黄芪莪术不同比例配伍后莪术4种挥发性成分的含量变化研究.pdf

36精密移取“2.下制得的挥发Feb;32(1)黄芪栽术不同比例配伍后栽术4种挥发性成分的含量变化研究”谭喜莹,刘顺，陆媛，孙程1,张忠华1*1南京中医药大学附属医院，南京2 10 0 2 9；南京中医药大学，南京210023摘要目的：探究黄芪术不同配伍比例中，莪术挥发油中抗肿瘤活性成分含量的变化。方法：水蒸气蒸馏法对挥发油进行提取，运用气相色谱法，测定单味术及黄芪莪术配伍比例为1:1、2:1、3:1、5:1、1:2 中-榄香烯、术醇、吉马酮、新术二酮的含量。采用HP-5气相色谱柱，程序升温法，进样口温度为2 50,FID检测器温度为2 8 0；内标物质是水杨酸甲酯。结果：-榄香烯、术醇、吉马酮、新莪术二酮4种挥发油分别在0.0 0 30 0.19 2 0 mgmL-（r=0.9 9 6 9）、0.0 2 332.979 0 mg mL-1(r=0.999 3)、0.0 0 5 9 0.37 6 0 m g m L-(r=0.9 9 9 4)0.0 17 5 1.118 0 m g m L-(r =0.9943)范围呈良好的线性关系，黄芪、莪术以2:1的比例配伍时，各成分溶出量最高。结论：随着黄芪莪术配伍比例的不同，挥发油中抗肿瘤成分含量有所变化，以2:1、3:1的配伍比例为佳，为临床应用和药效学研究提供依据。关键词黄芪；莪术；气相色谱法；含量测定中图分类号R932文献标志码A文章编号1673-7806(2024)01-036-04黄芪术配伍使用早在医学衷中参西录中有记载,两药相伍，益气活血，治疗脏腑症瘦、积聚。两者配伍，一可补气健脾，行气散瘀消癜；二可防术破血太过伤血；三可补气利水，水饮难聚，抑制肿瘤转移,2 。中国药典术含量测定项下为挥发油 3,挥发油主要以倍半类成分如术二酮、呋喃二烯、莪术醇-榄香烯等为主，是抗肿瘤的活性成分 4.5。因此，本文采用气相色谱法(GC)测定黄芪术不同比例配伍后莪术挥发油成分的含量变化，考察配伍对主要抗肿瘤活性成分的影响,为临床配伍使用提供依据。1材料与仪器1.1药材与试剂醋术饮片、黄芪饮片，购自安徽大别山中药饮片有限公司。对照品-榄香烯（批号：2 0 0 8 0 8）、术醇（批号：wkq20042111）、吉马酮（批号：wkq20112304）、新栽术二酮（批号：wkq16052405）购自四川省维克奇生物科技有限公司。高纯氮气（9 9.9 9 9%）；水杨酸甲酯（批号：2 0 0 6 0 2)购自南京*基金项目国家自然科学基金（8 2 0 0 39 6 1,8 2 10 440 8）；江苏省中医药科技发展计划项目（YB201921）；北京医卫健康公益基金会(YWKYQ4007)作者简介谭喜莹，女，主任药师E-mail:*通信作者张忠华，女，主任药师币E-mail:收稿日期2023-12-19修回日期2 0 2 4-0 1-10聚康医药化工有限公司；无水乙醇（成都市科隆化学品有限公司）、丙酮（南京宁试化学试剂有限公司）均为色谱纯，1.2仪器Agilent8890A气相色谱仪 配备HP-5气相色谱柱(30 m320 m0.25mAgilent)、G 456 7 A 自动液体进样器，美国安捷伦公司）;RT-N04新型4两装高速粉碎机（台湾荣聪精密科技有限公司）；Eppedndor高速冷冻离心机（上海艾本德生物技术国际贸易有限公司）。2方法与结果2.1挥发油提取按照黄芪-术的比例分别为0:1、1:1、2:1、3:1、5:1、1:2 称取药材各2 0 0 mg，分别置于2 0 0 0 mL圆底烧瓶中，按照中国药典予以提取，总时长6 h，提取完全后加人适量无水Na2SO4后密封保存2.2溶液的制备.2.内标溶液将精密称定的水杨酸甲酯适量置于容量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，制成每毫升含2 mg水杨酸甲酯的内标溶液油50 L于10 mL容量瓶中，加人内标溶液10 0 L，无水乙醇溶液稀释并定容至刻度，过0.45m微孔滤膜，即得。