北虫草多糖诱导巨噬细胞极化的机制研究.pdf

DOI：10.13876/J.cnki.ydnse.230109第 43 卷 第 1 期2024 年 3 月延安大学学报（自然科学版）Journal of Yanan University（Natural Science Edition)Vol.43 No.1Mar.2024北虫草多糖诱导巨噬细胞极化的机制研究贺妍1，4，戴阿利1，3，王怡1，刘萱1，冯馨妍1，贺晓龙1，2，刘广平1，4*，张向前1，2*（1.延安大学 生命科学学院；2.陕西省黄土高原菌产业生态循环发展工程技术研究中心；3.延安职业技术学院 医学系；4.陕西省红枣重点实验室，陕西 延安 716000）摘要：为了检测北虫草多糖对巨噬细胞极化状态的影响，研究采用外源北虫草多糖刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7后，检测巨噬细胞极化状态的变化，探究北虫草多糖诱导巨噬细胞极化的分子机制。结果表明，北虫草多糖刺激可以促进培养巨噬细胞的M1型极化，且极化过程活化了参与炎症免疫应答的NF-B通路，这一结果初步揭示了北虫草多糖诱导巨噬细胞极化的机制，为进一步深入理解北虫草多糖调控机体免疫力提供理论依据。关键词：北虫草；多糖；巨噬细胞极化；机制中图分类号：Q291 文献标识码：A 文章编号：1004-602X（2024）01-0008-05北虫草（Cordyceps militaris），又称北冬虫夏草、蛹虫草，隶属于子囊菌门虫草属，具有重要的药用价值和营养价值，是我国一种传统食药用真菌1。北虫草主要活性成分是虫草素和北虫草多糖（Cordyceps militaris polysaccharides，CMP），北虫草多糖属于杂多糖，在机体抗炎、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤和降血脂方面有显著作用2。巨噬细胞是一种重要的免疫细胞，遍布于机体各种组织中，能够分泌多种细胞因子3。在不同微环境和不同的因子作用下，它可以极化成为不同类型的巨噬细胞，从而参与机体的炎症反应和组织的损伤修复过程4。通过经典活化途径，巨噬细胞可以极化为M1型巨噬细胞，此途径的极化信号主要为 LPS、IFN-和 TNF。M1 型巨噬细胞具有较强的吞噬能力，并且能够通过产生ROS和RNS来清除病原菌，此外它还通过表达高水平炎症因子TNF、IL-1、IL-6和IL-12等，而诱导Th1型免疫反应5-6。通过替代型活化途径，巨噬细胞能极化为M2型巨噬细胞，此途径的极化信号主要有IL-4/IL-3、IL-10和TGF-7。M2型巨噬细胞能够表达甘露糖受体（MR）和Fizzl等分子，诱导Th2型免疫反应8。巨噬细胞M1和M2型的极化机制较为复杂，涉及到多种信号及其通路的调控，包括氨基末端蛋白激 酶（JNK）、磷 酸 肌 醇-3-激 酶（PI3K）和 TLR4（Toll-like receptor 4）/NF-B（nuclear factor-kappa B）信号通路等9-10。其中TLR4通过激活NF-B促使其与细胞核内特定DNA序列结合，从而诱导相关基因的表达，促使巨噬细胞向M1型极化11。研究表明北虫草多糖能够通过抑制肿瘤相关巨噬细胞和T淋巴细胞之间的pd-L1/pd-1轴，将巨噬细胞诱导为M1型，激活T淋巴细胞而抑制肿瘤生长12。北虫草能有效提升巨噬细胞的吞噬能力、促进抗体形成，从而调节免疫，可能与其通过激活巨噬细胞的MAPK和NF-B信号通路，并且促进NO和TNF等物质的分泌，从而上调巨噬细胞的含量有关系13。本研究初步探讨北虫草多糖刺激巨噬细胞极化的机制，以便为理解北虫草多糖调控机体免疫力收稿日期：2023-11-15基金项目：陕西省科技创新团队项目（2023-CX-TD40）；陕西省重点研发计划项目（2022NY-139；2023YBNY-277）；国家级大学生创新创业训练计划项目（202310719059）；延安大学博士科研启动基金项目（YDBK2018-57）作者简介：贺妍（1999），女，陕西西安人，延安大学硕士研究生。*通信作者第 1 期贺妍 等：北虫草多糖诱导巨噬细胞极化的机制研究提供理论依据。1材料与方法1.1实验材料小鼠巨噬细胞RAW264.7（本实验室冻存）。北虫草多糖标准品（CMP，北京索莱宝）；DMEM高糖培养基（Gibco）；FBS胎牛血清（ExCell Bio）；羊抗鼠p65多克隆抗体和羊抗鼠Lamin B1多克隆抗体（Abcam）；羊抗鼠 IB 多克隆抗体和羊抗鼠 Actin多克隆抗体（Abclonal）；CCK8试剂盒（西安奥锐精创）；TNF和IL-12 ELISA试剂盒（联科生物）；细胞核蛋白和细胞浆蛋白抽提试剂盒（碧云天）。1.2实验方法1.2.1影响巨噬细胞极化的CMP浓度优化准确称取20 mg CMP标准品，溶于400 L PBS中，得到浓度为50 mgmL-1的CMP溶液，将其倍比稀释7个浓度梯度，依次为25、12.5、6.23、3.13、1.57、0.78 和 0.39 mgmL-1。