周期蛋白依赖性激酶5对去势抵抗性前列腺癌细胞生长及侵袭转移的影响.pdf

177中国现代药物应用2024年4月第18卷第7期Chin J Mod Drug Appl,Apr 2024,Vol.18,No.7周期蛋白依赖性激酶 5 对去势抵抗性前列腺癌细胞 生长及侵袭转移的影响滕志武张中伟罗丽华【摘要】目的研究周期蛋白依赖性激酶 5(CDK5)对去势抵抗性前列腺癌(CRPC)细胞 DU145 生长及侵袭转移的影响。方法将 CDK5 小分子抑制剂 20-223 添加到细胞中,根据其浓度分为对照组(20-223 浓度为 0.00 mol/L)、2.00 mol/L 组(20-223 浓度为 2.00 mol/L)、4.00 mol/L 组(20-223 浓度为 4.00 mol/L)以及 8.00 mol/L 组(20-223 浓度为 8.00 mol/L),每组 100 株。采用 CDK5 小干扰 RNA(siRNA)干扰 CDK5 在 DU145 细胞内的表达,CDK5 抑制剂 20-223 抑制 CDK5 在 DU145 细胞内的活性；采用噻唑蓝(MTT)检测细胞生长活力,单克隆形成实验测定细胞增殖能力,采用膜联蛋白 V-异硫氰酸荧光素(AnnexinV-FITC)和碘化丙啶(PI)双染法测定细胞凋亡,划痕实验和 Transwell 实验测定细胞的迁移能力,Western Blot 测定 Myc 促癌基因(c-Myc)、SRY-box 转录因子 4(SOX4)及侵袭转移相关蛋白的表达情况。对比分析 CDK5 抑制剂 20-223 对 CRPC 细胞 DU145 生长、凋亡、侵袭转移能力,以及四组细胞 c-Myc、SOX4、上皮间质转化(EMT)相关蛋白的表达量。结果在用药后 24、48、72 h 的细胞生长抑制率方面,2.00 mol/L 组、4.00 mol/L 组、8.00 mol/L 组均高于对照组,差异有统计学意义(P0.01)。CRPC 细胞 DU145 生长活力随着 CDK5 抑制剂的浓度升高而降低,其生长受到显著抑制。2.00 mol/L 组、4.00 mol/L 组、8.00 mol/L 组用药后 48 h Q1 象限、Q2 象限、Q3 象限、Q4 象限的细胞凋亡率均高于对照组,差异有统计学意义(P0.01)。4.00 mol/L 组在用药后 48 h 的迁移率(2.28%)低于对照组(2.37%),差异有统计学意义(P0.01)。细胞经过2 d的处理后,2.00 mol/L组、4.00 mol/L组、8.00 mol/L组c-Myc、SOX4、Vimentin、Zeb1 蛋白的表达量均低于对照组,而 E-cadherin 的表达量高于对照组。CDK5 基因沉默组 CDK5、c-Myc、SOX4 蛋白的表达明显低于对照组和 NC 组。结论CDK5 在 CRPC 中的表达及活性下降,在一定程度上抑制了 DU145 细胞的恶性增殖及浸润,并且对其凋亡起到了促进作用。CDK5 的潜力很强,属于去势抵抗药物的一种,当对其的活性进行抑制后,c-Myc、SOX4 等蛋白水平明显下降,进而上调 E-cadherin、Vimentin、Zeb1 等蛋白水平,从而减弱了去势抵抗药物敏感性。【关键词】周期蛋白依赖性激酶 5；去势抵抗性前列腺癌；侵袭转移；细胞凋亡DOI：10.14164/11-5581/r.2024.07.047The effect of cyclin dependent kinase 5 on the growth,invasion,and metastasis of castrated-resistant prostate cancer cells TENG Zhi-wu,ZHANG Zhong-wei,LUO Li-hua.Urology Department,Jiujiang Third Peoples Hospital,Jiujiang 332000,China【Abstract】Objective To study the effect of cyclin dependent kinase 5(CDK5)on the growth,invasion,and metastasis of castrated-resistant prostate cancer(CRPC)cells.Methods CDK5 small molecule inhibitor 20-223 was added to cells at four levels of concentration,with 0.00 mol/L for control group,2.00 mol/L for 2.00 mol/L group,4.00 mol/L for 4.00 mol/L group and 8.00 mol/L for 8.00 mol/L group,with 100 stains in each group.CDK5 small interfering RNA(siRNA)was used to interfere with the expression