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生物物理学内容生物物理学内容分子生物物理学（分子生物物理学（Molecular Biophysics)生物物理仪器与技术生物物理仪器与技术(Biophysical Instrumentation and Techniques)膜与细胞生物物理学膜与细胞生物物理学(Membrane and Cell Biophysics)理论生物物理学理论生物物理学(Theoretical Biophysics)感官与神经生物物理学感官与神经生物物理学(Sensory and Neural Biophysics)自由基与电磁生物物理学自由基与电磁生物物理学第1页荧光分光光度术荧光分光光度术Spectrophotofluorimetry第2页一、荧光发觉一、荧光发觉 二、荧光与荧光光谱二、荧光与荧光光谱 三、三、荧光光谱仪荧光光谱仪及主要谱参量及主要谱参量四、荧光生色团结构特点四、荧光生色团结构特点五、五、影响荧光测量原因影响荧光测量原因六、荧光技术在生物学、医学研究中应用六、荧光技术在生物学、医学研究中应用荧光分光光度术荧光分光光度术第3页第4页夜明珠发光成因夜明珠发光成因 1、矿物发光性、矿物发光性 矿物在外来能量激发下，产生可见光性质称为矿物发光性。外来能量有日光、紫外线、X射线、阴极射线、加热、加压、摩擦等。依据其发光性质不一样，分为荧光和磷光二类。2、矿物发光机理、矿物发光机理 矿物发光是矿物能量一个转换过程，物体受激发吸收能量而跃迁至激发态（非稳定态）在反回到基态过程中，以光形式放出能量。第5页一一 荧光发觉荧光发觉 1575：N.Monardes Lignum Nephriticum1852：Stokes 分光计 植物抽提液、矿物、夜明珠、叶绿素、奎宁 借用萤石（借用萤石（Fluospar）发光现象而推演，）发光现象而推演，荧光荧光 Fluorescence1867年年：Goppelsroder AL 与桑色素配合测定与桑色素配合测定AL 含量1880：Liebeman 提出“荧光与化学结构关系”经验法则 为荧光技术开发应用拉开了序幕第6页（一）荧光产生（二）荧光光谱与吸收光谱二二 荧光与荧光光谱荧光与荧光光谱第7页（一）荧光产生1 分子能量状态分子能量状态在光学分析中包括分子能量有：在光学分析中包括分子能量有：Eo=Ee+Ev+Er Ee：价电子运动能：价电子运动能,electron Ev：原子在平衡位置附近振动：原子在平衡位置附近振动,vibration Er：分子绕其重心转动能：分子绕其重心转动能,rotation 其中，其中，Ee Ev Er第8页（一）荧光产生2 分子能级Energy Levels与跃迁Transition第9页（二）荧光光谱与吸收光谱第10页荧光分光光度术：荧光分光光度术：又称荧光光谱术，属于光谱技术中一个发射光谱术。其原理是电磁波和物质作用后，物质首先吸收电磁波能量，然后再重新发射电磁波。激发波段在100-800nm之间，相当于紫外与可见光波段。第11页（一）荧光光谱仪（一）荧光光谱仪（二）荧光分光光度术中参量（二）荧光分光光度术中参量三 荧光光谱仪与主要参量第12页（一）荧光光谱仪（一）荧光光谱仪吸收光谱仪光路图吸收光谱仪光路图荧光光谱仪光路图荧光光谱仪光路图第13页氢灯能量分布氢灯能量分布氘灯能量分布氘灯能量分布氙灯（红线）和带有玻璃外套汞灯能量分布氙灯（红线）和带有玻璃外套汞灯能量分布1 激发光源激发光源 在紫外在紫外-可见光区，可供荧光激发用光源很多包含：钨灯，碘钨灯，可见光区，可供荧光激发用光源很多包含：钨灯，碘钨灯，氢灯，氘灯，汞灯，氙灯等。主要依据光源稳定性和强度选择光源。