将小鼠巨噬细胞 RAW264.7以6 000个/孔的密度接种于96孔板，每孔加入100 L含10%FBS的DMEM培养液，置5%CO2、37 培养箱中培养24 h。弃去96孔板中原培养液，向孔板中加入100 L含10%FBS的新鲜DMEM培养液，再依次加入浓度梯度的CMP，每个浓度设3个重复，同时设置不加多糖空对照，培养液对照，继续培养24 h。向所有培养孔中加入10 L CCK8试剂，3.5 h后酶标仪检测OD450，依据CCK8试剂盒说明计算细胞的存活率。1.2.2CMP诱导巨噬细胞极化状态鉴定将巨噬细胞接种于 6 cm 培养皿中，置于含有5%CO2的培养箱中，37 培养24 h。弃去6 cm培养皿中的原培养液，重新向培养皿中加入含10%FBS的新鲜DMEM培养液，再加入1.2.1筛选到的最佳浓度 CMP，同时设置不加多糖的空对照和 LPS+INF诱导的阳性对照，置含 5%CO2的饱和湿度培养箱中，37 继续培养24 h。收集6 cm皿中的培养液，-20 冻存备用。PBS清洗细胞2次，提取空对照、CMP处理组和阳性对照组细胞的总RNA，反转为cDNA，RT-qPCR检测TNF（F：CCCTCACACTCAGATCATCTTCT，R：GCTACGACGTGGGVTAVAG）、IL-6（F：TAGTCCTTCVTACCCCAATTTCC，R：TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC）、iNOS（F：CTCACCTACTTCCTGGACTTAC，R：CAATCTVTGCCTATCCGTCTC）、IL-12（F：CCCATTCCTACTTCTCCCTCAA，R：CCTCCTCTGTCTCCTTCATCTT）、MR（F：GACGCTCTAAGTGCCATCTC，R：ATAACTCTGTGCCCTTGATTCC）、FIZZL（F：TCGTGGAGAATAAGGTCAAGGAA，R：CGAGTAAGCACAGGCAGTTG）和GAPDH（F：GGTGGTCTCCTCTGACTTCAA，R：GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT）的表达。1.2.3CMP诱导巨噬细胞分泌细胞因子的鉴定使用THF和IL-12 ELISA试剂盒，参照操作手册检测培养液中的细胞因子含量。检测前将所有的试剂、样本平衡至室温。检测读数时用酶标仪检测OD450和OD570的值，依据标准曲线计算样本的含量。1.2.4CMP诱导巨噬细胞极化相关通路的鉴定WB检测NF-B通路改变。分别提取RAW264.7细胞加入CMP后的细胞核蛋白和细胞浆蛋白，蛋白定量后进行SDS-PAGE胶电泳，转膜进行免疫印迹。2结果与分析2.1最佳CMP浓度确定不同浓度 CMP 影响巨噬细胞 RAW264.7 活性的结果见图1。随着CMP的浓度逐渐升高，其对细胞活性的促进作用发生了由低升高，再由高降低的变化过程。加入的多糖浓度由0.39 mgmL-1递增到3.13 mgmL-1时，细胞活性由（104.63.0）%升高到（155.35.8）%，随着多糖浓度由3.13 mgmL-1上升到50 mgmL-1，其对巨噬细胞的促进活性由（155.35.8）%回落到（97.46.4）%。在所设置的8个浓度梯度中，3.13 mgmL-1对细胞的促进活性最高，因此，后续所有实验选用3.13 mgmL-1的作为刺激细胞的最佳浓度。2.2CMP诱导RAW264.7细胞产生M1型形态变化正常情况下未极化的巨噬细胞呈圆球状，内容物均匀，M1型的极化巨噬细胞胞体细长，向外突出形成分支的触角。光学显微镜下，未刺激前的细胞图1不同浓度CMP对RAW264.7细胞活力的影响注：*表示P0.05差异显著；*表示P0.01差异极显著；无*表示无显著。9延安大学学报（自然科学版）第 43 卷 呈球状分散，内容物均匀；LPS+IFN刺激24 h后的细胞失去了球状外形，伸出细长的触角，呈现出典型的 M1 型细胞特点；使用 3.13 mg mL-1CMP 刺激24 h后，细胞形态发生变化，不再保持球形，变为多角形，并生长细长的触角，类似于LPS+IFN刺激的结果，呈现M1型细胞特点，揭示CMP刺激可以诱导巨噬细胞向M1型细胞极化（图2）。2.3CMP诱导RAW264.7细胞表达M1型标记CMP刺激组中TNF、IL-6、iNOS和IL-12标记物的表达水平分别为 5.840.52、10.250.81、8.050.34和5.991.44，均高于对照组中相应分子的表达水平，表明 CMP 可以诱导巨噬细胞的 M1 型极化（见图3）。在LPS+INF阳性对照组中，这四种标记物的表达水平分别为8.320.94、13.321.41、26.832.22和16.481.14，均高于CMP的诱导结果，表明CMP诱导巨噬细胞M1型极化的能力低于LPS+INF。为确定 CMP 刺激是否还可以诱导 M2 型巨噬细胞标记物的产生，也同时检测了M2型巨噬细胞的标记物 MR 和 FIZZL 的表达变化，结果如图 4 所示。