内酰胺类抗生素高分子杂质测定法.pptx

第一节 -内酰胺类抗生素中高分子杂质v一、定义一、定义-内酰胺类抗生素（内酰胺类抗生素（-lactamantibiotics）系指）系指化学结构中含有化学结构中含有-内酰胺环一大类抗生素，包含临内酰胺环一大类抗生素，包含临床最惯用青霉素（床最惯用青霉素（penicillins）与头孢菌素）与头孢菌素（cephalosporin），以及近年开发头霉素类、硫），以及近年开发头霉素类、硫霉素类、单环霉素类、单环-内酰胺类等其它非经典内酰胺类等其它非经典-内酰胺类内酰胺类抗生素。抗生素。系对药品中分子量大于药品本身杂质总称。其系对药品中分子量大于药品本身杂质总称。其分子量普通在分子量普通在10005000，个别可至约，个别可至约10000道尔道尔顿，小于化工、生化领域中所指高分子化合物分子顿，小于化工、生化领域中所指高分子化合物分子量。量。6/26/20241内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第1页-内酰胺类抗生素中高分子杂质v二、分类及起源二、分类及起源按其起源分为两类：外源性杂质和内源性按其起源分为两类：外源性杂质和内源性杂质。杂质。外源性杂质：包含外源性杂质：包含蛋白蛋白、多肽多肽、多糖等类、多糖等类杂质或抗生素和蛋白、多肽、多糖等结合物。杂质或抗生素和蛋白、多肽、多糖等结合物。普通起源于发酵工艺，如青霉素中青霉噻唑普通起源于发酵工艺，如青霉素中青霉噻唑蛋白、青霉噻唑多肽等。蛋白、青霉噻唑多肽等。6/26/20242内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第2页v内源性杂质：抗菌药品本身聚合产物。聚合内源性杂质：抗菌药品本身聚合产物。聚合物即可来自生产过程，又可在储存中形成，物即可来自生产过程，又可在储存中形成，甚至在用药时使用不妥也可产生。甚至在用药时使用不妥也可产生。v抗生素聚合物抗生素聚合物免疫原性免疫原性通常较弱，但作为多通常较弱，但作为多价价半抗原半抗原，可引发，可引发速发型过敏反应速发型过敏反应。免疫原性免疫原性(immunogenicity)：抗原刺激机体产生免：抗原刺激机体产生免疫应答，诱生抗体或致敏淋巴细胞能力。疫应答，诱生抗体或致敏淋巴细胞能力。抗原性抗原性(antigenicity)：抗原与其诱生抗体或致敏：抗原与其诱生抗体或致敏淋巴细胞有特异性结合能力。也写作反应原性。淋巴细胞有特异性结合能力。也写作反应原性。完全抗原：同时具备完全抗原：同时具备2个性质。天然蛋白质都是完全个性质。天然蛋白质都是完全抗原。抗原。半抗原半抗原(hapten)：只有抗原性而没有免疫原性物质，：只有抗原性而没有免疫原性物质，即只能与抗体结合，却不能单独诱导抗体产生物质，即只能与抗体结合，却不能单独诱导抗体产生物质，称为半抗原。普通分子量较小，如化学药品。半抗原称为半抗原。普通分子量较小，如化学药品。半抗原+载体载体(carrier)完全抗原完全抗原。速发型过敏反应是一个常见过敏反应，主要为速发型过敏反应是一个常见过敏反应，主要为呼吸道过敏反应、消化道过敏反应、皮肤过敏呼吸道过敏反应、消化道过敏反应、皮肤过敏反应以及过敏性休克。反应以及过敏性休克。伴随当代生产工艺不停改进和提升，当前产伴随当代生产工艺不停改进和提升，当前产品中外源性杂质日趋降低，对品中外源性杂质日趋降低，对内源性聚合物内源性聚合物控制是当前抗生素药品高分子杂质控制重点。控制是当前抗生素药品高分子杂质控制重点。6/26/20243内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第3页图1 水温引发阿莫西林干糖浆中高分子杂质含量改变6/26/20244内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第4页-内酰胺类抗生素中高分子杂质v三、形成机理及结构特征三、形成机理及结构特征v（一）青霉类抗生素：高分子杂质有蛋白（多肽）（一）青霉类抗生素：高分子杂质有蛋白（多肽）类杂质和聚合物杂质两大类。类杂质和聚合物杂质两大类。6/26/20245内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第5页v青霉噻唑多肽：青霉噻唑多肽：制剂中青霉噻唑多肽分子量主要分布在制剂中青霉噻唑多肽分子量主要分布在35002400道尔顿左右，有青霉素道尔顿左右，有青霉素-内酰胺环和内酰胺环和多肽伯氨基按亲核反应机理多肽伯氨基按亲核反应机理缩合缩合而成，主要而成，主要发生在发生在发酵工艺发酵工艺中。样品在储存过程中，多中。样品在储存过程中，多肽类杂质残留自由氨基仍与肽类杂质残留自由氨基仍与-内酰胺反应，内酰胺反应，直至被饱和，反应速度和样品本身直至被饱和，反应速度和样品本身水分含量水分含量及及储存温度储存温度相关。相关。6/26/20246内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第6页青霉噻唑蛋白基本结构青霉噻唑蛋白基本结构青霉素青霉素G内酰胺环断裂点内酰胺环断裂点6/26/20247内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第7页v青霉素聚合物：青霉素聚合物：1.