氢灯，氘灯，汞灯，氙灯等。主要依据光源稳定性和强度选择光源。第14页实践中常不选取强光源：实践中常不选取强光源：伴随光强增加，会同时造成散射光和热量增多伴随光强增加，会同时造成散射光和热量增多 强光源照射，轻易使样品产生光化分解强光源照射，轻易使样品产生光化分解 强光源需要稳压稳流装置复杂而昂贵强光源需要稳压稳流装置复杂而昂贵 产生大量臭氧，损害健康产生大量臭氧，损害健康 第15页对于光源要注意以下几点对于光源要注意以下几点:（1）正负极不要接错。）正负极不要接错。（2）拿灯时，不要碰窗口，以免手上油污经紫外照射后，难以去除。拿灯时，不要碰窗口，以免手上油污经紫外照射后，难以去除。应及时用无水乙醇擦洁净。应及时用无水乙醇擦洁净。（3）灯有寿命，要节约使用。灯有寿命，要节约使用。（4）开启间隔普通要大于半小时，待灯冷却后，在重新开启。开启间隔普通要大于半小时，待灯冷却后，在重新开启。开启后要预热开启后要预热 半小时。半小时。（5）不要用眼睛直视灯。不要用眼睛直视灯。第16页2 样品池样品池在可见可用玻璃池，但紫外区一定要用石英池。在可见可用玻璃池，但紫外区一定要用石英池。（1）设置空白对照）设置空白对照。（2）清洗问题，关键是即时冲洗。）清洗问题，关键是即时冲洗。自来水冲洗自来水冲洗SDS浸泡浸泡双蒸水冲洗双蒸水冲洗浓硝酸处理浓硝酸处理双蒸水冲洗双蒸水冲洗第17页（二）荧光分光光度术中参量（二）荧光分光光度术中参量 exMaximum excitation wavelength em,max Maximum emission wavelength第18页A 荧光强度定义：在一定激发波长荧光强度定义：在一定激发波长(ex)作用下，发射作用下，发射 荧光强弱。荧光强弱。F=Ia Ia=I0-I，I=I010-cL F=I0(1-10-cL)当当C很低时很低时F=I0cL，当当C较大时较大时F=I0 B =发射光子数发射光子数/吸收光子数吸收光子数 2 荧光强度（fluorescence intensity,F,I）与 量子产率（quantum yield,）（二）荧光分光光度术中参量（二）荧光分光光度术中参量第19页荧光强度与浓度关系荧光强度与浓度关系第20页3荧光偏振荧光偏振(fluorescence polarization)（二）荧光分光光度术中参量（二）荧光分光光度术中参量自然光自然光 部分偏振光部分偏振光 偏振光偏振光第21页I/-I I/+I P=I/-I I/+2I A=荧光偏振度荧光偏振度Fluorescence polarization-p 荧光各向异性荧光各向异性Fluorescence anisotropy-A第22页(1)荧光偏振度物理意义：荧光偏振度物理意义：A：I/=I ，P=0，自然光，荧光分子运动很快，自然光，荧光分子运动很快，取取 向随机。（稀溶液）向随机。（稀溶液）B：I/或或I 为为0，P=1 偏振光，荧光分子运动很偏振光，荧光分子运动很慢，取向有序。慢，取向有序。C：I/I 0，0P1，生物大分子荧光属于这，生物大分子荧光属于这种情况。种情况。第23页(2)环境原因及分子运动对荧光偏振度影响环境原因及分子运动对荧光偏振度影响 A.温度影响：温度影响：溶液粘度溶液粘度 A：温度影响：温度影响 温度升高，温度升高，P降低降低 B：溶液粘度：溶液粘度 粘度升高，粘度升高，P升高升高C：分子运动：分子运动转动转动旋转弛豫时间旋转弛豫时间rotational relaxation time 第24页（二）荧光分光光度术中参量（二）荧光分光光度术中参量4 荧光寿命荧光寿命（Fluorescence liftime-）荧光衰减为原来激发时最大荧光强度荧光衰减为原来激发时最大荧光强度1/e所需要时间所需要时间I=I0e-kt,=1/k 