食品中化学物致突变作用及其评价省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx

第六章第六章 食品中化学物质突变作食品中化学物质突变作用及其评价用及其评价第1页2 2遗传毒理学|第一节第一节 基本概念基本概念|第二节第二节 化学毒物致突变类型化学毒物致突变类型|第三节第三节 致突变作用机制和后果致突变作用机制和后果|第四节第四节 机体对致突变作用影响机体对致突变作用影响|第五节第五节 观察化学毒物致突变作用观察化学毒物致突变作用 基本方法基本方法第2页3 3基本概念基本概念|遗传毒理学遗传毒理学(Genetic ToxicologyGenetic Toxicology)zz是毒理学一个分支，研究外源化学物及是毒理学一个分支，研究外源化学物及是毒理学一个分支，研究外源化学物及是毒理学一个分支，研究外源化学物及其它环境原因对生物体遗传机构损害作其它环境原因对生物体遗传机构损害作其它环境原因对生物体遗传机构损害作其它环境原因对生物体遗传机构损害作用及其规律。其主要目标是检测那些能用及其规律。其主要目标是检测那些能用及其规律。其主要目标是检测那些能用及其规律。其主要目标是检测那些能引发引发引发引发DNADNADNADNA损伤环境原因，研究其遗传毒损伤环境原因，研究其遗传毒损伤环境原因，研究其遗传毒损伤环境原因，研究其遗传毒作用特点及对人类潜在危害。作用特点及对人类潜在危害。作用特点及对人类潜在危害。作用特点及对人类潜在危害。第3页4 4基本概念基本概念zz突变突变突变突变(mutation)mutation)mutation)mutation)遗传结遗传结遗传结遗传结构本身改构本身改构本身改构本身改变变变变及其引及其引及其引及其引发变发变发变发变异称异称异称异称为为为为突突突突变变变变，突，突，突，突变实变实变实变实际际际际上是上是上是上是遗传遗传遗传遗传物物物物质质质质一个可一个可一个可一个可遗传变遗传变遗传变遗传变异异异异。|自发突变自发突变自发突变自发突变(spontaneous mutation)spontaneous mutation)spontaneous mutation)spontaneous mutation)因为自然界中诱变剂作用或因为偶然自制、因为自然界中诱变剂作用或因为偶然自制、因为自然界中诱变剂作用或因为偶然自制、因为自然界中诱变剂作用或因为偶然自制、转录、转录、转录、转录、修复时碱基配对错误所产生突变。修复时碱基配对错误所产生突变。修复时碱基配对错误所产生突变。修复时碱基配对错误所产生突变。|诱发突变诱发突变诱发突变诱发突变(induced mutation)induced mutation)induced mutation)induced mutation)诱变剂诱发突变。诱变剂诱发突变。诱变剂诱发突变。诱变剂诱发突变。第4页5 5zz致突变作用或诱变作用致突变作用或诱变作用致突变作用或诱变作用致突变作用或诱变作用(mutagenesis)mutagenesis)mutagenesis)mutagenesis)广广广广义义义义概念是外来原因，尤其是化学因子引概念是外来原因，尤其是化学因子引概念是外来原因，尤其是化学因子引概念是外来原因，尤其是化学因子引发细发细发细发细胞核胞核胞核胞核中中中中遗传遗传遗传遗传物物物物质发质发质发质发生改生改生改生改变变变变能力，而且此种改能力，而且此种改能力，而且此种改能力，而且此种改变变变变可随同可随同可随同可随同细细细细胞分裂胞分裂胞分裂胞分裂过过过过程而程而程而程而传递传递传递传递。简单简单简单简单地地地地说说说说，突，突，突，突变发变发变发变发生及其生及其生及其生及其过过过过程程程程即即即即为为为为致突致突致突致突变变变变作用。作用。作用。作用。