of CDK5 in DU145 cells,and CDK5 inhibitor 20-223 inhibited the activity of CDK5 in DU145 cells;Cell growth activity was measured using methyl-thiazole-tetrazolium(MTT),and cell proliferation ability was measured using monoclonal formation assay;Cell apoptosis was measured using Annexin V-fluorescein isothio-cyanate(Annexin V-FITC)and propidium iodide(PI)double staining methods;The scratch test and Transwell test were used to determine the migration ability of cells;Western Blot was used to determine the expression of Myc oncogenic gene(c-Myc),SRY-box transcription factor 4(SOX4),and invasion and metastasis related proteins.Comparatively analysis of CDK5 inhibitor 20-223 on CRPC cell DU145 growth,apoptosis,invasive metastasis ability,as well as the expression of c-Myc,SOX4,and epithelial mesenchymal transition(EMT)-related proteins in the four groups of cells.Results The cell growth inhibition rates of the 2.00 mol/L group,4.00 mol/L group,and 8.00 mol/L 基金项目：江西省卫生健康委科技计划项目(项目编号：202311556)作者单位：332000九江市第三人民医院泌尿外科实验研究178中国现代药物应用2024年4月第18卷第7期Chin J Mod Drug Appl,Apr 2024,Vol.18,No.7前列腺癌(prostate cancer,PCa)是男性第二大常见癌症和第五大癌症死亡原因,而去势抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer,CRPC)是 PCa 的终末期表现,并且几乎所有患者在雄激素阻断治疗(ADT)12 年内即会发展为 CRPC1,2。去势抵抗性是一个十分复杂的过程,与很多因素有关,比如雄激素受体(androgen receptor,AR)扩增、AR 基因突变、AR 配体依赖活化、或体内雄激素合成增多是导致去势耐药的主要原因3,4。前期研究发现,AR 可通过与雌二醇(estradiol,E2)相互作用,当雄激素水平下降时,AR 可与 SOX4 启动子区结合,并促进其表达,进而促进肿瘤细胞的去势耐受,但 CDK5 在 PCa 发生发展中的作用尚不清楚5-8。因此,本次研究拟在前期工作基础上,进一步明确 CDK5 在 CRPC 细胞中的功能,阐明其在CRPC 细胞中的作用及分子机制。1资料与方法1.1一般资料CDK5,c-Myc,E-cadherin,Vimentin,Zeb1,-actin,鼠二抗,兔二抗购于美国 Cell signaling Technology(批号：ab198394)。从美国 Abcam 公司购得 SOX4 的单抗(批号：ab1054)。从碧云天生物技术公司购得了一种名为“噻唑 Blue(MTT)”的细胞生存率测定试剂盒、AnnexinV-FITC 的细胞凋亡测定试剂盒、PI 的细胞凋亡测定试剂盒(批号：214185)。从江苏凯基生物科技有限公司购买了 MEM 培养基,胰酶,结晶紫染色液及 RIPA 的溶酶体缓冲剂。CDK5 的小分子抑制剂 20-223 是从 MedChemExpress 获得的(批号：214185)。本文所用的人 CRPC 细胞 DU145 是从上海生物研究院 Cell Resource Cellular Inc.获得的(批号：ab243041)。