黄芩苷对SARS-COV-2侵袭的抑制作用研究.pdf

基金项目:山东省自然科学基金重点项目(.)山东省食品药品检验研究院院级课题(.)作者简介:耿雪女博士生副主任药师研究方向:中药药理学:.通信作者:祝清芬男博士主任药师硕士生导师研究方向:药理学:.黄芩苷对 侵袭的抑制作用研究耿雪王雪周倩苏昕宇李水仙祝清芬(.山东省食品药品检验研究院国家药品监督管理局胶类产品质量评价重点实验室中药标准创新与质量评价工程实验室山东 济南.山东中医药大学山东 济南.山东省中医药研究院山东 济南)摘要:目的 在体外研究黄芩苷对新型冠状病毒()入侵细胞过程的抑制作用 方法利用构建有荧光素酶报告基因的 蛋白假病毒系统通过荧光素酶试剂盒检测加入黄芩苷和假病毒后 细胞中的荧光素表达变化进而绘制病毒抑制曲线 结果 黄芩苷能显著抑制 细胞的病毒感染率黄芩苷和病毒提前共孵育组与直接加入组在不同浓度下的病毒抑制曲线并无显著差别表明黄芩苷并不能与病毒直接结合而是通过作用于病毒 蛋白介导的细胞融合过程产生抑制作用黄芩苷在.浓度时对病毒的抑制率在 组显著降低在 和 组并无显著差别表明黄芩苷可能在病毒入侵细胞(非吸附)阶段产生抑制作用且介导的入侵抑制阶段发生在 内 结论 黄芩苷可能通过介导抑制 病毒 蛋白与细胞表面受体的融合过程在非吸附阶段抑制病毒的入侵发挥抗新冠病毒活性关键词:黄芩苷新型冠状病毒荧光素酶检测 蛋白中图分类号:.文献标志码:文章编号:():./.(.):.:药学研究 .年 月一种全新的传染性呼吸道疾病被报道该疾病于 年 月被世界卫生组织()命 名 为“()”导致该疾病的致病病原体已成功鉴定为 感染进入宿主细胞后在宿主细胞的帮助下 其遗传物质 的/首先翻译表达出两条多聚蛋白前体(和)多 聚 蛋 白 前 体 在 主 蛋 白 酶()和 木 瓜 样 蛋 白 酶()的作用下发生分子内的切割产生多个非结构蛋白从而发生病毒的复制 整个过程任何一个阶段关键酶或关键蛋白缺失病毒都不能进行连续的复制这为病毒抑制提供了多个作用靶点依据这些靶点设计的病毒抑制剂或药物成为治疗新冠的重要手段目前新冠病毒的药物靶点包括结构蛋白(蛋白、蛋白、蛋白、蛋白)、主要蛋白酶、木瓜蛋白酶样蛋白酶和 聚合酶黄芩苷为唇形科植物黄芩干燥根的主要成分具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、防治糖尿病及其并发症等药理作用可通过直接杀灭病毒、抑制病毒复制、调控宿主细胞功能蛋白表达等多种机制来有效防治病毒对流感病毒、肝炎病毒、柯萨奇病毒、呼吸道合胞病毒等多种病毒具有显著作用 对于黄芩苷抗新冠病毒方面也有一些研究成果 最近研究发现黄芩素可通过一系列的直接和间接氢键与 残基/结合固定游离的氧阴离子环结构防止肽底物接近活性位点进而抑制病毒的复制发挥抗病毒作用 通过分子对接技术进行靶点药物筛选发现黄芩苷和溴隐亭可分别结合新冠病毒非结构蛋白()蛋白同源性模型的 末端和 末端活性位点可进入新冠病毒 末端和 末端活性结构域此外黄芩苷可能作为新冠病毒木瓜蛋白酶样蛋白酶的抑制剂发挥抗病毒作用 以上研究聚焦在病毒入胞后的复制阶段在病毒吸附阶段是否发挥作用还没有相关研究 为解决这一问题本研究采用了体外试验假病毒体系探索了黄芩苷对 病毒吸附融合抑制作用预测了黄芩苷可能的新的作用靶点蛋白为更深入研究黄芩苷抗新冠病毒机制提供依据 材料与仪器.细胞株 细胞系购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库.病 毒 株 假 病 毒(批 号:)病毒滴度为.购自北京天坛药物生物技术开发公司.