zz化学诱变剂化学诱变剂化学诱变剂化学诱变剂(chemical mutagen)chemical mutagen)chemical mutagen)chemical mutagen)zz基因突变基因突变基因突变基因突变(gene mutation)gene mutation)gene mutation)gene mutation)一个或几个一个或几个一个或几个一个或几个DNADNADNADNA碱基正确改碱基正确改碱基正确改碱基正确改变变变变|染色体畸变染色体畸变染色体畸变染色体畸变(chromosome aberration)chromosome aberration)chromosome aberration)chromosome aberration)染色体染色体染色体染色体结结结结构及数目改构及数目改构及数目改构及数目改变变变变 基本概念基本概念第5页6 6|DNADNA与基因与基因:基因基因(gene)gene)基因组基因组(genosome)genosome)|染色质染色质(chromatin)chromatin)与染色体与染色体(chromosome)chromosome)|体细胞体细胞(somatic cell)somatic cell)和生殖细胞和生殖细胞(germ cell)germ cell)|基因型基因型(genotype)genotype)与表型与表型(pheotype)pheotype)|细胞周期细胞周期(cell cycle)cell cycle)、有丝分裂有丝分裂(mitosis)mitosis)与减数分裂与减数分裂(meiosis)meiosis)基本概念基本概念第6页7 7基本概念基本概念第7页8 8基本概念基本概念第8页9 9基本概念基本概念第9页1010基本概念基本概念第10页1111|基因突变（基因突变（gene mutationgene mutation）|染色体畸变（染色体畸变（chromosome aberrationchromosome aberration）|非整倍体和多倍体非整倍体和多倍体(aneuploidy and polyloid)aneuploidy and polyloid)化学毒物致突变类型化学毒物致突变类型第11页1212化学毒物致突变类型化学毒物致突变类型|一、基因突变一、基因突变(gene mutation)gene mutation)zz1 1 1 1碱基置换碱基置换碱基置换碱基置换(basebasebasebasepair substitution)pair substitution)pair substitution)pair substitution)指某一碱基配对性能改变或脱落所致突变。指某一碱基配对性能改变或脱落所致突变。指某一碱基配对性能改变或脱落所致突变。指某一碱基配对性能改变或脱落所致突变。转换转换转换转换(transition)transition)transition)transition)颠换颠换颠换颠换(transvertion)transvertion)transvertion)transvertion)zz2 2 2 2移码突变移码突变移码突变移码突变 (frameshift mutation)frameshift mutation)frameshift mutation)frameshift mutation)指发生一对或几对（三对除外）碱基降低或指发生一对或几对（三对除外）碱基降低或指发生一对或几对（三对除外）碱基降低或指发生一对或几对（三对除外）碱基降低或增加，以致从受损点开始碱基序列完全改变，增加，以致从受损点开始碱基序列完全改变，增加，以致从受损点开始碱基序列完全改变，增加，以致从受损点开始碱基序列完全改变，形成错误密码，并转译成为不正常氨基酸。形成错误密码，并转译成为不正常氨基酸。形成错误密码，并转译成为不正常氨基酸。形成错误密码，并转译成为不正常氨基酸。