反应仅和母核结构相关，侧链中活性基团反应仅和母核结构相关，侧链中活性基团不参加反应。不参加反应。一分子青霉素首先开环，形成一新活性位一分子青霉素首先开环，形成一新活性位点，并与另一分子青霉素聚合。点，并与另一分子青霉素聚合。2.侧链参加聚合反应侧链参加聚合反应主要以氨苄青霉素为代表，反应时侧链上主要以氨苄青霉素为代表，反应时侧链上氨基亲核攻击氨基亲核攻击-内酰胺抗生素内酰胺抗生素羰基碳原子羰基碳原子，形成聚合物。形成聚合物。6/26/20248内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第8页v头孢菌素：头孢菌素中高分子杂质主要是不头孢菌素：头孢菌素中高分子杂质主要是不一样类型聚合物。一样类型聚合物。1.只与母核结构相关只与母核结构相关N型聚合反应型聚合反应eg.头孢噻吩、头孢呋辛、头孢哌酮等头孢噻吩、头孢呋辛、头孢哌酮等2.侧链参加侧链参加L型聚合反应。型聚合反应。eg.头孢氨苄、头孢拉定、头孢噻肟等头孢氨苄、头孢拉定、头孢噻肟等在碱性条件下，两种反应都能够发生。在碱性条件下，两种反应都能够发生。6/26/20249内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第9页-内酰胺类抗生素中高分子杂质内酰胺类抗生素中高分子杂质v四、结构特点四、结构特点高度不均一性和不确定性。高度不均一性和不确定性。1.青霉噻唑多肽（蛋白）类杂质青霉噻唑多肽（蛋白）类杂质发酵中产生任何蛋白及蛋白碎片都可能带发酵中产生任何蛋白及蛋白碎片都可能带入到产品中；相同蛋白或蛋白碎片上能够结入到产品中；相同蛋白或蛋白碎片上能够结合不一样数目标药品分子。合不一样数目标药品分子。6/26/202410内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第10页v2.聚合物类杂质：青霉素、头孢菌素不但能聚合物类杂质：青霉素、头孢菌素不但能形成聚合度不一样聚合物，许多样品还能同形成聚合度不一样聚合物，许多样品还能同时发生时发生不一样机理不一样机理聚合反应。聚合反应。v3.形成聚合物可发生不一样程度分（降）解形成聚合物可发生不一样程度分（降）解反应，如开环等。反应，如开环等。v4.对以异构体形式存在样品，同聚和异聚反对以异构体形式存在样品，同聚和异聚反应可同时发生。应可同时发生。v5.实践中发觉高分子杂质种类及数量和实践中发觉高分子杂质种类及数量和生产生产工艺工艺亲密相关，如氨苄西林钠，溶媒法和喷亲密相关，如氨苄西林钠，溶媒法和喷雾干燥法高分子杂质含有不一样特异性，且雾干燥法高分子杂质含有不一样特异性，且二者聚合物含量显著不一样。二者聚合物含量显著不一样。冻干粉冻干粉二聚物二聚物溶媒粉溶媒粉二聚物二聚物6/26/202411内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第11页-内酰胺类抗生素中高分子杂质内酰胺类抗生素中高分子杂质v五、影响聚合物形成原因五、影响聚合物形成原因1.青霉素聚合物青霉素聚合物青霉素聚合反应速度在溶液条件下和溶液青霉素聚合反应速度在溶液条件下和溶液酸碱度酸碱度关系亲密；在固体条件下主要和样品关系亲密；在固体条件下主要和样品水分含量水分含量相关。相关。6/26/202412内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第12页v2.头孢菌素聚合物头孢菌素聚合物固体状态下头孢菌素类产品聚合速度与固体状态下头孢菌素类产品聚合速度与含含水量水量和和贮存温度贮存温度关系亲密。关系亲密。贮存温度较低时，含水量差异对聚合物含贮存温度较低时，含水量差异对聚合物含量尽管有影响，但影响不大；但当贮存温度量尽管有影响，但影响不大；但当贮存温度上升至上升至37时，含水量差异对聚合物含量影时，含水量差异对聚合物含量影响十分显著。响十分显著。6/26/202413内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第13页-内酰胺类抗生素中高分子杂质v六、口服青霉素类药品使用前进行皮试必要六、口服青霉素类药品使用前进行皮试必要性性口服青霉素类抗生素在国内外都有过敏反口服青霉素类抗生素在国内外都有过敏反应报道，但其原因未有试验报道。有相关报应报道，但其原因未有试验报道。有相关报道，在青霉素道，在青霉素V聚合物可经胃肠道吸收而引发聚合物可经胃肠道吸收而引发过敏反应。所以，在口服青霉素类抗生素前，过敏反应。所以，在口服青霉素类抗生素前，必须进行皮肤过敏试验，这是十分必要。必须进行皮肤过敏试验，这是十分必要。6/26/202414内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第14页-内酰胺类抗生素中高分子杂质内酰胺类抗生素中高分子杂质v七、抗生素高分子杂质质控意义七、抗生素高分子杂质质控意义1.-内酰胺类抗生素中高分子杂质是引发临内酰胺类抗生素中高分子杂质是引发临床床速发型过敏反应速发型过敏反应过敏原；过敏原；2.