真武汤对糖尿病肾病大鼠肾功能、蛋白尿和血液流变学的影响.pdf

171中国现代药物应用2024年1月第18卷第2期Chin J Mod Drug Appl,Jan 2024,Vol.18,No.2真武汤对糖尿病肾病大鼠肾功能、蛋白尿和 血液流变学的影响戴临风张焕陈旭冯月男张瑶【摘要】目的分析真武汤对糖尿病肾病大鼠肾功能、蛋白尿和血液流变学的影响,及其可能潜在机制。方法24 只雄性 SD 大鼠被分为正常组(8 只)和模型组(16 只),模型组通过高糖高脂喂养和腹膜内注射链脲菌素(STZ)(65 mg/kg)构建糖尿病肾病模型,构建成功后的模型组大鼠再分为模型对照组(8 只,灌胃给予 10 ml 生理盐水)和真武汤组8 只,灌胃给药 5.0 g/(kgd)、10 ml/kg。实验第 27 周,采集三组大鼠的血液和 24 h 尿液样本进行生化检查,测定血液流变学指标,并用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)分析肾组织的 nephrin 和 podocin 水平。结果实验第 27 周,正常组的空腹血糖(FBG)、24 h 尿蛋白定量、血尿素氮(BUN)、血清肌酐(Cr)水平分别为(6.420.83)mmol/L、(5.120.76)mg/24 h、(8.410.42)mmol/L、(104.4818.72)mol/L；模型对照组分别为(21.242.22)mmol/L、(27.234.10)mg/24 h、(26.271.74)mmol/L、(311.9119.94)mol/L；真武汤组分别为(20.222.19)mmol/L、(10.121.87)mg/24 h、(12.942.02)mmol/L、(194.9517.42)mol/L。三组大鼠的 FBG、24 h 尿蛋白定量、BUN、Cr 比较差异具有统计学意义(P0.05)；与正常组比较,模型对照组及真武汤组的 FBG、24 h 尿蛋白定量、BUN、Cr均明显升高(P0.05)；与模型对照组比较,真武汤组的 24 h 尿蛋白定量、BUN、Cr 均明显降低(P0.05)。实验第 27 周,正常组的红细胞压积、红细胞计数、红细胞聚集指数、红细胞变形指数分别为(0.48 0.05)L/L、(5.330.31)1012/L、(8.100.75)、(0.950.08)；模型对照组分别为(0.570.03)L/L、(5.89 0.34)1012/L、(11.201.96)、(0.840.05)；真 武 汤 组 分 别 为(0.520.01)L/L、(5.600.15)1012/L、(9.941.45)、(0.930.04)。三组大鼠的红细胞压积、红细胞计数、红细胞聚集指数、红细胞变形指数比较差异具有统计学意义(P0.05)；与正常组比较,模型对照组及真武汤组的红细胞压积、红细胞计数、红细胞聚集指数均明显升高,模型对照组的红细胞变形指数明显降低(P0.05)；与模型对照组比较,真武汤组的红细胞压积、红细胞计数、红细胞聚集指数均明显降低,红细胞变形指数明显升高(P0.05)。实验第 27 周,正常组的 nephrin、podocin 表达水平分别为(1.800.09)、(1.940.08)；模型对照组分别为(1.000.07)、(0.990.05)；真武汤组分别为(1.540.06)、(1.610.07)。三组大鼠的 nephrin、podocin 表达水平比较差异具有统计学意义(P0.05)；与正常组比较,模型对照组及真武汤组的 nephrin、podocin 均明显降低(P0.05)；与模型对照组比较,真武汤组的 nephrin、podocin 均明显升高(P0.05)。结论真武汤可通过改善代谢紊乱、增加 nephrin 和 podocin 基因表达,有效减轻糖尿病肾病大鼠的肾损伤,改善肾功能,真武汤可能是治疗糖尿病肾病的有效途径。【关键词】真武汤；糖尿病肾病；肾功能；血液流变学DOI：10.14164/11-5581/r.2024.02.046Effect of Zhenwu Decoction on renal function,proteinuria and hemorheology in diabetic nephropathy rats DAI Lin-feng,ZHANG Huan,CHEN Xu,et al.Department of Pharmacy,Heilongjiang Provincial Hospital,Harbin 150036,China【Abstract】Objective To analyze the effect of Zhenwu Decoction on renal function,proteinuria and hemorheology in diabetic nephropathy rats and its potential mechanism.Methods 24 male SD rats were divided into normal group(8 rats)and model group(16 rats).The model group was constructed as a diabetic nephropathy model by high-sugar and high-fat feeding and intraperitoneal injection of streptozotocin(STZ)(65 mg/kg),and the rats in the model group after the successful construction were subdivided into the model-control group(8 rats,10 ml of normal saline was given by