分子所处环境分子所处环境有没有淬灭有没有淬灭有没有能量转移有没有能量转移有没有分子间相互作用有没有分子间相互作用影响原因影响原因第25页5 荧光探剂荧光探剂(1)含有环状共轭双键即含有环状共轭双键即电子系统电子系统(2)量子产率随环境改变，而且改变很大量子产率随环境改变，而且改变很大(3)能产生稳定荧光小分子能产生稳定荧光小分子 藻胆蛋白藻胆蛋白phycobiliprotein 绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白Green Fluorescent Protein (4)与研究对象特定基团共价结合或与蛋白质非共价与研究对象特定基团共价结合或与蛋白质非共价 结合结合第26页（5）荧光探针应用分类 测定细胞活性荧光探针：活细胞探针和死细胞探针 膜荧光探针：荧光基团标识磷脂，阴离子膜探针，阳离子膜探针，其它非极性和双亲性膜探针。细胞器荧光探针：线粒体探针，溶酶体、酵母菌液泡和其它酸性细胞器探针 Ca2，Mg2，Zn2，Na，K，Cl等离子荧光探针 pH荧光探针:近中性pH应用探针，酸性，探针交联物 活性氧和一氧化氮探针 信号转导探针：蛋白激酶，蛋白磷酸酶和核苷酸结合蛋白探针 入胞作用、受体和离子通道探针pH 细胞形态和流体测量荧光示踪剂 细胞骨架蛋白荧光探针 第27页四四 荧光生色团结构特点荧光生色团结构特点1 天然荧光生色团结构特点天然荧光生色团结构特点（1）碳原子骨架：）碳原子骨架：分子含有共轭双键体系，大多含有芳香环或杂环分子含有共轭双键体系，大多含有芳香环或杂环 任何有利于提升任何有利于提升电子共子共轭度度结构改构改变，都将提升，都将提升 荧光效率。荧光效率。比如：对苯基化，间苯基化等。比如：对苯基化，间苯基化等。第28页（2）分子几何排布：）分子几何排布：含有刚性平面结构含有刚性平面结构 荧光素荧光素酚酞酚酞四四 荧光生色团结构特点荧光生色团结构特点第29页（4）取代基位置：）取代基位置：邻位、对位邻位、对位荧光增强，间位荧光增强，间位荧光减弱（荧光减弱（-CN基例基例 外）外）(5)环境、溶剂、温度及环境、溶剂、温度及pH等均会影响分子结构，从而影等均会影响分子结构，从而影响荧光响荧光四四 荧光生色团结构特点荧光生色团结构特点（3）取代基类型：）取代基类型：（1）加强荧光基团：给电子取代基，）加强荧光基团：给电子取代基，-NH2,-NHR,-OH,-OR,-CN,-OCH3,-OC2H5 （2）减弱荧光基团：得电子取代基，）减弱荧光基团：得电子取代基，-CO2H,-COOH,-C=O,-NO2,-NO,-SH,-F,-Cl,-Br,-I （3）影响不显著基团：）影响不显著基团：-R,-SO3H,-NH3第30页2 蛋白质和核酸中荧光生色团蛋白质和核酸中荧光生色团Tryptophan(W,Trp)Phenylalanine(F,Phe)Tyrosine(Y,Tyr)四四 荧光生色团结构特点荧光生色团结构特点第31页生色团生色团条件条件 exnm max10-3 emnm F Fns敏感度敏感度 max F 10-2TrpH2O,pH72805.63480.22.611TyrH2O,pH72741.43030.13.61.4PheH2O,pH72570.22820.046.40.08Y-baseYeas t-RNAPhe3201.34600.076.30.91亚硝基奈酚+Tyr茚三酮（Cu2+,pH5.8)+Phe ex:460nm,em:570nm ex:365nm,em:515nm四四 荧光生色团结构特点荧光生色团结构特点第32页 五 影响荧光测量原因1 光化分解（photodissociation）光照后造成化学键断裂荧光减弱2 淬灭(quenching)(1)温度淬灭：温度每升高温度每升高10C，荧光降低百分比，称为温度系数。