高分子杂质经注射和口服都可引发过敏反高分子杂质经注射和口服都可引发过敏反应，所以注射剂和口服剂都应控制。应，所以注射剂和口服剂都应控制。3.高分子杂质是高分子杂质是-内酰胺类抗生素质量评价内酰胺类抗生素质量评价主要指标，可评价药品质量和稳定性，并可主要指标，可评价药品质量和稳定性，并可借此深入评价其生产工艺。借此深入评价其生产工艺。6/26/202415内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第15页第二节第二节高分子杂质分析方法高分子杂质分析方法高分子杂质质控方法高分子杂质质控方法化学分析化学分析免疫学分析免疫学分析色谱法色谱法分光法（分光法（P值法）值法）间接血凝法间接血凝法豚鼠豚鼠PCA法法反相模式反相模式离子交换模式离子交换模式凝胶色谱模式凝胶色谱模式一、概述一、概述6/26/202416内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第16页v因为结构不一样高分子杂质通常有相同生物因为结构不一样高分子杂质通常有相同生物学特征，如：均为过敏性杂质，所以，在药学特征，如：均为过敏性杂质，所以，在药品质量控制中普通品质量控制中普通不需不需分别控制不一样结构分别控制不一样结构高分子杂质含量，而只需控制药品中高分子高分子杂质含量，而只需控制药品中高分子杂质杂质总量总量。故依据。故依据分子量差异分子量差异进行分离进行分离凝胶凝胶色谱模式色谱模式是简便易行分离模式。是简便易行分离模式。v以葡聚糖凝胶以葡聚糖凝胶SephadexG-10为基础凝胶色为基础凝胶色谱分析方法，可简便地用于对各种谱分析方法，可简便地用于对各种-内酰胺内酰胺类抗生素中高分子杂质分离、分析，并满足类抗生素中高分子杂质分离、分析，并满足药品质量控制需要。药品质量控制需要。6/26/202417内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第17页高分子杂质分析方法高分子杂质分析方法v二、凝胶色谱系统分离原理及特点二、凝胶色谱系统分离原理及特点6/26/202418内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第18页凝胶色谱系统分离原理及特点凝胶色谱系统分离原理及特点v1.凝胶色谱法凝胶色谱法凝胶色谱法又称凝胶色谱法又称分子排阻色谱法分子排阻色谱法。凝胶色。凝胶色谱法主要用于谱法主要用于高聚物高聚物相对分子质量分级分析相对分子质量分级分析以及相对分子质量分布测试。凝胶色谱法又以及相对分子质量分布测试。凝胶色谱法又叫凝胶色谱技术，是六十年代初发展起来一叫凝胶色谱技术，是六十年代初发展起来一个快速而又简单分离分析技术，因为设备简个快速而又简单分离分析技术，因为设备简单、操作方便，不需要单、操作方便，不需要有机溶剂有机溶剂，对高分子，对高分子物质有很高分离效果。它是利用一些凝胶对物质有很高分离效果。它是利用一些凝胶对混合物各组分因分子量不一样，其阻滞作用混合物各组分因分子量不一样，其阻滞作用也不一样而进行分离、分析方法。也不一样而进行分离、分析方法。6/26/202419内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第19页凝胶色谱系统分离原理及特点凝胶色谱系统分离原理及特点v2.凝胶色谱系统分离原理凝胶色谱系统分离原理（1）利用凝胶色谱分子筛机制，但凝胶孔径）利用凝胶色谱分子筛机制，但凝胶孔径要比分子筛大得多，普通为几百至几千埃。要比分子筛大得多，普通为几百至几千埃。让药品分子自由进入凝胶颗粒内部，而全部让药品分子自由进入凝胶颗粒内部，而全部高分子杂质被排阻，进而实现让全部高分子高分子杂质被排阻，进而实现让全部高分子杂质含有相同保留时间构想。杂质含有相同保留时间构想。6/26/202420内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第20页凝胶渗透色谱按分子大小分离原理图凝胶渗透色谱按分子大小分离原理图6/26/202421内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第21页v凝胶过滤柱层析所用基质是含有立体网状结凝胶过滤柱层析所用基质是含有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒物质。这构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒物质。这种物质能够种物质能够完全或部分完全或部分排阻一些排阻一些大分子化合大分子化合物物于筛孔之外，而对一些小分子化合物则不于筛孔之外，而对一些小分子化合物则不能排阻，但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。能排阻，但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。v任何一个被分离化合物被凝胶筛孔排阻程度任何一个被分离化合物被凝胶筛孔排阻程度可用可用分配系数分配系数Kav（被分离化合物在内水和（被分离化合物在内水和外水体积中百分比关系）表示。