采用上海吉凯生物医药技术有限公司的方法,制备了空白对照(NC)和 CDK5 siRNA(批号：group were higher than those of the control group at 24,48,and 72 h after medication,with a statistically significant difference(P0.01).CRPC cell DU145 growth viability decreased with increasing concentrations of CDK5 inhibitors and their growth was significantly inhibited.The incidence of cell apoptosis of Q1 quadrant,Q2 quadrant,Q3 quadrant,and Q4 quadrant in the 2.00 mol/L group,4.00 mol/L group,and 8.00 mol/L group were higher than those in the control group at 48 h after medication,with a statistically significant difference(P0.01).The migration rate in the 4.00 mol/L group was 2.28%at 48 h after medication,which was lower than 2.37%in the control group,with a statistically significant difference(P0.01).After 2 days of treatment,the expression levels of c-Myc,SOX4,Vimentin,and Zeb1 proteins in the 2.00 mol/L group,4.00 mol/L group,and 8.00 mol/L group were lower than those of the control group,while the expression of E-cadherin was higher than that of the control group.The expression of CDK5,c-Myc,and SOX4 proteins in CDK5 gene silenced tissues was significantly lower than that in the control group and NC group(P0.05).Conclusion The decreased expression and activity of CDK5 in CRPC can inhibit the malignant proliferation and infiltration of DU145 cells to a certain extent,and promote their apoptosis.CDK5 has a strong potential and belongs to a castration-resistant drug.When its activity is inhibited,the levels of c-Myc,SOX4 and other proteins are significantly decreased,and then the levels of E-cadherin,Vimentin,Zeb1 and other proteins are up-regulated,thus weakening the sensitivity of castration-resistant drugs.【Key words】Cyclin dependent kinase 5;Castrated-resistant prostate cancer;Invasion and metastasis;Apoptosisab80261)。本次研究经过伦理委员会批准(JJSDSYY-LLWYH-2022031)。1.2细胞培养和分组MEM 溶液的内容物涵盖 10%胎牛血清、100 mg/L 链霉素、100 kU/L 青霉素,得到了人 CRPC 细胞 DU145。针对不同的试验目标,将CDK5 小分子抑制剂 20-223 添加到细胞中,根据其浓度分为对照组(20-223 浓度为 0.00 mol/L)、2.00 mol/L 组(20-223 浓度为 2.00 mol/L)、4.00 mol/L 组(20-223 浓度为 4.00 mol/L)以及 8.00 mol/L 组(20-223 浓度为 8.00 mol/L),每组 100 株。使用 Invitrogen 公司生产的 lipofectamine2000 仪器,选取 DU145 细胞,转染 NCsiRNA 和 CDK5siRNA,并且严格按照说明书的规定进行操作,观察该基因是否会出现沉默,根据其出现沉默的情况分为 NC 组(转染了 NC siRNA 的细胞)、CDK5 沉默组(转染了 CDK5 siRNA 的细胞)。1.3细胞生长活力测定将 MTT 加入其中,培养 4 h,在这个过程当中,抽取掉上层的上清液,并且添加150 l 二甲基亚砜(DMSO)到每一个孔洞当中,震动 0.5 min,震动之后,采用酶标仪,对 570 nm 处的吸光度值进行测量。