第12页1313|一、基因突变一、基因突变(gene mutation)gene mutation)化学毒物致突变类型化学毒物致突变类型第13页1414化学毒物致突变类型化学毒物致突变类型|一、基因突变一、基因突变(gene mutation)gene mutation)第14页1515|二、染色体畸变二、染色体畸变(chromosome aberration)chromosome aberration)指染色体结构改变指染色体结构改变 z染色单体型畸变染色单体型畸变(chromatid-type aberration)chromatid-type aberration)z染色体型畸变染色体型畸变(chromosome aberration)chromosome aberration)染色体畸变染色体畸变裂隙裂隙(gap)gap)断裂断裂(break)break)断片断片(fragment)fragment)和和缺失缺失(deletion)deletion)微小体微小体(minute body)minute body)无着丝点环无着丝点环环状染色体环状染色体 双着丝点染色体双着丝点染色体 倒位倒位(inversion)inversion)易位易位(translocation)translocation)插入插入(insertion)insertion)和和重复重复(duplication)duplication)辐射体辐射体 化学毒物致突变类型化学毒物致突变类型第15页1616染色体缺失及环状染色体形成图染色体缺失及环状染色体形成图染色体插入和重复示意图染色体插入和重复示意图第16页1717染色体臂间倒位染色体臂间倒位染色体相互易位示意图染色体相互易位示意图第17页1818|二、染色体畸变二、染色体畸变(chromosome aberration)chromosome aberration)化学毒物致突变类型化学毒物致突变类型第18页1919|三、基因组突变三、基因组突变三、基因组突变三、基因组突变 z1 1非非整整倍倍体体 非非整整倍倍体体(aneuploid)aneuploid)指指细细胞胞丢丢失失或或增增加加一一条条或或几几条条染染色色体体。缺缺失失一一条条染染色色体体时时称称为为单单体体(monosome)monosome)，增增 加加 一一 条条 染染 色色 体体 时时 称称 为为 三三 体体(trisome)trisome)。染染色色体体数数目目标标改改变变会会造造成成基基因因平平衡衡失失调调，可可能能影影响响细细胞胞生生存存或或造造成成形形态态及及功功效效上上异异常常。如如2121三体造成先天愚型三体造成先天愚型(DownDown氏综合征氏综合征)。z2 2整整倍倍体体 整整倍倍体体(euploid)euploid)指指染染色色体体数数目目标标异异常常是是 以以 染染 色色 体体 组组 为为 单单 位位 增增 减减，如如 形形 成成 三三 倍倍 体体(triploid)triploid)、四四倍倍体体(tetroploid)tetroploid)等等。在在人人体体，3 3n n为为6969条条染染色色体体，4 4n n为为9292条条染染色色体体。在在肿肿瘤瘤细细胞胞及及人人类类自自然然流流产产胎胎儿儿细细胞胞中中可可有有三三倍倍体体细细胞胞存存在在。发发生生于生殖细胞整倍体改变，几乎都是致死性。于生殖细胞整倍体改变，几乎都是致死性。化学毒物致突变类型化学毒物致突变类型第19页2020致突变作用机制|一、一、DNADNA损伤与突变损伤与突变|(一一)碱基损伤碱基损伤z1.碱基错配碱基错配z2.嵌入嵌入DNA链链z3.碱基类似物取代碱基类似物取代z4.碱基化学结构改变或破坏碱基化学结构改变或破坏 第20页2121|一、一、DNADNA损伤与突变损伤与突变|（二）（二）DNADNA链受损链受损 1.1.二聚体形成二聚体形成 2.2.DNADNA加合物（加合物（DNA adductsDNA adducts）形成形成 3.3.DNA-DNA-蛋白质交联物蛋白质交联物(DNA-ProteinDNA-Protein crosslinks crosslinks，DPC)DPC)形成形成|二、二、引发突变细胞分裂过程改变引发突变细胞分裂过程改变|三、其它改变三、其它改变 对对DNADNA合成和修复相关酶系统作用可间接造成合成和修复相关酶系统作用可间接造成 DNADNA损伤，诱发基因突变或染色体畸变。损伤，诱发基因突变或染色体畸变。