外水体积中百分比关系）表示。6/26/202422内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第22页v试验证实，试验证实，SephadexG-10凝胶可基本确凝胶可基本确保全部保全部-内酰胺抗生素中高分子杂质被排阻。内酰胺抗生素中高分子杂质被排阻。Kav=(Ve-Vo)/(Vt-Vo)Kav:分配系数；分配系数；Ve：被分离物质洗脱体积；：被分离物质洗脱体积；Vo：柱内凝胶床中颗粒间自由空间所占有体积：柱内凝胶床中颗粒间自由空间所占有体积（外水体积）；（外水体积）；Vt：柱内凝胶颗粒占有体积与外水体积之和：柱内凝胶颗粒占有体积与外水体积之和（柱床体积）（柱床体积）普通普通Kav0洗脱组分视作高分子杂质。洗脱组分视作高分子杂质。6/26/202423内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第23页外水体积（外水体积（Vo）：凝胶柱中凝胶颗粒周：凝胶柱中凝胶颗粒周围空间体积，即液体流动相体积；围空间体积，即液体流动相体积；内水体积（内水体积（Vi）：凝胶颗粒中孔穴体积，：凝胶颗粒中孔穴体积，即固定相体积；即固定相体积；基质体积（基质体积（Vg）：凝胶颗粒实际骨架体：凝胶颗粒实际骨架体积。积。Vt=Vo+Vi+Vg柱床体积（柱床体积（Vt）：凝胶柱：凝胶柱所能容纳总体积所能容纳总体积6/26/202424内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第24页洗脱体积（洗脱体积（Ve）：将样品中某一组分洗脱：将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液体积。下来所需洗脱液体积。普通是介于普通是介于Vo和和Vt之间。之间。（1）对于完全排阻大分子，因为其不进入）对于完全排阻大分子，因为其不进入凝胶颗粒内部，而只存在于流动相中，故凝胶颗粒内部，而只存在于流动相中，故Ve=Vo；（2）对于完全渗透小分子，因为能够存在）对于完全渗透小分子，因为能够存在于凝胶柱整个体积内，故于凝胶柱整个体积内，故Ve=Vt；分子量介于二者之间分子，其洗脱体积分子量介于二者之间分子，其洗脱体积也介于二者之间，但，有时也出现也介于二者之间，但，有时也出现VeVt，这是因为这种分子与凝胶吸附作用造成。，这是因为这种分子与凝胶吸附作用造成。6/26/202425内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第25页凝胶层析洗脱示意图凝胶层析洗脱示意图（1）完全排阻大分子）完全排阻大分子（2）中等分子）中等分子（3）完全渗透小分子）完全渗透小分子（4）吸附分子）吸附分子6/26/202426内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第26页v通常选取蓝色葡聚糖作为测定外水体积物质。通常选取蓝色葡聚糖作为测定外水体积物质。该物质分子量大（为该物质分子量大（为200万），呈蓝色，它在万），呈蓝色，它在各种型号葡聚糖凝胶中都被完全排阻，并可各种型号葡聚糖凝胶中都被完全排阻，并可借助其本身颜色，采取肉眼或分光光度仪检借助其本身颜色，采取肉眼或分光光度仪检测（测（210nm或或260nm或或620nm）洗脱体积）洗脱体积（即（即Vo）。不过，在测定激酶等蛋白质分子）。不过，在测定激酶等蛋白质分子量时，不宜用蓝色葡聚糖测定外水体积，因量时，不宜用蓝色葡聚糖测定外水体积，因为它对激酶有吸附作用，所以有时用为它对激酶有吸附作用，所以有时用巨球巨球蛋蛋白白代替。代替。6/26/202427内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第27页Vo测定测定6/26/202428内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第28页Vt测定测定6/26/202429内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第29页v（2）因为溶质分子和凝胶介质间存在各种次）因为溶质分子和凝胶介质间存在各种次级相互作用，溶质分子可被吸附于凝胶介质级相互作用，溶质分子可被吸附于凝胶介质表面。表面。v（3）在凝胶颗粒内部含有较大比表面积和较）在凝胶颗粒内部含有较大比表面积和较小自由空间，故溶质分子更易和凝胶介质接小自由空间，故溶质分子更易和凝胶介质接触，所以溶质分子在触，所以溶质分子在凝胶颗粒内部凝胶颗粒内部较较凝胶颗凝胶颗粒外部粒外部更易被吸附。更易被吸附。v（4）即，色谱过程中除分子排阻作用外，凝）即，色谱过程中除分子排阻作用外，凝胶对胶对药品分子药品分子吸附作用吸附作用大于大于对对高分子杂质高分子杂质吸吸附作用。附作用。6/26/202430内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第30页有目标利用药品分子和凝胶间次级相互作用，有目标利用药品分子和凝胶间次级相互作用，使药品分子吸附于凝胶颗粒内表面，进而改使药品分子吸附于凝胶颗粒内表面，进而改进高分子杂质和药品分子之间分离度。