1.4单克隆形成实验该实验的时间为 14 d,基础液 MEM(8%胎牛血清)为培养基,每 3 天换一次。在培养14 d 之后,将培养基取出,用磷酸缓冲盐溶液(PBS)冲洗 2 次,用冷却好的甲醇将其固定 10 min,然后用 0.1%晶体紫进行 10 min 染色,用 PBS 冲洗后,拍摄照片。1.5细胞凋亡实验细胞经 2 d 的处理之后,采用PBS 对其冲洗 2 次,之后对其进行室内避光的染色,时长为 5 min,AnnexinV-FITC 进行,再次对其进行细胞PI 染色,时间同 AnnexinV-FITC 染色时间,之后采用流式细胞仪测量细胞的凋亡情况。179中国现代药物应用2024年4月第18卷第7期Chin J Mod Drug Appl,Apr 2024,Vol.18,No.71.6 划 痕 实 验 和 Transwell 实 验 划 痕 实 验：以1106细胞/ml 的浓度,将不同类型的对数生长阶段的细胞接种于 6 孔平板上,24 h 后,用吸管进行擦伤,24 h 后,用倒置显微镜拍摄一次,以观察其移动性。Transwell 实验:在 Transwell 上隔间,采用不含血清的方法,在下隔间,添加 10%的胎牛血清。将细胞分别培养到一定的时间,然后以乙醇为载体对其进行固定,并对其进行染色,观察其对细胞的迁移作用。1.7Western Blot 实验经 48 h 后,以 RIPA 溶酶体为溶酶体,于冰上溶酶体 60 min 后,离心提取上清蛋白。以 美 国 Bio-rad Protein Electrosequence System(Protein Electrosequence of Bio-rad Protein System)为研究对象,采用 SDS-PAGE 技术(SDS-PAGE)对其进行分离,并以聚偏氟乙烯(PVDF)为基质,采用湿法电转印技术进行。在室温下用 5%(水/V)的脱脂乳粉将膜片上的蛋白质密封 1 h,然后用 1 抗体在冰箱内 4孵育 8 h,2 抗体在 2 抗体室温孵育 1.5 h。采用美国 Bio-rad 公司的 GelDocTMXR+凝胶成像仪对 PVDF 表面的蛋白质进行分析,并通过 ImageJ 对其进行分析。1.8观察指标对比分析 CDK5 抑制剂 20-223 对CRPC 细胞 DU145 生长、凋亡、侵袭转移能力,同时以 Western Blot 分析四组细胞 c-Myc、SOX4、EMT 相关蛋白的表达量。1.9统计学方法采用 SPSS19.0 统计学软件处理数据。计量资料以均数标准差(x-s)表示,采用t检验；计数资料以率(%)表示,采用2检验。P0.05 表示差异有统计学意义。2结果2.1CDK5 抑制剂 20-223 对 CRPC 细胞 DU145 生长的影响在用药后 24、48、72 h 的细胞生长抑制率方面,2.00 mol/L 组、4.00 mol/L 组、8.00 mol/L 组均高于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。见表1。CRPC 细胞 DU145 生长活力随着 CDK5 抑制剂的浓度升高而降低,其生长受到显著抑制。见图 1。2.2四组用药后 48 h CDK5 抑制剂 20-223 对 DU145细胞凋亡的影响Q1 象限、Q2 象限、Q3 象限、Q4 象限分布为 AnnexinV-FITC+/PI+,AnnexinV-FITC+/PI+,图 1CRPC 细胞 DU145 生长活力与 CDK5 抑制剂浓度关系图IC50=8.240.87(mol/L)药物浓度(mol/L)细胞生长活力(%)表 2四组用药后 48 h CDK5 抑制剂 20-223 对 DU145 细胞凋亡的影响(%)组别株数Q1 象限Q2 象限Q3 象限Q4 象限对照组1001.393.472.352.132.00 mol/L 组100 4.33a 8.95a 2.49a 2.21a4.00 mol/L 组100 2.32a 15.10a 5.21a 3.89a8.00 mol/L 组100 2.82a 29.10a 4.56a 3.71a注：与对照组比较,aP0.01血管生成素 V-FITC+/PI-、血管生成素 V-FITC-/PI-,分别代表细胞晚期凋亡、中期凋亡、早期凋亡状态以及处于晚期凋亡状态。2.00 mol/L 组、4.00 mol/L组、8.00 mol/L 组用药后 48 h Q1 象限、Q2 象限、Q3象限、Q4 象限的细胞凋亡率均高于对照组,差异有统计 学 意 义(P0.05)。见表 2。2.3CDK5 抑制剂 20-223 对 DU145 细胞侵袭转移能力的影响4.00 mol/L组在用药后48 h的迁移率(2.28%)低于对照组(2.37%),差异有统计学意义(P0.01)。见表3。2.4Western Blot 分析各组细胞 c-Myc、SOX4、EMT 相关蛋白的表达量细胞经过 2 d 的处理后,2.00 mol/L 组、4.00 mol/L 组、8.00 mol/L 组 c-Myc、SOX4、Vimentin、Zeb1 蛋白的表达量均低于对照组,而 E-cadherin 的表达量高于对照组。