gavage)and the Zhenwu Decoction group 8 rats,5.0 g/(kgd),10 ml/kg.At the 27th week of the experiment,blood and 24 h urine samples of the three groups of rats were collected for biochemical examination,hemorheological indexes were determined,and the levels of nephrin and podocin in renal tissues were analyzed by reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR).Results (i)At the 作者单位：150036黑龙江省医院药学部(戴临风张焕)；163001大庆油田总医院(陈旭)；150006黑龙江中医药大学(冯月男)；150001黑龙江省中医药科学院(张瑶)实验研究172中国现代药物应用2024年1月第18卷第2期Chin J Mod Drug Appl,Jan 2024,Vol.18,No.2糖尿病肾病(DN)是糖尿病的主要微血管并发症,也是许多终末期肾病(ESRD)的主要原因。糖尿病肾病的特征是肾小球滤过率增加,伴有肾小球内高血压和临床进行性蛋白尿,随后最终丧失肾功能。足细胞是肾小球滤过屏障的重要组成部分1,在糖尿病肾病的肾功能损伤中起着关键作用。足细胞损伤主要表现为足突回缩、脱落以及足细胞相关蛋白 nephrin 的异常表达,导致肾小球基底层增厚、系膜扩张和肾小球硬化等一系列肾脏结构异常2,高血糖和高血压的多种干预措施并不能有效降低或逆转肾病的进展,相当一部分糖尿病患者仍患有进行性和严重的肾损伤。因此,迫切需要开发新的、有效的肾脏保护方法来治疗糖尿病肾病。真武汤出自东汉张仲景的伤寒论,是温阳利水的经典组方,由附子、白术、茯苓、白芍和生姜组成,目前,已有研究表明真武汤能有效治疗糖尿病肾病3,但是其治疗机制尚不清楚,本研究使用诱导的糖尿病肾病大鼠模型来评估真武汤对肾功能和血液流变学的影响及其潜在的因果机制。1材料与方法1.1试验动物24 只 6 周雄性的健康 Sprague-Dawley 27th week of the experiment,the levels of fasting blood glucose(FBG),24-h urinary protein quantity,blood urea nitrogen(BUN)and serum creatinine(Cr)in the normal group were(6.420.83)mmol/L,(5.120.76)mg/24 h,(8.410.42)mmol/L and(104.4818.72)mol/L;those in the control group were(21.242.22)mmol/L,(27.234.10)mg/24 h,(26.271.74)mmol/L and(311.9119.94)mol/L;those in Zhenwu Decoction group were(20.222.19)mmol/L,(10.121.87)mg/24 h,(12.942.02)mmol/L and(194.9517.42)mol/L.There were significant differences in FBG,24 h urinary protein quantity,BUN and Cr among the three groups(P0.05).Compared with normal group,FBG,24 h urinary protein quantity,BUN and Cr in model-control group and Zhenwu Decotion group were significantly increased(P0.05).Compared with model-control group,the 24 h urinary protein quantity,BUN and Cr in Zhenwu Decoction group were significantly decreased(P0.05).(ii)At the 27th week of the experiment,the hematocrit,erythrocyte count,erythrocyte aggregation index and erythrocyte deformation index in the normal group were(0.480.05)L/L,(5.330.31)1012/L,(8.100.75)and(0.950.08);those in the control group were(0.570.03)L/L,(5.890.34)1012/L,(11.201.96)and(0.840.05);those in the Zhenwu Decoction group were(0.520.01)L/L,(5.600.15)1012/L,(9.941.45)and(0.930.04).There were significant differences in hematocrit,erythrocyte count,erythrocyte aggregation index and erythrocyte deformation index among the three groups(P0.05).Compared with normal group,the hematocrit,erythrocyte count and