进高分子杂质和药品分子之间分离度。v（5）在深入研究药品和葡聚糖凝胶相互作用）在深入研究药品和葡聚糖凝胶相互作用及流动相对该相互作用影响基础，经过调整及流动相对该相互作用影响基础，经过调整色谱过程中色谱过程中流动相组成、浓度、流动相组成、浓度、pH和流速和流速等等参数，调整药品分子和凝胶颗粒间相互作用，参数，调整药品分子和凝胶颗粒间相互作用，进而调整高分子杂质和药品分子间分离度。进而调整高分子杂质和药品分子间分离度。6/26/202431内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第31页凝胶色谱系统分离原理及特点凝胶色谱系统分离原理及特点v3.SephadexG-10凝胶色谱法分离凝胶色谱法分离-内酰胺内酰胺抗生素中高分子杂质概况：抗生素中高分子杂质概况：在在SephadexG-10凝胶色谱系统中，理论凝胶色谱系统中，理论上上-内酰胺抗生素三聚体以上高分子杂质均内酰胺抗生素三聚体以上高分子杂质均集中在集中在Kav=0色谱峰中；调整各种色谱条件，色谱峰中；调整各种色谱条件，既可使既可使-内酰胺抗生素寡聚物（如青霉素类内酰胺抗生素寡聚物（如青霉素类抗生素二聚物等）和其它高分子杂质分离，抗生素二聚物等）和其它高分子杂质分离，又可使其二者合二为一，所以可用于不一样又可使其二者合二为一，所以可用于不一样分析目标。分析目标。6/26/202432内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第32页高分子杂质分析方法高分子杂质分析方法v三、色谱条件对三、色谱条件对-内酰胺类抗生素在内酰胺类抗生素在SephadexG-10凝胶色谱系统中色谱行凝胶色谱系统中色谱行为影响为影响6/26/202433内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第33页色谱条件影响色谱条件影响v1.流动相离子强度对溶质保留行为影响：流动相离子强度对溶质保留行为影响：流动相离子强度和色谱行为即使并无直接流动相离子强度和色谱行为即使并无直接联络，但普通说来，当流动相中离子种类不联络，但普通说来，当流动相中离子种类不改变时，离子强度越大，改变时，离子强度越大，-内酰胺类抗生素内酰胺类抗生素Kav值越大。值越大。6/26/202434内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第34页v在被测物浓度较高时，流动相中应含有足量在被测物浓度较高时，流动相中应含有足量缓冲盐以改进色谱峰形和分离效果。缓冲盐以改进色谱峰形和分离效果。v有研究表明，在流动相中添加有研究表明，在流动相中添加中性盐中性盐如氯化如氯化钠或钠或增加增加缓冲液浓度后缓冲液浓度后，均使离子强度增加，均使离子强度增加，使使-内酰胺类抗生素中高分子杂质得到有效内酰胺类抗生素中高分子杂质得到有效分离。分离。6/26/202435内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第35页色谱条件影响色谱条件影响v2.流动相种类对溶质色谱行为影响：流动相种类对溶质色谱行为影响：惯用流动相有：柠檬酸缓冲液、硫酸铵缓惯用流动相有：柠檬酸缓冲液、硫酸铵缓冲液、磷酸缓冲液、醋酸缓冲液等。冲液、磷酸缓冲液、醋酸缓冲液等。改变流动相中缓冲液种类，能够改变溶质改变流动相中缓冲液种类，能够改变溶质色谱行为，对色谱行为，对-内酰胺类抗生素，表现为其内酰胺类抗生素，表现为其Kav值改变及色谱峰型改变。值改变及色谱峰型改变。6/26/202436内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第36页流动相流动相0.1mol/Lv头孢菌素Kav值头孢他啶头孢他啶头孢曲松头孢曲松头孢噻吩头孢噻吩柠檬酸缓冲液柠檬酸缓冲液0.452.522.06硫酸铵硫酸铵0.361.761.45磷酸缓冲液磷酸缓冲液0.311.361.42醋酸缓冲液醋酸缓冲液0.270.791.00碳酸盐缓冲液碳酸盐缓冲液0.210.550.88硝酸钠硝酸钠0.150.210.58流动相中缓冲液种类对头孢菌素色谱行为影响流动相中缓冲液种类对头孢菌素色谱行为影响6/26/202437内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第37页测定次数测定次数缓冲盐缓冲盐0.1mol/L理论板数理论板数拖尾因子拖尾因子1磷酸缓冲液磷酸缓冲液31911.43柠檬酸缓冲液柠檬酸缓冲液23852.542磷酸缓冲液磷酸缓冲液41211.43柠檬酸缓冲液柠檬酸缓冲液31202.40流动相对头孢他啶高分子杂质色谱行为影响流动相对头孢他啶高分子杂质色谱行为影响6/26/202438内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第38页v分析证实，影响这种改变决定原因是缓冲液分析证实，影响这种改变决定原因是缓冲液中中阴离子种类阴离子种类，阴离子所带负电荷越多，溶，阴离子所带负电荷越多，溶质质Kav值相对越大，色谱峰也越易拖尾。