CDK5 基因沉默组 CDK5、c-Myc、SOX4 蛋白的表达明显低于对照组和 NC 组。见图 2。表1CDK5抑制剂20-223对CRPC细胞DU145生长的影响(%)组别株数抑制率用药后 24 h用药后 48 h用药后 72 h对照组1000002.00 mol/L 组10015a25a30a4.00 mol/L 组10020a35a45a8.00 mol/L 组10030a45a50a注：与对照组比较,aP0.01180中国现代药物应用2024年4月第18卷第7期Chin J Mod Drug Appl,Apr 2024,Vol.18,No.7表 3CDK5 抑制剂 20-223 对 DU145 细胞侵袭转移能力的影响(%)组别株数用药后 0 h用药后 24 h用药后 48 h对照组1002.563.412.372.00 mol/L 组1004.615.324.874.00 mol/L 组1002.423.16 2.28a8.00 mol/L 组1002.513.432.30注：与对照组比较,aP0.01图 2四组 c-Myc、SOX4、ETM 相关蛋白表达3讨论本 研 究 结 果 显 示,在 用 药 后 24、48、72 h 的细 胞 生 长 抑 制 率 方 面,2.00 mol/L 组、4.00 mol/L 组、8.00 mol/L 组均高于对照组,差异有统计学意义(P0.01)。CRPC 细胞 DU145 生长活力随着 CDK5抑制剂的浓度升高而降低,其生长受到显著抑制。2.00 mol/L 组、4.00 mol/L 组、8.00 mol/L 组 用 药后 48 h Q1 象限、Q2 象限、Q3 象限、Q4 象限的细胞凋亡率均高于对照组,差异有统计学意义(P0.01)。4.00 mol/L 组在用药后 48 h 的迁移率(2.28%)低于对照组(2.37%),差异有统计学意义(P0.01)。细胞经 过 2 d 的 处 理 后,2.00 mol/L 组、4.00 mol/L 组、8.00 mol/L 组 c-Myc、SOX4、Vimentin、Zeb1 蛋白的表达量均低于对照组,而 E-cadherin 的表达量高于对照组。CDK5 基因沉默组 CDK5、c-Myc、SOX4 蛋白的表达明显低于对照组和 NC 组。与 Zhang 等9的研究结果具有高度的一致性。综上所述,CDK5 在 CRPC 中的表达及活性下降,在一定程度上抑制了 DU145 细胞的恶性增殖及浸润,并且对其凋亡起到了促进作用。CDK5 的潜力很强,属于去势抵抗药物的一种,当对其的活性进行抑制后,c-Myc、SOX4 等蛋白水平明显下降,进而上调E-cadherin、Vimentin、Zeb1 等蛋白水平,从而减弱了去势抵抗药物敏感性。参考文献1 胡俊彪,张春霆,夏建洪,等.Eg5 通过 c-Myc/SP1/CDK1 通路调节去势抵抗性前列腺癌细胞的恶性增殖.温州医科大学学报,2021,51(9):705-712.2 樊俊杰,蒋凡,贺大林,等.CDK12 突变型前列腺癌的单中心临床病理特征分析.中国临床新医学,2021,14(7):663-667.3 高闫尧,付强,姜啸烨,等.CDK12 蛋白在前列腺癌中的表达及与临床病理特征的关系.国际泌尿系统杂志,2021,41(3):397-401.4 王立,刘永强,王耀华,等.miR-497 对前列腺癌细胞生长侵袭及奥沙利铂药物敏感性的影响.国际生物医学工程杂志,2020,43(6):440-444,449.5 杨红彩,郭志,司同国,等.去势抵抗性前列腺癌患者冷冻消融治疗后中性粒细胞与淋巴细胞比值变化的意义.介入放射学杂志,2017,26(3):237-242.6 蒋亮,刘春辉,许斌,等.miR-146a 通过抑制 ROCK 1 基因的表达促进去势抵抗性前列腺癌细胞的凋亡.东南大学学报(医学版),2015(3):357-360.7 胡俊彪,张春霆,夏建洪,等.周期蛋白依赖性激酶 5 调节去势抵抗性前列腺癌细胞侵袭转移的机制研究.中国性科学,2022,31(5):45-48.8 肖鑫,李鹏,施田力,等.雄激素受体在去势抵抗性前列腺癌细胞铁死亡中的作用研究.中国男科学杂志,2021,35(4):7-11,34.9 Zhang Z,Peng H,Wang X,et al.Preclinical Efficacy and Molecular Mechanism of Targeting CDK7-Dependent Transcriptional Addiction in Ovarian Cancer.Mol Cancer Ther.Mol Cancer Ther,2017,16(9):1739-1750.收稿日期：2023-11-06 对照组对照组NC 组CDK5 沉默组2.00 mol/L 组4.00 mol/L 组8.00 mol/L 组CDK5E-cadherinVimentinZeb1c-Mycc-MycSOX4SOX4-Actin-Actin