致突变作用机制第21页2222突变不良后果突变不良后果突变不良后果突变不良后果突变不良后果 体细胞突变体细胞突变体细胞突变体细胞突变 生殖细胞突变生殖细胞突变生殖细胞突变生殖细胞突变 癌变癌变癌变癌变致畸致畸致畸致畸衰老衰老衰老衰老配子死亡配子死亡配子死亡配子死亡死胎死胎死胎死胎自发流产自发流产自发流产自发流产先天畸形先天畸形先天畸形先天畸形第22页2323|一、一、机体修复机体修复DNADNA损伤机制可分为两大类：损伤机制可分为两大类：1.损损伤伤耐耐受受机机制制：指指DNA遗遗传传可可绕绕过过那那些些阻阻止止DNA 复制复制DNA损伤。损伤。2.修复机制：修复机制：DNA修复修复直接修复直接修复切除修复切除修复O6甲基鸟嘌呤修复甲基鸟嘌呤修复光修复光修复错配碱基修复错配碱基修复碱基切除修复碱基切除修复核苷酸切除修复核苷酸切除修复机体对致突变作用影响复制后修复复制后修复呼救性修复呼救性修复第23页2424机体对致突变作用影响|二、遗传原因对致突变作用影响：二、遗传原因对致突变作用影响：z(一一)代谢酶遗传多态性代谢酶遗传多态性 z(二二)修复功效个体差异修复功效个体差异 第24页2525观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法|一、观察项目标选择一、观察项目标选择z 1 1观察效应终点类型观察效应终点类型基因突变和染色体畸变检测可直接反应基因突变和染色体畸变检测可直接反应化学毒物致突变性，是评价化学毒物致化学毒物致突变性，是评价化学毒物致突变性唯一可靠方法。还有许多试验所突变性唯一可靠方法。还有许多试验所观察到现象并不反应基因突变、染色体观察到现象并不反应基因突变、染色体畸变和染色体分离异常，而仅反应致突畸变和染色体分离异常，而仅反应致突变过程中发生其它事件。所以，将试验变过程中发生其它事件。所以，将试验观察到现象所反应各种事件统称为观察到现象所反应各种事件统称为遗传遗传学终点学终点(genetic endpoint)genetic endpoint)。第25页2626观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法|一、观察项目标选择一、观察项目标选择z遗传学终点分为遗传学终点分为5 5类：类：DNADNA完整性改变完整性改变(形成加合物，断裂，形成加合物，断裂，交联交联)；DNADNA重排或交换；重排或交换；DNADNA碱基序列改变；碱基序列改变；染色体完整性改变；染色体完整性改变；染色体分离改变。染色体分离改变。l其中其中实际上指基因突变，实际上指基因突变，指染色体指染色体畸变。畸变。第26页2727观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法|2 2成套观察项目成套观察项目z遗传毒理学评价程序通常为一组体内、外遗传毒理遗传毒理学评价程序通常为一组体内、外遗传毒理学试验。因为：学试验。因为：化学毒物种类和结构各种多样，其致突变机制不尽化学毒物种类和结构各种多样，其致突变机制不尽相同，作用靶细胞也不一样，有是体细胞，或生殖细相同，作用靶细胞也不一样，有是体细胞，或生殖细胞，或二者兼而有之，故在成套观察项目中既要用体胞，或二者兼而有之，故在成套观察项目中既要用体细胞检测又要用生殖细胞；除了从分子水平还要从细细胞检测又要用生殖细胞；除了从分子水平还要从细胞水平来检测化学毒物遗传毒性。胞水平来检测化学毒物遗传毒性。致突变物中仅少数含有直接致突变作用，大多数为致突变物中仅少数含有直接致突变作用，大多数为间接致突变作用，即需要在体内代谢活化后，才含有间接致突变作用，即需要在体内代谢活化后，才含有致突变作用。体内试验含有完整活化系统，而体外试致突变作用。体内试验含有完整活化系统，而体外试验则经过加入模拟代谢系统，如验则经过加入模拟代谢系统，如S S9 9来填补缺乏活化系来填补缺乏活化系统不足。这是体内与体外试验主要差异。统不足。这是体内与体外试验主要差异。化学毒物致突变性有强，也有弱；有在某一检测系化学毒物致突变性有强，也有弱；有在某一检测系统中是强致突变物，而在另一系统中可能是弱致突变统中是强致突变物，而在另一系统中可能是弱致突变物。对于弱致突变物在一些系统中比较轻易漏检，即物。对于弱致突变物在一些系统中比较轻易漏检，即出现假阴性。出现假阴性。