值相对越大，色谱峰也越易拖尾。6/26/202439内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第39页色谱条件影响色谱条件影响v3.流动相流动相pH影响影响对于弱酸，流动相对于弱酸，流动相pHpH值越小，组分值越小，组分k k值越大，值越大，当当pHpH值远远小于弱酸值远远小于弱酸pKapKa值时，弱酸主要以分值时，弱酸主要以分子形式存在；对弱碱，情况相反。子形式存在；对弱碱，情况相反。当流动相中有多元酸当流动相中有多元酸/盐存在时，盐存在时，pH经过影经过影响多元酸解离，改变缓冲液中阴离子类型，响多元酸解离，改变缓冲液中阴离子类型，来改变溶质保留时间。来改变溶质保留时间。6/26/202440内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第40页色谱条件影响色谱条件影响v4.洗脱速度影响洗脱速度影响流速越大，溶质保留值减小。反之，溶质流速越大，溶质保留值减小。反之，溶质保留值增大。保留值增大。这是因为流速较快时，溶质分子进入凝胶这是因为流速较快时，溶质分子进入凝胶颗粒内部概率减小，造成与葡聚糖凝胶相互颗粒内部概率减小，造成与葡聚糖凝胶相互作用机会降低之故。作用机会降低之故。6/26/202441内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第41页色谱条件影响色谱条件影响v5.溶质保留值和半峰宽关系溶质保留值和半峰宽关系-内酰胺抗生素在内酰胺抗生素在SephadexG-10凝胶色凝胶色谱系统中半峰宽与其保留时间均呈线性关系。谱系统中半峰宽与其保留时间均呈线性关系。也就是说，保留时间越大，半峰宽越大，峰也就是说，保留时间越大，半峰宽越大，峰型越难看。型越难看。6/26/202442内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第42页第三节第三节分子排阻色谱法分子排阻色谱法v中国药典版二部要求，中国药典版二部要求，分子排阻色谱法分子排阻色谱法是依是依据待测组分分子大小进行分离一个液相色谱据待测组分分子大小进行分离一个液相色谱技术，其分离原理即为凝胶色谱柱分子筛机技术，其分离原理即为凝胶色谱柱分子筛机制。制。-内酰胺类抗生素中高分子杂质测定采内酰胺类抗生素中高分子杂质测定采取分子排阻色谱法。取分子排阻色谱法。6/26/202443内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第43页本身对照外标法本身对照外标法v原理原理在在SephadexG-10凝胶色谱系统中，因凝胶色谱系统中，因为为SephadexG-10排阻分子量仅为排阻分子量仅为700道尔道尔顿，所以，除部分寡聚物外，顿，所以，除部分寡聚物外，-内酰胺抗生内酰胺抗生素中高分子杂质在色谱过程中均不保留；即素中高分子杂质在色谱过程中均不保留；即全部高分子杂质表现为单一色谱峰，其全部高分子杂质表现为单一色谱峰，其kav=0。6/26/202444内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第44页本身对照外标法本身对照外标法v在特定条件下，在特定条件下，-内酰胺抗生素因为分子间内酰胺抗生素因为分子间氢键、静电、疏水相互作用等次级相互作用，氢键、静电、疏水相互作用等次级相互作用，能够形成能够形成缔合物缔合物，造成其表观分子量增大。，造成其表观分子量增大。此时，在此时，在SephadexG-10凝胶色谱系统中和凝胶色谱系统中和高分子杂质含有相同色谱行为，即在高分子杂质含有相同色谱行为，即在kav=0处表现为单一色谱峰。处表现为单一色谱峰。6/26/202445内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第45页本身对照外标法本身对照外标法v测定方法测定方法利用以上所述原理，在利用以上所述原理，在SephadexG-10凝胶凝胶色谱系统中，以药品本身为对照品，测定其色谱系统中，以药品本身为对照品，测定其在特定条件下在特定条件下缔合时峰缔合时峰响应指标；再改变色响应指标；再改变色谱条件，测定样品高分子杂质和药品分离后，谱条件，测定样品高分子杂质和药品分离后，kav=0处处高分子杂质峰高分子杂质峰响应指标；按外标法响应指标；按外标法计算，既得药品中高分子杂质相当于药品本计算，既得药品中高分子杂质相当于药品本身相对含量。身相对含量。流动相流动相B：水：水流动相流动相A：磷酸盐缓冲液：磷酸盐缓冲液6/26/202446内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第46页v为何采取本身对照外标法？为何采取本身对照外标法？定量分析法理论基础：经过检测器物质量定量分析法理论基础：经过检测器物质量与检测器响应信号成正比，其检测器响应能与检测器响应信号成正比，其检测器响应能够是面积或峰高。够是面积或峰高。