LPS+INF 处理阳性对照组中 MR 和 FIZZL 的表达水平分别为 0.880.10 和 0.680.02，CMP 诱导组中 MR 和 FIZZL 的表达水平分别为 0.890.04 和0.790.05，均低于对照组，表明CMP不能诱导M2型极化标记分子的表达，不能促进巨噬细胞的M2型极化。2.4CMP诱导巨噬细胞分泌炎性因子培养液中细胞因子TNF和IL-12含量的检测结果如图5所示。正常培养细胞分泌的本底TNF和 IL-12 浓度分别为 24.510.3 pg mL-1和 30.314.6 pg mL-1；CMP诱导后细胞分泌 TNF和 IL-12的含量亦升高，分别达到 256.234.6 pg mL-1和 322.547.3 pg mL-1，表明CMP可以诱导巨噬细胞的M1型极化。但CMP诱导细胞因子的分泌结果低于LPS+INF 诱 导 的 分 泌 结 果（TNF 和 IL-12 分 别 为379.752.1 pg mL-1和 484.333.9 pg mL-1，表 明CMP 的诱导巨噬细胞 M1型极化的能力弱于 LPS+INF的诱导能力。2.5CMP诱导巨噬细胞NF-B通路活化NF-B信号通路是免疫应答过程中的一条经典反应通路，利用免疫印迹技术检测了CMP的诱导引起NF-B信号通路的变化结果见图6。在细胞刺激前，无论是否添加CMP，细胞质中均有IB蛋白表达，而细胞核中几乎没有 p65蛋白表达；当添加CMP诱导 60 min后，细胞质中的 IB蛋白几乎消图2刺激24 h后RAW264.7细胞形态图（100）图4CMP刺激RAW264.7细胞后诱导M2型标记物表达变化图3CMP刺激RAW264.7细胞后诱导M1极化标记物表达变化注：对照：未添加任何刺激的细胞；LPS+IFN：由LPS联合IFN刺激巨噬细胞后诱导的标记物表达；多糖刺激组：培养细胞中加入CMP后诱导的标记物表达；*：P0.01。图5CMP刺激RAW264.7细胞后分泌炎性因子结果10第 1 期贺妍 等：北虫草多糖诱导巨噬细胞极化的机制研究失，此时细胞核内 p65 蛋白表达显著增加。表明CMP可以通过影响巨噬细胞中NF-B信号通路中关键调控分子p65和IB的表达水平，促进NF-B信号通路活化，进而发挥免疫调节的作用。3讨论与结论北虫草隶属子囊菌门虫草属，是一种传统的食药用真菌，其主要活性成分为虫草素和CMP。其中CMP在机体抗感染、抗衰老、抗肿瘤和降血脂方面有显著作用14-15。巨噬细胞属于先天性免疫系统的一种吞噬细胞，可由静息状态转化成不同的极化类型，参与炎症反应和组织损伤修复的过程16-17，在机体免疫应答中起着至关重要的作用。本研究以CMP作为外源诱导物，观察其刺激后巨噬细胞的极化类型改变，为深入理解CMP的药理作用机制提供参考依据。本研究首先筛选了外源CMP刺激巨噬细胞的最适浓度，确定最佳作用浓度为3.13 mgmL-1，此时外源CMP对巨噬细胞活性的促进作用最强。同时发现，外源添加不同剂量的CMP对巨噬细胞增殖均有不等程度的促进作用，从这个角度上讲，CMP对细胞而言是一种比较安全的外源诱导物。本研究检测了 3.13 mgmL-1 CMP 刺激小鼠RAW264.7巨噬细胞后的M1型极化标记分子TNF、IL-6、iNOS 和 IL-12，以及 M2 型极化标记分子 MR和FIZZL的基因表达变化，同时也检测了刺激后细胞分泌到培养液中的炎性因子TNF和IL-12含量变化。结果表明CMP可以诱导巨噬细胞高水平表达M1型极化标记分子TNF、IL-6、iNOS和IL-12，而不能诱导M1型极化标记分子MR和FIZZL的表达，而且CMP也可以提高巨噬细胞分泌的TNF和IL-12含量，其变化规律与 M1型极化的经典诱导物 LPS+INF作用巨噬细胞的结果类似。因此可以肯定CMP具备诱导培养巨噬细胞发生M1型极化的功能。本研究利用免疫印迹技术检测发现CMP刺激60 min后，细胞质中IB水平显著降低，而细胞核中p65水平显著升高。此二者的含量改变表明CMP刺激后，NF-B信号通路被激活，巨噬细胞的免疫应答反应被启动。可以断定CMP通过激活NF-B信号通路，引起 TNF、IL-6、iNOS 和 IL-12 等因子的表达水平升高，向外分泌TNF和IL-12的能力增加，促进了巨噬细胞的M1型极化。值得注意的是，本研究仅仅检测了体外培养细胞的极化状态变化，未能利用动物模型检测体内的极化状况，且对p65表达升高和IB表达降低的调控机制，以及细胞表面/细胞内CMP受体的研究还有所欠缺，需要在未来的研究中深入探讨。综上，研究表明，CMP可以激活NF-B信号通路，促进巨噬细胞M1型极化，为深入了解北虫草巨噬细胞机能提供了新的思路。参考文献：1 左锦辉，贡晓燕，董银卯，等.蛹虫草的活性成分和药理作用及其应用研究进展 J.食品科学，2018，39（21）：330-3392 呼晨，姚金水.北冬虫夏草多糖的研究概述 J.中兽医学杂志，2015（3）：71-743 阮静瑶，陈必成，张喜乐，等.巨噬细胞M1/M2极化的信号通路研究进展 J.