对药品代谢酶系统诱导处理动物肝脏均浆9000克、10分钟离心沉淀上澄液（S9），含辅酶，能促进致癌物质代谢活化S9第27页2828|2 2成套观察项目成套观察项目|关于遗传毒理学成套观察项目中那些试验可入关于遗传毒理学成套观察项目中那些试验可入选标准有：选标准有：z选择遗传毒性试验应包含选择遗传毒性试验应包含5 5种类型遗传学终种类型遗传学终点。点。z通常试验材料有病毒、细菌、真菌、培养哺通常试验材料有病毒、细菌、真菌、培养哺乳细胞、植物、昆虫及哺乳动物等。乳细胞、植物、昆虫及哺乳动物等。z体内试验与体外试验配合。体内试验与体外试验配合。z应包含生殖细胞和体细胞。应包含生殖细胞和体细胞。z通常，对于一个受试物应该先用原核细胞或体通常，对于一个受试物应该先用原核细胞或体细胞体外试验按遗传学终点合理配套进行试验，细胞体外试验按遗传学终点合理配套进行试验，并对有阳性结果遗传学终点验证其在体内真实并对有阳性结果遗传学终点验证其在体内真实性，再行选取生殖细胞致突变试验进行遗传危性，再行选取生殖细胞致突变试验进行遗传危害评价。害评价。观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法DNA完整性改变DNA重排或交换DNA碱基序列改变，染色体完整性改变，染色体分离改变遗传学终点。第28页2929|二、惯用致突变试验二、惯用致突变试验 z(一一)细菌回复突变试验细菌回复突变试验(AmesAmes试验试验)鼠伤寒沙门氏菌鼠伤寒沙门氏菌原养型原养型(his+)组氨酸营养缺点型突组氨酸营养缺点型突变株。变株。(his-)正向突变正向突变回复突变回复突变代谢活化系统代谢活化系统受试物受试物观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法第29页3030|二、惯用致突变试验二、惯用致突变试验z(二二)微核试验微核试验 微核微核(Micronucleus)Micronucleus)产生与染色体损伤相关，产生与染色体损伤相关，是染色体或染色单体无着丝点断片或纺锤丝受是染色体或染色单体无着丝点断片或纺锤丝受损伤而丢失整个染色体，在细胞分裂后期遗留损伤而丢失整个染色体，在细胞分裂后期遗留在细胞质中，末期之后，单独形成一个或几个在细胞质中，末期之后，单独形成一个或几个规则次核，包含在子细胞胞质内，因比主核小，规则次核，包含在子细胞胞质内，因比主核小，故称微核。故称微核。在细胞质中微核起源有二：断片或在细胞质中微核起源有二：断片或无着丝粒染色体在细胞分裂后期不能定向移动，无着丝粒染色体在细胞分裂后期不能定向移动，而遗留在细胞质中；有丝分裂毒物作用使个别而遗留在细胞质中；有丝分裂毒物作用使个别染色体或带苔丝粒染色体环和断片在细胞分裂染色体或带苔丝粒染色体环和断片在细胞分裂后期被留在细胞质中。后期被留在细胞质中。微核试验微核试验(Micronucleus Micronucleus testtest，MNT)MNT)是观察受试物能否产生微核试验。是观察受试物能否产生微核试验。其主要可检出其主要可检出DNADNA断裂剂和非整倍体诱变剂。断裂剂和非整倍体诱变剂。观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法第30页3131观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法(二二)微核试验微核试验第31页3232MNNCE观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法第32页3333|二、惯用致突变试验二、惯用致突变试验z(三三)染色体畸变分析染色体畸变分析 z(四四)姐妹染色单体交换试验（姐妹染色单体交换试验（SCE）观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法第33页3434|二、惯用致突变试验二、惯用致突变试验z(五五)果蝇伴性隐性致死试验果蝇伴性隐性致死试验z(六六)显性致死试验显性致死试验z(七七)程序外程序外DNA台成试验台成试验 z(八八)转基因动物致突变试验转基因动物致突变试验z(九九)哺乳动物细胞基因突变试验哺乳动物细胞基因突变试验观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法第34页3535|三、致突变试验中一些问题三、致突变试验中一些问题 z(一一)阴性和阳性对照设置阴性和阳性对照设置 1 1阴性对照阴性对照 它是空白对照，即不加任何处理。