试剂与仪器荧光素酶报告基因检测试剂盒(批号:公司)胎牛血清(批号:)、高糖培养基(批号:)、胰蛋白酶(批号:)、(批号:/)均购自 公司(批号:公司)(批号:公司)黄芩苷标准品(批号:中国食品药品检定研究院)(批号:公司)转染试剂(批号:公司)裂解液(批号:上海碧云天生物技术股份有限公司)聚偏二氟乙烯()膜(批号:公司)超敏底物化学发光检测试剂盒(批号:公司)抗 体(批 号:公司)方法.病毒抑制试验基本步骤如下:用 完全培养基将假病毒稀释至.取出培养箱中事先准备好的 细胞(汇合率达)吸弃瓶中的培养基加入 缓冲液清洗细胞倾去 后加入 .胰酶 消化 倾去胰酶用 完全培养基重悬细胞细胞计数用 完全培养基将细胞稀释至 向 孔板中每孔加 细胞使每孔细胞为 个 受试物组和阳性对照组每孔加 假病毒稀释液和 的受试物或完全培养基溶液阴性对照组则只加 完全培养基将 孔板前后左右轻轻晃动使细胞在孔中分散均匀将 孔板放入细胞培养箱中 培养 以上每组均设 个重复从细胞培养箱中取出 孔板用多道移液器从每个上样孔中吸弃 上清然后加入 荧光素酶检测试剂室温避光反应 反应结束后用多道移液器将反应孔中的液体反复吹吸 次使细胞充分裂解从每孔中吸出 液体加于对应 孔化学发光检测板中置于化学发光检测仪中读取发光值并计算中和抑制率:抑制率(受试物组的发光强度均值空白对照组药学研究 .均值)/(阴性组的发光强度均值空白对照组均值).不同浓度黄芩苷病毒抑制试验配制不同浓度的黄芩苷标准品假病毒混合稀释液(/)孵育 后取 加入新的 孔板中同时加入 细胞悬液使每孔黄芩苷终 浓 度 为.、.、.、.、.、.每孔病毒数 每孔细胞 个 按照基本步骤进行后续试验.前孵育组和共孵育对比试验依据细胞存活率试验结果除阴性对照和阳性对照组外设置两组受试物组一组将 不同浓度的黄芩苷溶液加 .滴度的假病毒溶液孵育 后再加入 细胞悬液另一组在 细胞悬液中同时加入 不同浓度黄芩苷和 假病毒溶液 黄芩苷在整个溶液体系终浓 度 为.、.、.、.、.、.按照基本步骤进行后续试验.不同时间点试验 除阴性对照组外每孔加入 假病毒稀释液和 细胞培养液随后放入细胞培养箱中继续培养分别在、加入 .黄芩苷溶液按照基本步骤进行后续试验.细胞毒性试验孵育前步骤同“.”项下孵育结束前 每孔加入 的 溶液 培养 培养结束后吸弃培养基 洗涤两遍加入 震荡溶解后用酶标仪检测检测波长为 .细胞培养和转染 细胞按照产品说明书使用 转染.的 表达质粒或 空白质粒.蛋白印迹分析转染 后收集细胞用 缓冲液裂解蛋白用聚丙烯酰胺凝胶电泳()分离并转移到 膜上 封闭然后用 或 一抗 孵育过夜用 洗膜 次然后与对应的二抗在室温孵育 用 洗膜 次 超敏发光液孵育 成像仪拍照.统计学处理 实验数据采用 .软件进行多因素方差分析 .表示差异有统计学意义 结果.黄芩苷是 假病毒的有效抑制剂 聂军等证实 细胞是此种 假病毒体系感染的最佳细胞底物能产生最高的信号因此本研究通过优化 中和抗体检测步骤采用 细胞系进行进一步研究首先对黄芩苷的细胞毒性进行研究将、.、.、.、.、.黄芩苷溶液与培养基对照溶液在 孔板中 等体积(各 )混合孵育 后在 孔板中加入 制备的 细胞悬液继续培养 后检测 以受试物浓度(终体系浓度)取对数作为 轴以细胞存活率作为 轴利用 软件进行非线性回归(曲线拟合)计算得到.(见图)图 不同浓度黄芩苷对 细胞存活率的影响()按“.”项下方法将.滴度的 假病毒溶液或培养基对照溶液分别与 浓 度 为、.、.、.、.、.黄芩苷溶液在 孔板中 等体积(各)混合孵育 后在 孔板中加入 制备的 细胞悬液继续培养 后检测 如图 所示多浓度黄芩苷对 细胞中的 伪病毒表现出显著的抑制作用以受试物浓度(终体系浓度)取对数作为 轴以病毒抑制率作为 轴利用 软件进行非线性回归(曲线拟合)计算得到 .(见图)综合以上结果可知黄芩苷在低细胞毒性的浓度下仍能产生显著的抑制作用图 不同浓度的黄芩苷对 细胞病毒抑制作用().