免疫学杂志，2015，31（10）：911-9174 ARANGO DUQUE G，DESCOTEAUX A.Macrophage cytokines：Involvement 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converts immunosuppressive macrophages into M1-like phenotype and activates T lymphocytes by inhibiting the PD-L1/PD-1 axis between TAMs and T lymphocytes J.International Journal of Biological Macromolecules，2020，150：261-28013 LEE J S，HONG E K.Immunostimulating activity of the polysaccharides isolated from Cordyceps militarisJ.International Immunopharmacology，2011，11（9）：1226-123314 郐滨.北虫草菌素制备及其抗炎、免疫调节活性研究 D.哈尔滨：东北林业大学，202115 冯辽辽，马一翔，刘广平，等.北虫草菌糠中多糖的提取及成分测定 J.延安大学学报（自然科学版），2023，42（3）：29-3416 MURRAY P J，WYNN T A.Protective and pathogenic functions of macrophage subsetsJ.Nature Reviews Immunology，2011，11：723-73717 王伟，秦贻，王亚茹，等.L929细胞条件培养基诱导培养的小鼠原代巨噬细胞生物学特性对比 J.生物工程学报，2020，36（7）：1431-1439责任编辑 李晓霞Study on the mechanism of polarization of macrophages induced by Cordyceps militaris polysaccharidesHE Yan1，4，DAI Ali1，3，WANG Yi1，LIU Xuan1，FENG Xinyan1，HE Xiaolong1，2，LIU Guangping1，4*，ZHANG Xiangqian1，2*（1.School of Life Sciences，Yan an University；2.Research and Development Centre of Ecological and Sustainable application of Microbial Industry of the Loess Plateau in Shaanxi Province；3.Faculty of Medicine，Yan an Vocational and Technical College；4.Shaanxi Key Laboratory of Chinese Jujube，Yan an 716000，China）Abstract：To investigate the effect of Cordyceps militaris polysaccharides on macrophage polarization，the changes in the polarization status of macrophages were detected after exogenous Cordyceps militaris polysaccharide was used to simulate mouse macrophages RAW264.7，and the molecular mechanism of Cordyceps militaris polysaccharide included polarization of macrophages was explored.The results showed that the stimulation of Cordyceps militaris polysaccharides could promote M1 macrophage polarization，and the polarization process activated the NF-B pathway involved in inflammatory immune response，which initially revealed the mechanism of Cordyceps militaris polysaccharides induced polarization of macrophages，and provided a theoretical basis for further understanding of the regulation of Cordyceps militaris polysaccharide on body immunity.Key words：Cordyceps militaris；polysaccharide；macrophage polarization；mechanism12