它是空白对照，即不加任何处理。或者是溶剂对照。阴性对照除了无处理原因外，或者是溶剂对照。阴性对照除了无处理原因外，与试验组完全相同。其目标是取得试验基础数与试验组完全相同。其目标是取得试验基础数据。比如，据。比如，AmesAmes试验阴性对照可了解所用细菌试验阴性对照可了解所用细菌自发回复突变率；证实除处理原因外无任何使自发回复突变率；证实除处理原因外无任何使回复突变率增加或降低原因。回复突变率增加或降低原因。2 2阳性对照阳性对照 是用某种已知能产生阳性反应是用某种已知能产生阳性反应物质作为对照。其目标是经过对阳性物质试验物质作为对照。其目标是经过对阳性物质试验证实试验方法可靠；验证试验者在本试验条件证实试验方法可靠；验证试验者在本试验条件下，完成技术和判定致突变物能力；证实经一下，完成技术和判定致突变物能力；证实经一段时间后，本试验重复性。比如，段时间后，本试验重复性。比如，AmesAmes试验中试验中阳性对照未出现阳性结果，应考虑突变菌株可阳性对照未出现阳性结果，应考虑突变菌株可能发生问题，另一个可能是代谢活化能力不足。能发生问题，另一个可能是代谢活化能力不足。所以，当阳性对照结果未呈阳性，其试验组试所以，当阳性对照结果未呈阳性，其试验组试验数据可靠性亦大大降低。验数据可靠性亦大大降低。观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法第35页3636|三、致突变试验中一些问题三、致突变试验中一些问题z(二二)体外试验活化系统体外试验活化系统 1 1哺乳动物细胞介导哺乳动物细胞介导 使用完整细胞，尤其是大使用完整细胞，尤其是大鼠肝原代细胞，与测试细菌或细胞一起培养。这也鼠肝原代细胞，与测试细菌或细胞一起培养。这也是一个活化系统。它有完整细胞结构和各种酶及内是一个活化系统。它有完整细胞结构和各种酶及内源性辅助因子，代谢能力优于无细胞系统如源性辅助因子，代谢能力优于无细胞系统如S9S9，但但不如体内活化系统。不如体内活化系统。2 2S9 S9S9 S9指经酶诱导剂处理后制备肝匀浆，再经指经酶诱导剂处理后制备肝匀浆，再经90009000g g离心分离所得上清液，加上适当缓冲液和辅离心分离所得上清液，加上适当缓冲液和辅助因子。它主要含有混合功效氧化酶助因子。它主要含有混合功效氧化酶(MFO)MFO)，是国是国内常规应用于体外致突变试验代谢活化系统，其缺内常规应用于体外致突变试验代谢活化系统，其缺点是点是S9S9随试验动物种属或器官不一样而有差异；随试验动物种属或器官不一样而有差异；S9S9含有大量亲核物质有可能影响试验敏感性。含有大量亲核物质有可能影响试验敏感性。3 3纯化酶和基因工程纯化酶和基因工程 应用纯化细胞色素应用纯化细胞色素P-450P-450、谷胱苷肽转移酶及过氧化物水解酶，可严格控制代谷胱苷肽转移酶及过氧化物水解酶，可严格控制代谢产物诱发突变条件，但技术难度大。利用基因工谢产物诱发突变条件，但技术难度大。利用基因工程，将人细胞色素程，将人细胞色素P-450P-450基因，插入组合细胞内，基因，插入组合细胞内，用上述细胞进行致突变试验，使细胞含有代谢活化用上述细胞进行致突变试验，使细胞含有代谢活化系统。系统。观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法第36页3737|三、致突变试验中一些问题三、致突变试验中一些问题z(三三)致突变试验与致癌试验关系致突变试验与致癌试验关系 已知大多数化学致癌物含有致突变作用，遗已知大多数化学致癌物含有致突变作用，遗传学改变在原癌基因激活和抑癌基因失活上起传学改变在原癌基因激活和抑癌基因失活上起主要作用，致癌物诱致关键靶基因遗传改变直主要作用，致癌物诱致关键靶基因遗传改变直接作用等在哺乳动物试验中证实。