂量法o上下移动法第30页四、急性毒性分级和评价第31页第32页第33页第三节 亚慢性、慢性毒性及其评价方法Subchronic And Chronic Toxicity Tests第34页一、亚慢性毒性作用(一)概念 亚慢性毒性：是指机体连续较长久接触外源化合物所产生中毒效应。第35页（二）亚慢性毒性试验目标 1.研究受试物亚慢性毒性剂量一反应（效 应）关系，确定其观察到有害作用最低剂量（LOAEL）和未观察到有害作用剂量（NOAEL），初步提出此受试物安全限量参考数值 2.确定受试物亚慢性毒性效应谱，毒作用特点和靶器官第36页3.研究受试物亚慢性毒性损害可逆性 4.为慢性毒性试验剂量设计及观察指标选择提供依据 5.为在其它试验中发觉或未发觉毒作用提供新信息，比较不一样动物物种毒效应差异，为受试物毒作用机制研究和将研究结果外推到人提供依据第37页（三）亚慢性毒性试验方法关键点1、试验动物选择 o亚慢性毒性作用研究普通要求选择两种试验动物，一个为啮齿类，另一个为非啮齿类，如大鼠和狗，方便全方面了解受试物毒性特征o因为亚慢性毒性试验期较长，所以被选择动物体重(年纪)应较小，如小鼠应为15g左右，大鼠100g左右第38页试验动物选择试验动物选择 亚慢性毒性试验亚慢性毒性试验 年纪：年纪：大鼠大鼠80100g 狗狗 812月月 小鼠小鼠1015g数量：数量：小动物小动物20 大动物大动物6性别：性别：雌雄各半雌雄各半第39页2、染毒路径 亚慢性毒性试验接触外源化学物路径选择，应考虑两点：尽可能模拟人类在环境中接触该化合物路径或方式 应与预期进行慢性毒性试验接触路径相一致 详细接触路径主要有经口、经呼吸道和经皮肤三种第40页3、剂量选择与分组 亚慢性试验上限剂量，需控制在试验动物接触受试化合物整个过程中，不发生死亡或仅有个别动物死亡，但有显著中毒效应，或靶器官出现经典损伤。此剂量确实定可参考两个数值，一是以急性毒性阈剂量为亚慢性试验最高剂量；一是以此化合物LD 50 1/201/5为最高剂量。第41页o阴性对照组阴性对照组o低剂量组低剂量组o中剂量组中剂量组o高剂量组高剂量组 急性毒性阈剂量急性毒性阈剂量 （1/201/5）LD50o组距：组距：310倍，最低大于倍，最低大于2倍倍亚慢性亚慢性试验分组和剂量设计试验分组和剂量设计第42页4、观察指标 普通性指标 1）外观体征、行为活动：2）动物体重：体重改变表示方式，可 将接触组与对照组同期体重绝对增加重量或体重百分增加率(以接触化学物开始时动物体重为100%)进行统计和比较第43页 3）食物利用率：是指动物每食入100g饲 料所增加体重克数。分析比较接触组与对照组食物利用率，有利于分析受试化学物对试验动物生物学效应 4）症状：试验动物在接触外来化合物过程 中所出现中毒症状及出现各症状先后次序、时间均应统计和分析第44页 试验室检验指标：血象：包含红细胞计数、白细胞计数和 分类、血红蛋白定量等 肝、肾功效检测：SGOT、SGPT、血清尿素氮、尿蛋白定性或定量、尿沉渣 镜检等 普通为筛检性和探讨性第45页系统尸检和病理学检验 亚慢毒性试验中应重视病理学检验。凡是在染毒过程中死亡动物均应及时解剖，肉眼检验后再进行病理组织学检验，必要时作组织化学或电镜镜检。第46页脏器系数 脏器系数(称脏/体比值)：是指某个脏器湿重与单位体重比值，通常以100g体重计。如肝/体比,即(全肝湿重/体重)100,此指标意义：试验动物在不一样年纪期，其各脏器与体重之间重量比值有一定规律。若受试化学物使某个脏器受到损害，则此比值就会发生改变，能够增大或缩小。据此可提供受试物靶器官主要线索。所以，脏/体比值是一个灵敏、有效和经济指标 第47页二、慢性毒性作用（chronic toxicity)（一）概念 慢性毒性：是指试验动物或人长久（甚至终生）重复接触外源化学物所产生毒性效应。第48页o慢性毒性试验试验期限，应依受试物详细要求和试验动物物种而定 o如用大鼠试验期限可为1年，用狗则试验期限可12年 o慢性毒性试验可终生接触受试物 o假如慢性毒性试验与致癌试验结合进行，则试验动物染毒时间最好靠近或等于动物预期寿命第49页（二）慢性毒性试验目标 1.研究受试物慢性毒性剂量一反应（效应）关系，确定其慢性毒性参数下限，即观察到有害作用最低剂量（LOAEL）和未观察到有害作用剂量（NOAEL），为对该受试物危险性评价和制订安全限量提供依据第50页 2.研究受试物慢性毒性效应谱，确定慢性毒作用靶器官 3.假如试验期限不是终生染毒，则还应观察受试物毒性损害可逆性。4.为毒性机制研究和将毒性结果外推到人提供依据第51页（三）慢性毒性试验方法关键点 1、试验动物选择 o慢性毒性试验选择试验动物条件与亚慢性毒性试验相同。但试验动物最好为纯系甚至同窝动物均匀分布于各剂量组o试验动物年纪应较小，大鼠和小鼠应为初断奶者，即小鼠出生后3周，体重 1012g；大鼠出生后34周，体重 5070g。性别要雌雄各半第52页试验动物选择o 慢性毒性试验慢性毒性试验年纪：大鼠年纪：大鼠 5070g 狗狗 5)，但当小剂量重复与机体接触后，红细胞与脑组织乙酰胆碱酯酶能够连续降低，而且伴有一定程度中枢神经系统症候第74页 剂量固定20天蓄积法：试验分为5组，包含阴性对照组和 1/20 LD 50，1/10LD 50，1/5LD 50，1/2LD 50，每组动物数10只，雌雄各半，每日染毒1次，连续20天，观察每组动物死亡数第75页o剂量固定20天蓄积试验评价标准 各剂量组均无死亡，蓄积性不显著 1/2LD 50 剂量组死亡，其它组无死亡，则弱蓄积性 1/20LD 50 剂量组无死亡，其它各组间死 亡数有剂量反应关系，则为中等蓄积性 1/20LD 50 剂量组有死亡，各组间死亡数 有剂量反应关系，则为强蓄积性第76页 生物半减期法 生物半减期法是用毒物动力学原理说明外源化学物在机体内蓄积作用特征。第77页四、局部毒作用四、局部毒作用o1.皮肤原发性刺激试验皮肤原发性刺激试验o2.皮肤致敏反应试验皮肤致敏反应试验o3.光致敏反应光致敏反应o4.光刺激试验光刺激试验o5.眼刺激试验眼刺激试验o6.其它粘膜刺激试验其它粘膜刺激试验o7.替换（体外）试验替换（体外）试验第78页Photo by R.Grippo第79页