淀粉酶米氏常数测定.pptx

一、一、实验目的实验目的 l了解并掌握米氏常数的意义和测定方法二、二、实验原理实验原理 酶促反应v-S曲线推导出米氏方程为：米氏常数Km是酶的一个基本特征常数，它包含着酶与底物结合和解离的性质。特别是同一种酶能够作用于几种不同底物时，米氏常数Km往往可以反映出酶与各种底物的亲和力的强弱。测定Km和Vm，可通过作图法求得。最常用的Lineweaver-Burk双倒数作图法。这个方法是将米氏方程转化为倒数形式，即：以1/v对1/S作图，可得一条直线，所得直线的截距是1/Vm，斜率为Km/Vm。通过Lineweaver-Burk作图法作图后可方便的求出Km值。l试管l移液抢l秒表l吸耳球l恒温水浴锅l7200型分光光度计。三三 仪器和试剂仪器和试剂三三 仪器和试剂仪器和试剂试剂试剂 （1）酶液：精确称取酶制剂0.1g(以大约2000 Ug计)，先用少量40蒸馏水溶解、浸提。将上层液小心倾入500ml容量瓶内，沉淀再加水捣研。如此重复，最后全部移入容量瓶中，定容后摇匀，用四层纱布过滤，滤液供测试定用（2）原碘液 称取碘11 g，碘化钾(KI)22 g，先用少量蒸馏水使碘-碘化钾完全溶解，定容至500 mL，贮于棕色瓶内。（3）稀碘液 取原碘液2mL，加碘化钾20 g，用蒸馏水定容至500 mL贮于棕色瓶内。（4）4可溶性淀粉 精确称取可溶性淀粉4.000g（精确至0.001g），用少量蒸馏水调匀。边搅拌边加入煮水70mL，加热煮沸至透明，冷却后定容至100 mL,此溶液现配现用。（5）0.02mLpH6.0磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液 称取磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O)4523g和柠檬酸(C6H8O7H2O)8.07g，用蒸馏水溶解，用酸度计或pH试纸校正pH，定容至1000 mI。（6）0.2moL/L HCl 取36%盐酸（饱和浓盐酸）0.86ml加入已加有少量蒸馏水的50ml容量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀即可。四、实验操作四、实验操作 1.1.淀粉浓度梯度吸光度淀粉浓度梯度吸光度 不同底物浓度（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）的可溶性淀粉4ml，加入缓冲液0.75ml和蒸馏水0.25ml，充分摇匀，60放置10min，立即加入3.0ml的0.2moL/L HCl终止反应，然后立即取出1.00ml溶液置于5.00ml稀碘液摇匀，显色，并以稀碘液作对照，于660nm处测定吸光度（按操作表1操作）瓶号试剂1234564%可溶性淀粉（ml）0.511.522.53H2O(ml)3.532.521.51缓冲液(ml)0.750.750.750.750.750.75蒸馏水(ml)0.250.250.250.250.250.25充分摇匀，60放置10min加入3.0ml的0.2moL/L HCl，摇匀取出1.0ml溶液置于5.00ml稀碘液显色A660 不同底物(可溶性淀粉)浓度（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）可溶性淀粉4mL，缓冲液0.75mL，摇匀后，在60水浴中平衡5 min，加入0.25 mL稀释好的酶液，立即记时，充分摇匀，准确反应10 min，立即加入3.0ml的0.2moL/L HCl终止反应，然后立即取出1.00ml溶液置于5.00ml稀碘液显色，摇匀，并以稀碘液作对照，于660nm处测定吸光度（按操作表2操作）。2.Km测定测定 瓶号试剂1234564%可溶性淀粉（ml）0.511.522.53H2O(ml)3.532.521.51缓冲液(ml)0.750.750.750.750.750.7560放置，预热5min酶液(ml)0.250.250.250.250.250.25充分摇匀，60放置10min取出，加入3.0ml的0.2moL/L HCl取出1.0ml溶液置于5.00ml稀碘液，显色A660可溶性淀粉量浓度%0.51.01.52.02.53.0s1/sv1/v 酶的反应速度V：以单位时间内吸光度的减少量d(A0-A1)dt来表示 以1/v 对1/S双倒数法作图 计算Km值。3.数据处理与作图数据处理与作图五、实验注意事项 l取液量一定要准确。l反应时间一定要精确。l加酶前后一定要将试剂混匀。l分光光度计的正确使用。l取液器的使用 六、思考题(1)试说明米氏常数Km的物理意义和生物学意义。(2)为什么说米氏常数Km是酶的一个特征常数而Vm则不是？