黄芩苷对 病毒细胞侵入阶段药学研究 .的抑制作用 进一步测试了黄芩苷在吸附和侵入阶段对 假病毒体系的抑制活性 选择.、.、.、.、.、.为黄芩苷溶液终体系浓度 设置一组()提前孵育黄芩苷和假病毒溶液 后对 细胞进行感染另一组()同时加入同浓度黄芩苷和假病毒溶液对 细胞进行感染 在不同浓度下观察黄芩苷对假病毒感染的抑制作用 结果显示两组的感染率曲线并无显著差别(见图)表明黄芩苷并不能与病毒直接结合而是通过介导病毒 蛋白与细胞表面的受体结合产生抑制作用图 前孵育组合共孵育组 细胞病毒抑制率曲线从 组开始计时在感染 假病毒后不同时间向不同组别 细胞培养液中加入 .黄芩苷溶液孵育至 发现 组病毒抑制率明显降低 组和 组无明显差异(见图)说明黄芩苷可能抑制病毒侵入细胞(非吸附)且在 内发生介导进入抑制期图 不同时间点黄芩苷 细胞病毒抑制率曲线()注:与 对照组比较 .对黄芩苷抗 病毒作用的影响 由于 侵袭细胞的第一步是将病毒与细胞表面受体(如气道上皮血管紧张素转换酶)结合为了探讨 对黄芩苷发挥抗病毒作用的影响本研究通过转染 慢病毒质粒诱导 细胞中 过表达 如图 所示与空白质粒()对照组相比高表达()组 蛋白表达水平成功上调 如图 所示与“.”项下结果相比 表达增加可以明显减弱黄芩苷对 的抑制作用以受试物浓度取对数作为轴以病毒抑制率作为 轴利用 软件进行非线性回归(曲线拟合)计算得到抑制率.远大于“.”项下中得到的(.)实验结果表明 蛋白表达水平增加可显著增加病毒感染率表现为病毒抑制率为负减弱黄芩苷(尤其是低浓度时)的抗病毒作用图 的蛋白表达图 不同浓度黄芩苷对 高表达细胞病毒抑制率曲线()讨论 主要通过细胞表面的膜融合或者内吞后的膜融合作用进入细胞膜融合则由囊膜表面的 蛋白与细胞表面的受体相互作用完成 目前冠状病毒的部分细胞受体已经得到确定如氨基肽酶()、血管紧张素转化酶()、丝氨酸蛋白酶()等其中人血管紧张素转化酶()是目前 最早被确证且亲和力高的细胞表面受体研究证实 的结合力是 病毒的 倍药学研究 .最近有研究者经过分子对接发现黄芩苷可能与 有很强的结合力 本研究试验结果显示黄芩苷能明显抑制假病毒系统的细胞侵袭力这种抑制可是由于其与细胞表面受体间的相互作用产生的而不是来源于黄芩苷与病毒表面 蛋白的直接聚合 此外通过体外试验证实病毒抑制率在感染 时加入黄芩苷时无差异变化在 、随着病毒细胞共孵育时间延长而降低说明本试验中发现的黄芩苷抗病毒作用发挥在感染早期 由此我们大胆推测本研究发现的黄芩苷对假病毒体系入侵过程的抑制作用可能是由于黄芩苷对于 蛋白与 结合过程的影响所导致的 本研究提供了一个初步的探讨具体机制还需要进一步研究参考文献:.():.:.()():.():.():.():.():.():.():.().():.():.():.():.():.(收稿日期:)(上接第 页)黄丽平许远航邓敏贞等.茵陈的化学成分、药理作用机制与临床应用研究进展.天然产物研究与开发():.():.何元松李焐仪孟保华.大黄的研究现状.成都大学学报(自然科学版)():.王浩泽卢慧颖张彦哲等.大黄素对肝脏疾病的防治作用与安全性研究进展.中国药学杂志():.秦春明.网络药理的大黄素及其类似物抗肿瘤分子机制研究.中国药物经济学():.浦飞飞陈凤霞夏平.白花蛇舌草抗肿瘤化学成分和作用机制的研究进展.癌症进展():.孙超吴铭杰江泽群等.白花蛇舌草有效成分 羟基甲基蒽醌通过/信号通路诱导肝癌细胞凋亡作用机制.中华中医药杂志():.粟星.基于系统药理学揭示白花蛇舌草治疗非小细胞肺癌的作用机制研究.石河子:石河子大学.李静.基于 通路莪术三棱配伍抗肝癌的作用机制研究.哈尔滨:哈尔滨商业大学.哈文韬赵孙燕魏晓为等.白术水提物通过 通路抑制胃癌 细胞的潜在机制.中国肿瘤生物治疗杂志():.(收稿日期:)药学研究 .