，荧光降低百分比，称为温度系数。在在20-300C范围内，温度系数大约为范围内，温度系数大约为1.5。(1)浓度淬灭：21 内滤光效应（inner filter effect)(3)杂质淬灭：3O2 1O2第33页3 溶液溶液pH影响影响利用一些物质在不一样利用一些物质在不一样pH值溶液中荧光强度和颜色改变，值溶液中荧光强度和颜色改变，能够判别各种滴定终点。能够判别各种滴定终点。指示剂指示剂颜色改变颜色改变pH范围范围萘萘 酚酚无色变黄绿无色变黄绿8.2-10.3荧光素荧光素浅绿变绿浅绿变绿4.0-5.0丫啶橙丫啶橙浅黄绿变黄浅黄绿变黄8.0-10.0第34页4 溶液极性影响溶液极性影响荧光物质在非极性溶液中发射峰位比其在极性溶液中峰位向短波方向荧光物质在非极性溶液中发射峰位比其在极性溶液中峰位向短波方向（或高频方向）移动，即蓝移，同时荧光强度前者也高于后者。（或高频方向）移动，即蓝移，同时荧光强度前者也高于后者。DPH水溶液中水溶液中膜膜 中中发射波长：发射波长：440nm发射波长：发射波长：430nm第35页5 溶剂和化学试剂溶剂和化学试剂(1)溶剂选择要适宜溶剂选择要适宜 比如：苯、丙酮、酚在紫外波段有吸收。比如：苯、丙酮、酚在紫外波段有吸收。(2)溶剂要纯溶剂要纯6 荧光污染荧光污染(1)涂活塞用润滑油以及橡皮塞和软木塞涂活塞用润滑油以及橡皮塞和软木塞(2)去污剂去污剂(3)微生物污染微生物污染(4)滤纸滤纸第36页六 荧光分光光度术应用(一）一）.物质检测物质检测 1 测量原理：测量原理：稀溶液，稀溶液，F=I0cL 2 结构特点：含有结构特点：含有“芳香环芳香环”结构结构 3 灵敏度：灵敏度：10-710-8g/ml第37页检测物质激发波长nm发射波长nm维生素A345490维生素B2，pH7370565维生素B12，pH7275305维生素C4905303,4-苯并芘10-6g/ml3814035羟色胺，中性或弱酸性2953305羟色胺，盐酸295550，330第38页硕士物大分子构象（二）蛋白质荧光分析蛋白质荧光分析1 蛋白质内源荧光蛋白质内源荧光第39页2 蛋白质外源荧光蛋白质外源荧光第40页（三）核酸荧光分析（三）核酸荧光分析嘌呤及衍生物嘌呤及衍生物室温，用紫外和可见光照射，中性水溶液中，均无荧光。室温，用紫外和可见光照射，中性水溶液中，均无荧光。酸性介质中，腺嘌呤和鸟嘌呤有荧光。酸性介质中，腺嘌呤和鸟嘌呤有荧光。碱性介质中，鸟嘌呤有荧光碱性介质中，鸟嘌呤有荧光嘧啶及衍生物嘧啶及衍生物游离胸腺嘧啶有自发荧光，但量子产率极低游离胸腺嘧啶有自发荧光，但量子产率极低0.00153 核酸荧光标识核酸荧光标识第41页Probes ex emNoteEthidium Bromide545610非透膜，非透膜，RNA,DNAPropidium Iodine530615PO-PRO-1 iodine435455Acridine Orange490590透膜，透膜，RNA,DNAPyronin Y545580Bisbenzimide345460透膜，透膜，DNA第42页（四）（四）利用荧光技术检测分子间结合程度利用荧光技术检测分子间结合程度1 用荧光偏振用荧光偏振改变改变检测结合程度检测结合程度当一些小分子，如辅酶、辅基、半抗原等与特异蛋白质反应时，改变当一些小分子，如辅酶、辅基、半抗原等与特异蛋白质反应时，改变其荧光特征（强度与偏振），经过这些参数改变，能够了解他们结其荧光特征（强度与偏振），经过这些参数改变，能够了解他们结合时信息。合时信息。结合后大分子驰豫时间长，荧光偏振就大。结合后大分子驰豫时间长，荧光偏振就大。