接作用等在哺乳动物试验中证实。发觉人类接触致癌物与发觉人类接触致癌物与DNADNA加合物，同其肿瘤加合物，同其肿瘤中癌基因和抑癌基因特异碱基对突变之间含有中癌基因和抑癌基因特异碱基对突变之间含有相关性。相关性。传统长久致癌试验，花费大，周期长，不能传统长久致癌试验，花费大，周期长，不能适应化学物质快速增加需要。另外，致癌试验适应化学物质快速增加需要。另外，致癌试验所用动物数量有限，难以检出弱致癌物。需要所用动物数量有限，难以检出弱致癌物。需要发展各种体内和体外短期试验，用于对化学物发展各种体内和体外短期试验，用于对化学物质致癌性进行筛检。质致癌性进行筛检。观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法第37页3838|三、致突变试验中一些问题三、致突变试验中一些问题z(四四)试验结果在毒理学安全性评价中作用试验结果在毒理学安全性评价中作用 阴性结果判定条件：阴性结果判定条件：最高剂量应包含受试物溶解度许可或灌胃量最高剂量应包含受试物溶解度许可或灌胃量许可最大剂量。如该剂量毒性很大，则体内试许可最大剂量。如该剂量毒性很大，则体内试验和细菌试验应为最大耐受量。使用哺乳动物验和细菌试验应为最大耐受量。使用哺乳动物细胞进行体外试验，常选细胞进行体外试验，常选LDLD5050或或LDLD8080为最大剂量。为最大剂量。溶解度大、毒性低化学物，在细菌试验中能够溶解度大、毒性低化学物，在细菌试验中能够50005000gg皿作为最高剂量。皿作为最高剂量。各剂量组组间差距不应过大，以防漏检仅在各剂量组组间差距不应过大，以防漏检仅在非常狭窄范围内才有突变能力一些化学毒物。非常狭窄范围内才有突变能力一些化学毒物。满足上述条件，仍为阴性，才慎重下结论。满足上述条件，仍为阴性，才慎重下结论。观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法第38页3939|三、致突变试验中一些问题三、致突变试验中一些问题z(四四)试验结果在毒理学安全性评价中试验结果在毒理学安全性评价中作用作用阳性结果应含有剂量阳性结果应含有剂量反应关系，即随反应关系，即随剂量增加，致突变作用增加；和在一组剂量增加，致突变作用增加；和在一组或多组观察值与阴性对照比较有显著性或多组观察值与阴性对照比较有显著性差异。阳性结论，即表明受试物含有致差异。阳性结论，即表明受试物含有致突变性，而不一样致突变试验遗传学终突变性，而不一样致突变试验遗传学终点不一样，其所表示含义不一。如基因点不一样，其所表示含义不一。如基因突变是含有造成遗传性疾病突变，突变是含有造成遗传性疾病突变，DNADNA修复实际后果尚不明确。修复实际后果尚不明确。观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法观察化学毒物致突变作用基本方法第39页4040致突变试验举例|美国美国EPA毒物处毒物处(1936)提出了一个三阶段试验方案，把遗传提出了一个三阶段试验方案，把遗传毒性检测和生殖细胞致突变性验证分阶段进行。毒性检测和生殖细胞致突变性验证分阶段进行。z第一阶段测试化学物遗传毒性，包含第一阶段测试化学物遗传毒性，包含Ames试验、体外哺乳动物试验、体外哺乳动物细胞基因突变试验、体内骨髓染色体损伤试验细胞基因突变试验、体内骨髓染色体损伤试验(微核试验或染色微核试验或染色体畸变试验体畸变试验)；z第二阶段测试对生殖细胞致突变作用；第二阶段测试对生殖细胞致突变作用；z第三阶段为哺乳动物生殖细胞致突变性标准试验。第三阶段为哺乳动物生殖细胞致突变性标准试验。