含含量量响响应应值值(A或或H)定量方法：定量方法：外标法外标法内标法内标法峰面积归一法峰面积归一法主成份对照法主成份对照法6/26/202447内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第47页v 1.外标法外标法以以待测物质对照品待测物质对照品为参考物，依据供试品为参考物，依据供试品量和对照品量以及对应响应信号进行定量方量和对照品量以及对应响应信号进行定量方法。法。高聚物对照品较难制备，即使制备高聚物高聚物对照品较难制备，即使制备高聚物对照品因为不稳定也较难保留，而且不一样对照品因为不稳定也较难保留，而且不一样批制备对照品极难同质。批制备对照品极难同质。-内酰胺抗生素高分子杂质含有高度不均内酰胺抗生素高分子杂质含有高度不均一性和不确定性。一性和不确定性。6/26/202448内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第48页v2.归一化法归一化法将测得色谱图上，将测得色谱图上，全部色谱峰全部色谱峰面积求和，面积求和，与每个色谱峰面积相比较，即得每个色谱峰与每个色谱峰面积相比较，即得每个色谱峰百分比，把全部色谱峰百分比相加即得百分比，把全部色谱峰百分比相加即得100%，称为峰面积归一化。，称为峰面积归一化。对于高分子杂质来说，其含量和药品本身对于高分子杂质来说，其含量和药品本身含量相差甚远，测量误差较大。含量相差甚远，测量误差较大。6/26/202449内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第49页高分子高分子杂质杂质样品主峰样品主峰6/26/202450内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第50页v3.内标法内标法内标法是结合了峰面积归一法和外标法内标法是结合了峰面积归一法和外标法优点一个方法，它在加入内标后，按峰面积优点一个方法，它在加入内标后，按峰面积归一法分析方法进行分析，这就防止了因为归一法分析方法进行分析，这就防止了因为进样一致性及样品歧视效应造成偶然误差，进样一致性及样品歧视效应造成偶然误差，因而，它分析精密度也是比较高，是气相色因而，它分析精密度也是比较高，是气相色谱一个比较理想定量分析方法。谱一个比较理想定量分析方法。6/26/202451内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第51页v4.主成份对照法主成份对照法因为因为SephadexG-10凝胶色谱分离系凝胶色谱分离系统柱效较低，进样微量药品极难表现出众统柱效较低，进样微量药品极难表现出众谱峰。谱峰。6/26/202452内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第52页基本分析方法基本分析方法6/26/202453内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第53页仪仪器器v1.恒流泵恒流泵1）转速转速范围：）转速转速范围：0.1-120rpm,正反转可逆正反转可逆2）调速方式：无级调速配）调速方式：无级调速配以线性数码旋钮连续可调以线性数码旋钮连续可调3）速度分辩率：）速度分辩率：30rpm以以下为下为0.1rpm，30rpm以上以上为为1rpmv硅胶管硅胶管1）粗细适当）粗细适当2）壁厚）壁厚1.5mm3）耐磨）耐磨6/26/202454内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第54页仪仪器器v2.玻璃层析柱玻璃层析柱合理选择层析柱长度和直合理选择层析柱长度和直径，是确保分离效果主要径，是确保分离效果主要步骤，理想层析柱直径与步骤，理想层析柱直径与长度之比普通为长度之比普通为1：251：100.6/26/202455内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第55页仪仪器器v3.检测器检测器-内酰胺抗生素通常都内酰胺抗生素通常都有较显著紫外吸收特征，有较显著紫外吸收特征，所以测定中普通选择紫所以测定中普通选择紫外检测器，通惯用到检外检测器，通惯用到检测波长是测波长是254nm。6/26/202456内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第56页仪仪器器v3.数据处理系统数据处理系统积分仪积分仪n选择性统计选择性统计,n进行积分处进行积分处理和定量计理和定量计算算色谱工作站色谱工作站u色谱控制色谱控制数据采集数据采集统计统计计算计算分析分析图谱保留图谱保留试验结果试验结果编排编排打印于一体打印于一体6/26/202457内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第57页v系统适用性试验系统适用性试验1.以蓝色葡聚糖保留时间来表示高分子杂质以蓝色葡聚糖保留时间来表示高分子杂质保留特征，考查对照品色谱峰及高分子杂质保留特征，考查对照品色谱峰及高分子杂质色谱峰与蓝色葡聚糖溶液色谱峰保留时间比色谱峰与蓝色葡聚糖溶液色谱峰保留时间比值均应不超出某一程度。