erythrocyte aggregation index of model-control group and Zhenwu Decoction group were significantly increased,while the erythrocyte deformation index of model-control group was significantly decreased(P0.05).Compared with the model-control group,the hematocrit,erythrocyte count and erythrocyte aggregation index of Zhenwu Decoction group were significantly decreased,and the erythrocyte deformation index was significantly increased(P0.05).(iii)At the 27th week of the experiment,the expression levels of nephrin and podocin in the normal group were(1.800.09)and(1.940.08),those in the control group were(1.000.07)and(0.990.05),and those in the Zhenwu Decoction group were(1.540.06)and(1.610.07).The expression levels of nephrin and podocin in three groups were significantly different(P0.05).Compared with normal group,the nephrin and podocin in model-control group and Zhenwu Decoction group were significantly decreased(P0.05).Compared with model-control group,nephrin and podocin in Zhenwu Decoction group were significantly increased(P16.7 mmol/L、24 h 尿蛋白定量50 mg 判定为糖尿病肾脏疾病建模成功,正常组大鼠腹膜内注射等体积的柠檬酸盐缓冲液,建模成功后将模型组动物分为模型对照组(8 只)和真武汤组(8 只),真武汤组同时给予 5.0 g/(kgd)、10 ml/kg 的真武汤灌胃给药,模型对照组和正常组给予等体积去离子水灌173中国现代药物应用2024年1月第18卷第2期Chin J Mod Drug Appl,Jan 2024,Vol.18,No.2胃,连续喂养 16 周。在实验结束时,通过颈椎脱位处死大鼠,切除肾脏并在测试前保持在液氮中。1.4观察指标1.4.1生化指标实验第 27 周,用 10%水合氯醛腹腔注射麻醉,从股动脉抽取血样,采用酶联免疫法测量FBG、BUN、Cr,通过代谢笼单独收集大鼠 24 h 尿液。采用 BCA 蛋白法测定 24 h 尿蛋白定量。1.4.2血液流变学检测实验第 27 周,使用全自动血液流变学检测仪(Suceder,SA-5600)对采集的大鼠血液进行血液流变检测,包括红细胞压积、红细胞计数、红细胞聚集指数、红细胞变形指数。1.4.3nephrin、podocin 表 达 水 平 实 验 第 27 周,用 Trizol 试 剂(Invitrogen)从 SD 大 鼠 的 肾 组 织 中 提取总 RNA,定量后,使用反转录试剂盒将 RNA 逆转录为 cDNA,使用荧光定量 PCR 试剂盒说明书扩增大鼠 nephrin、podocin 和组成型表达的管家基因-肌动蛋白的 cDNA,引物设计如下：nephrin：上游 AACGGGCATTACTGGTCTG,下游 TTCAGGCCTGGC CAATCAAT；podocin：上 游 TGACCTGTGTTTGGGGC ATC,下游 CAGCAATCACCCGCACTTTG。1.5统计学方法所有数据使用 SPSS26.0 进行分析。计量资料以均数 标准差(x-s)表示,多组比较采用方差分析,两组比较采用独立样本 t 检验。P 0.05 被认为差异具有统计学意义。2结果2.1三组大鼠的生化指标比较实验第 27 周,三组大鼠的 FBG、24 h 尿蛋白定量、BUN、Cr 比较差异具有统计学意义(P0.05)；与正常组比较,模型对照组及真武汤组的 FBG、24 h 尿蛋白定量、BUN、Cr 均明显升高(P0.05)；与模型对照组比较,真武汤组的 24 h尿蛋白定量、BUN、Cr 均明显降低(P0.05)。见表 1。2.2三组大鼠的血液流变学指标比较实验第 27 周,三组大鼠的红细胞压积、红细胞计数、红细胞聚集指数、红细胞变形指数比较差异具有统计学意义(P0.05)；与正常组比较,模型对照组及真武汤组的红细胞压积、红细胞计数、红细胞聚集指数均明显升高,模型对照组的红细胞变形指数明显降低(P0.05)；与模型对照组比较,真武汤组的红细胞压积、红细胞计数、红细胞聚集指数均明显降低,红细胞变形指数明显升高(P0.05)。见表 2。2.3三组大鼠的 nephrin、podocin 表达水平比较实验第 27 周,三组大鼠的 nephrin、podocin 表达水平比较差异具有统计学意义(P0.05)；与正常组比较,模型对照组及真武汤组的 nephrin、podocin 均明显降低(P0.05)；与模型对照组比较,真武汤组的 nephrin、podocin 均明显升高(P0.05)。见表 3。