第43页用杀鼠灵滴定HSA Scatchard图r=L Ka(n-r)L=L0 LP=L0 rP0ex=320nm em=400nm2 用荧光强度改变检测结合程度用荧光强度改变检测结合程度第44页（五）大分子内基团间或分子间距离测定荧光共振能量转移荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer,FRET)第45页荧光共振能量转移三个条件：荧光共振能量转移三个条件：供体和受体都能发光供体发射谱和受体激发谱必须有部分重合供体和受体距离必须小于100第46页Forster 公式E=R06/(R6+R06)R0:临界距离，E：转移效率，R：基团间距离E=1-IDA/ID IDA:受体存在时荧光强度，ID：受体不存在时荧光强度 大分子内基团间或分子间距离测定第47页1 膜流动性 DPH：P值小，流动性高 2-AS，6-AS，9-AS，12-AS高2 膜渗漏性 羧基荧光素(selfquenching)3 膜电位测量Nernst公式：E(mV)=59log(KO+/KI+)KO+：细胞外浓度，KI+：细胞内浓度 荧光探剂：花菁（cyanine)K+载体：缬氨霉素：（六）膜生物物理研究第48页4 膜融合机理研究方法一：利用能量共振转移现象第49页II方法二：利用淬灭现象第50页1/25 膜成份扩散速度测定荧光漂白恢复技术fluorescence recovery after photobleaching，FRAP第51页D：扩散系数，：光斑半径，1/2：漂白后荧光值恢复到稳定值二分之一所需时间，rD：与光斑形状相关一个常数。惯用探剂：标识脂类DiI 标识蛋白异硫氰荧光素（FITC），蕊香红（rhodamine）D=241/2rD第52页（七）荧光技术与其它技术结合 1 显微荧光光度术 对细胞内不一样成份进行定性定位或定量 2 流式细胞术荧光，激光和计算机结合 3 激光扫描共聚焦显微镜 FRAP 4光镊（optical tweezers)第53页Fluo-3/Ca2+，AM,ex=506nm,em=526nm第54页第55页 思索题1 荧光产生机理是什么？2 荧光技术研究生物学样品主要参数有哪些？量子产率与荧光强度区分及关系是什么？荧光偏振意义是什么？3 举例说明荧光技术应用？第56页4.假如婴幼儿体内缺乏使苯丙氨酸转变为假如婴幼儿体内缺乏使苯丙氨酸转变为酪氨酸酶时，则苯丙氨酸含量异常增大而酪氨酸酶时，则苯丙氨酸含量异常增大而患患“苯丙酮尿症苯丙酮尿症”且易引发智力低下，所且易引发智力低下，所以，对婴幼儿该项体查极为主要，不过，以，对婴幼儿该项体查极为主要，不过，因为血液蛋白质中其它芳香氨基酸影响而因为血液蛋白质中其它芳香氨基酸影响而难以测出苯丙氨酸含量，请用本课程所学难以测出苯丙氨酸含量，请用本课程所学内容提出一个检测方案。内容提出一个检测方案。第57页参考资料1.赵南明，周海梦，生物物理学，北京：高等教育出版赵南明，周海梦，生物物理学，北京：高等教育出版 社，海德堡：社，海德堡：施普林格出版社，施普林格出版社，2.林克椿，生物物理技术林克椿，生物物理技术波谱技术及其在生物学中应用，北京：波谱技术及其在生物学中应用，北京：高等教育出版社，高等教育出版社，19893.林克椿，吴本玠，医学生物物理学，北京医科大学。北京大学医林克椿，吴本玠，医学生物物理学，北京医科大学。北京大学医学出版社，学出版社，4.李楠，王凤翔，周春喜，荧光探针应用技术，北京：军事医学科李楠，王凤翔，周春喜，荧光探针应用技术，北京：军事医学科学出版社，学出版社，19985.Pattabhi Vasantha,Gautham N.Biophysics,Pangbourne:Alpha Science,第58页