值均应不超出某一程度。中国药典要求是中国药典要求是0.931.07。对照品峰和供试品溶液聚合物峰与对应色对照品峰和供试品溶液聚合物峰与对应色谱中蓝色葡聚糖峰保留时间比值也是谱中蓝色葡聚糖峰保留时间比值也是0.931.07。6/26/202458内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第58页流动相流动相A：磷酸盐缓冲液：磷酸盐缓冲液流动相流动相B：水：水5.3495.1866/26/202459内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第59页v2.理论板数理论板数在两种流动相系统中，按蓝色葡聚糖峰在两种流动相系统中，按蓝色葡聚糖峰计算，理论板数均计算，理论板数均大于大于700。6/26/202460内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第60页v3.拖尾因子拖尾因子在两种流动相系统在两种流动相系统中，按蓝色葡聚糖峰中，按蓝色葡聚糖峰计算，拖尾因子均计算，拖尾因子均小小于于2.0。6/26/202461内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第61页4.重复性重复性RSD考查对照品在流动相考查对照品在流动相B系统中重复进样系统中重复进样后峰面积相对标准偏差应符合要求。后峰面积相对标准偏差应符合要求。6/26/202462内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第62页v流动相流动相B：水：水测定对照品，在测定对照品，在Kav=0处表现为单一色处表现为单一色谱峰，以药品本身为对照品，测定这一条谱峰，以药品本身为对照品，测定这一条件下缔合时峰响应指标。件下缔合时峰响应指标。5.305测定过程测定过程6/26/202463内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第63页v流动相流动相A：磷酸盐缓冲液：磷酸盐缓冲液测定供试品，测定样品中高分子杂质和药测定供试品，测定样品中高分子杂质和药品分离后，品分离后，Kav=0处高分子杂质峰响应指标。处高分子杂质峰响应指标。5.3456/26/202464内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第64页影响准确测定若干原因影响准确测定若干原因v1.峰响应值选择峰响应值选择v2.检测器类型及其线性范围检测器类型及其线性范围v3.进样量影响进样量影响v4.对照品异质性影响对照品异质性影响6/26/202465内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第65页分离度分离度v定义：分离度是指高分子聚合物与药品单体定义：分离度是指高分子聚合物与药品单体之间分离程度（或分离能力）。之间分离程度（或分离能力）。Hp Hp 次高峰到基线高。次高峰到基线高。HvHv 次高峰与最大峰曲线次高峰与最大峰曲线分离最低点到基线高。分离最低点到基线高。6/26/202466内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第66页分离度影响原因分离度影响原因v1.凝胶对药品吸附作用强弱与结构相关凝胶对药品吸附作用强弱与结构相关v2.与洗脱剂组成相关与洗脱剂组成相关v3.与流动相离子强度相关与流动相离子强度相关v4.与流动相与流动相pH相关相关v5.与流动相流速相关与流动相流速相关6/26/202467内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第67页第四节第四节SephadexG-10凝胶色谱系凝胶色谱系统相关试验技术统相关试验技术v1.凝胶预处理凝胶预处理凝胶：凝胶：溶胶溶胶或或溶液溶液中中胶体胶体粒子或粒子或高分子高分子在一定在一定条件下相互连接，形成空间网状结构，结构空隙中条件下相互连接，形成空间网状结构，结构空隙中充满了作为分散介质充满了作为分散介质液体液体（在干凝胶中也能够是（在干凝胶中也能够是气气体体），这么一个特殊），这么一个特殊分散体系分散体系称作凝胶。没有称作凝胶。没有流动流动性性。内部常含有大量液体。葡聚糖凝胶属于。内部常含有大量液体。葡聚糖凝胶属于弹性凝弹性凝胶胶弹性凝胶失去分散介质后，体积显著缩小，而当弹性凝胶失去分散介质后，体积显著缩小，而当重新吸收分散介质时，体积又重新重新吸收分散介质时，体积又重新膨胀膨胀。6/26/202468内酰胺类抗生素高分子杂质测定法第68页v凝胶粒度选择：凝胶粒度选择：普通来说，细颗粒分离效果好，但流速普通来说，细颗粒分离效果好，但流速慢；而粗颗粒流速快，但会使区带扩散，使慢；而粗颗粒流速快，但会使区带扩散，使洗脱峰变平而宽。所以，如用细颗粒凝胶宜洗脱峰变平而宽。所以，如用细颗粒凝胶宜用大直径层析柱，用粗颗粒时用小直径层析用大直径层析柱，用粗颗粒时用小直径层析柱。在实际操作中，要依据工作需要，选择柱。在实际操作中，要依据工作需要，选择适当颗粒大小