z在遗传危害性评价时，在体外基因突变试验中呈阳性化学物应进在遗传危害性评价时，在体外基因突变试验中呈阳性化学物应进行与哺乳类性腺行与哺乳类性腺DNA相互作用试验，包含睾丸细胞相互作用试验，包含睾丸细胞SCE、UDS、染色体畸变及碱性洗脱试验等，也可进行显性致死试验，在第二染色体畸变及碱性洗脱试验等，也可进行显性致死试验，在第二阶段中出现阳性反应，需进行小鼠特异座位试验，可观察形态改阶段中出现阳性反应，需进行小鼠特异座位试验，可观察形态改变或生化改变；在体内骨髓细胞染色体畸变试验或微核试验中呈变或生化改变；在体内骨髓细胞染色体畸变试验或微核试验中呈阳性化学物需进行显性致死试验，在第二阶段中出现阳性反应，阳性化学物需进行显性致死试验，在第二阶段中出现阳性反应，再进行小鼠可遗传易位试验。再进行小鼠可遗传易位试验。第40页4141致突变试验举例|国际协调组织国际协调组织(1CH)(1997)对于药品遗传毒性评价提议对于药品遗传毒性评价提议检测试验组合为检测试验组合为z细菌基因突变试验；细菌基因突变试验；z体外哺乳动物细胞染色体畸变试验或体外小鼠淋巴瘤体外哺乳动物细胞染色体畸变试验或体外小鼠淋巴瘤细胞比试验；细胞比试验；z体内啮齿类造血细胞染色体损伤试验体内啮齿类造血细胞染色体损伤试验(骨髓细胞染色体骨髓细胞染色体畸变试验或骨髓或外周血多染红细胞微核试验畸变试验或骨髓或外周血多染红细胞微核试验)。z在对经标准试验组合得到致突变作用结果进行深入研究在对经标准试验组合得到致突变作用结果进行深入研究时，其它试验如时，其它试验如DNA加合物测定、加合物测定、DNA链断裂检测、链断裂检测、DNA修复和重组试验等都可作为供选择试验。对于在三修复和重组试验等都可作为供选择试验。对于在三项标准试验中为阴性化学物，通常可认为其无遗传毒性项标准试验中为阴性化学物，通常可认为其无遗传毒性作用。但对于构效关系显示有可能具致癌性或致突变性，作用。但对于构效关系显示有可能具致癌性或致突变性，但在三项标准试验中为阴性化学物，还需要改进试验方但在三项标准试验中为阴性化学物，还需要改进试验方法或再增加试验项目。对于在三项标准试验中为阴性，法或再增加试验项目。对于在三项标准试验中为阴性，但致癌试验显示有致癌效应，又无明确证听说明该化学但致癌试验显示有致癌效应，又无明确证听说明该化学物是经过非遗传毒性机制发挥作用时，为了了解其作用物是经过非遗传毒性机制发挥作用时，为了了解其作用方式，可再进行改变代谢活化系统体外试验或应用肿瘤方式，可再进行改变代谢活化系统体外试验或应用肿瘤发生靶器官进行遗传损伤试验发生靶器官进行遗传损伤试验(如肝脏如肝脏UDS试验、试验、DNA加加合物检测、转基因突变检测、肿瘤相关基因遗传改变检合物检测、转基因突变检测、肿瘤相关基因遗传改变检测测)。第41页4242致突变试验举例|我国卫生部在食品安全性毒理学评价我国卫生部在食品安全性毒理学评价程序程序(1994)中对遗传毒理学试验要求中对遗传毒理学试验要求是：是：z依据受试物化学结构、理化性质以及对遗传物质作依据受试物化学结构、理化性质以及对遗传物质作用终点不一样，并兼顾体外和体内试验用终点不一样，并兼顾体外和体内试验 以及体细胞以及体细胞和生殖细胞标准，在和生殖细胞标准，在Ames路试验、小鼠骨髓微核试路试验、小鼠骨髓微核试验或骨髓细胞染色体畸变试验、小鼠精子畸形试验验或骨髓细胞染色体畸变试验、小鼠精子畸形试验和睾丸染色体畸变试验中选择四项，如其中一项试和睾丸染色体畸变试验中选择四项，如其中一项试验为阳性，还应在其它备选试验验为阳性，还应在其它备选试验(V79细胞细胞HGPRT基因突变试验，显性致死试验，果蝇伴性隐性致死基因突变试验，显性致死试验，果蝇伴性隐性致死试验，试验，UDS试验试验)中再选择两项试验进行。我国中再选择两项试验进行。我国农药安全性毒理学评价程序农药安全性毒理学评价程序(1991)中对遗传毒中对遗传毒理学试验要求则为：理学试验要求则为：Ames试验和大肠杆菌回复突变试验和大肠杆菌回复突变试验，骨髓细胞微核试验或骨髓细胞染色体畸变试试验，骨髓细胞微核试验或骨髓细胞染色体畸变试验，睾丸细胞染色体畸变试验或显性致死试验为必验，睾丸细胞染色体畸变试验或显性致死试验为必做项目，若有一项出现阳性，还需从精子畸形试验、做项目，若有一项出现阳性，还需从精子畸形试验、体外培养细胞染色体畸变试验、体外培养细胞染色体畸变试验、UDS、果蝇伴性隐果蝇伴性隐性致死试验等试验中再选择两项进行。性致死试验等试验中再选择两项进行。第42页