表 1三组大鼠的生化指标比较(x-s)组别只数FBG(mmol/L)24 h 尿蛋白定量(mg/24 h)BUN(mmol/L)Cr(mol/L)正常组8 6.420.83 5.120.76 8.410.42104.4818.72模型对照组821.242.22a27.234.10a26.271.74a 311.9119.94a真武汤组820.222.19a 10.121.87ab 12.942.02ab 194.9517.42abF157.917176.558324.570282.119P0.0000.0000.0000.000注：与正常组比较,aP0.05；与模型对照组比较,bP0.05表 2三组大鼠的血液流变学指标比较(x-s)组别只数红细胞压积(L/L)红细胞计数(1012/L)红细胞聚集指数红细胞变形指数正常组80.480.055.330.31 8.100.750.950.08模型对照组8 0.570.03a 5.890.34a11.201.96a 0.840.05a真武汤组8 0.520.01ab 5.600.15ab 9.941.45ab 0.930.04bF15.9359.18610.2468.969P0.0000.0000.0000.004注：与正常组比较,aP0.05；与模型对照组比较,bP0.05表 3三组大鼠的 nephrin、podocin 表达水平比较(x-s)组别只数nephrinpodocin正常组81.800.091.940.08模型对照组8 1.000.07a 0.990.05a真武汤组8 1.540.06ab 1.610.07abF275.167462.377P0.0000.000注：与正常组比较,aP0.05；与模型对照组比较,bP0.05174中国现代药物应用2024年1月第18卷第2期Chin J Mod Drug Appl,Jan 2024,Vol.18,No.23讨论糖尿病肾病是一种慢性肾疾病,主要表现为肾毛细血管破裂、肾小球毛细血管和肾小管间质损伤4,5。高糖高脂饮食与 STZ 注射液相结合,可引起胰岛素抵抗,并显著增加血糖水平,进而引发糖尿病,进而建立成功的糖尿病大鼠模型,与先前的研究报告相似6-8。糖尿病会导致大量的高血糖从肾脏排出,导致肾小球的滤过率增加,最终导致肾脏功能丧失,目前,糖尿病肾病的治疗通常集中在胰岛素、血管紧张素转换酶抑制剂和血管紧张素受体阻滞剂上,但这些方法仍不能有效的降低或逆转糖尿病肾病患者进展为 ESRD,传统草药化合物通过多种方式为糖尿病肾病的管理提供了显著的优势和实用性,并被公认为传统药物的有效替代品。本研究旨在观察真武汤对糖尿病肾病大鼠肾脏功能的影响。糖尿病肾病属于“消渴”、“尿浊”、“水肿”、“肾消”等范畴,其发病机制主要是会增加尿蛋白的排除,从而损害肾脏功能。本研究结果显示,与模型对照组比较,真武汤组 24 h 尿蛋白定量、BUN、Cr 均明显下降(P0.05),一项研究表明11,通过足细胞特异性缺失葡萄糖转运蛋白成员 4 来保护足细胞免受高血糖的影响,可不通过降低血糖水平预防肾小球疾病和糖尿病相关蛋白尿的进展,故本研究推测真武汤在预防蛋白尿和改善肾功能方面具有潜在的应用潜力,不依赖于血糖降低途径。nephrin 和 podocin 是足细胞相关蛋白,podocin 是足细胞中唯一整合膜蛋白,能够与 nephrin 相互作用形成足细胞裂孔膜支架,控制肾小球滤过膜通透性,nephrin 表达缺失或细胞内信号传导异常将导致足细胞形态改变和蛋白尿产生,本研究结果与模型对照组比较,真武汤组 nephrin、podocin均明显提高(P0.05),这提示真武汤可减轻肾小球肥大,改善高血糖症,对足胶质细胞损伤具有多重保护作用。综上所述,真武汤可通过改善代谢紊乱、增加nephrin 和 podocin 基因表达,有效减轻糖尿病肾病大鼠的肾损伤,改善肾功能,真武汤可能是治疗糖尿病肾病的有效途径。参考文献1 康文武,唐倩,严江天,等.糖尿病肾病中足细胞损伤机制的研究进展.华中科技大学学报(医学版),2023,52(2):270-275.2 刘晴,蔡倩,王暴魁.基于足细胞保护探讨中医药治疗糖尿病肾病作用机制的实验研究进展.环球中医药,2021,14(1):169-172.3 陈仕飞,高芳颖,陆文,等.真武汤治疗糖尿病肾病临床效果的 meta 分析.中国医药导报,2021,18(33):131-134.4 吴亚靓.加味真武汤治疗糖尿病肾病的疗效及对中医证候积分和肾功能的影响.糖尿病新世界,2023,26(4):5-8.5 陈雨露,宋道飞,张静,等.真武汤合苓桂术甘汤联合达格列净治疗脾肾阳虚型糖尿病肾病患者的疗效及对血糖控制、炎性因子和细胞免疫的影响.疑难病杂志,2022,21(12):1253-1258.6 田华燕,闫恒阳.真武汤联合贝那普利治疗糖尿病肾病临床观察.光明中医,2022,37(4):677-679.7 吕正鑫.加味真武汤治疗糖尿病肾病的疗效及对中医证候积分和肾功能的影响.医学理论与实践,2022,35(8):1320-1322.8 李想,吕琴,吴秋月,等.高脂高糖饮食联合 STZ 诱导C57Bl/6J 品系小鼠构建糖尿病肾病模型的研究.重庆医学,2022,51(1):16-19.9 戴朝博,陈辉,雷映红,等.真武汤加味对糖尿病肾病大鼠肾功能影响的实验研究.环球中医药,2019,12(4):502-505.10 孙昕,刘卫.复方川芎滴丸对糖尿病肾病模型大鼠血液流变学及血气的影响.中国药房,2017,28(7):909-912.11 Coward R,Fornoni A.Insulin signaling:implications for podocyte biology in diabetic kidney disease.Curr Opin 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