37PharmaceuticalandClinicalResearch研药学与临床研究2.2.3对照品溶液分别精密称取各对照品适量，加无水乙醇后制得每毫升含-榄香烯0.19 2 mg、术醇2.979mg、吉马酮0.37 6 mg、新术二酮1.118 mg的混合对照品溶液。2.3气相色谱条件程序升温条件：初始温度10 0，保持1min；以5/m i n 升温到140，保持4min；以5/min升温到19 0，保持1min，以10/min升温到2 30，保持保持2 min。分流比为2 0:1；进样口温度为2 50；FID检测器温度为2 8 0，空气流速40 0 mLminl氢气流速40 mLminl；进样量为1L。定量方法选择内标法，水杨酸甲酯为内标物。色谱图见图1。120212013180ABC1203一D140-1001001008080A.100480460604606040401403220202052025510152025305101520253051015202530510 1520 2530t/mint/mint/mint/min390100EFG3100H8038038080M60446060604440404040202202252055202155101520253051015202530510152025305101520 2530t/mint/mint/mint/min图1气相色谱图(A)内标溶液；(B)混合对照品溶液；(CG)黄芪：莪术分别为1:1、2:1、3:1、1:2；(H)莪术；1.内标物；2.-榄香烯；3.莪术醇；4.吉马酮；5.新莪术二酮。2.4方法学考察2.4.1线性关系考察取“2.2.3”项下混合对照品溶液1、0.5、0.2、0.1、0.0 5mL分别置于2 mL容量瓶中，精密加人适量水杨酸甲酯内标溶液，无水乙醇定容，过0.45m微孔滤膜，在“2.3 项下条件进样，横坐标设为对照品溶液浓度（X），纵坐标设为对照品与内标峰面积的比值（Y），进行线性方程计算，结果4个对照品在相应浓度范围内均呈良好的线性关系，且具有较高的灵敏度。见表1。表1术挥发油各成分线性关系化合物回归方程线性范围(mgmL-)T-榄香烯Y=6.5581X-0.0140.00300.19200.9969术醇Y=7.3412X-0.22780.02332.97900.9993吉马酮Y=22.414X-0.01250.00590.37600.999 4新术二酮Y=2.5029X-0.06340.01751.11800.99432.4.2精密度试验精密吸取适量的混合对照品溶液，精密加人水杨酸甲酯内标溶液适量，混合均匀，取上清液，过0.45m微孔滤膜，在2.3 项下条件连续进样6 次，计算各物质峰面积与内标物质峰面积的比值，测得-榄香烯、术醇、吉马酮、新术二酮精密度RSD分别为0.2 2%、1.43%0.33%、0.46%。结果表明仪器精密度良好(RSD5%)。2.4.3重复性试验平行精密移取同一批挥发油5份，按“2.2.2 项下方法制备供试品溶液，按“2.3 项下条件进样，记录-榄香烯、术醇、吉马酮、新栽术二酮峰面积，与内标溶液峰面积比较,RSD分别为0.7 3%0.45%、0.42%、1.9 2%，结果表明本实验方法重复性良好(RSD5%)。2.4.4稳定性试验取黄芪莪术配伍后的供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、2 4h测定，记录峰面积，并计算与内标物的峰面积比值，测得-榄香烯、术醇、吉马酮、新术二酮峰面积比值RSD分别为0.73%、0.7 3%、0.56%、2.8 6%，结果表明在2 4h内样品稳定性良好（RSD5%）。2.4.5加样回收率精密吸取-榄香烯、莪术醇、吉马酮、新莪术二酮含量已知的黄芪-术挥发油6份，按“2.2.2 项下制备供试品溶液，再分别精密加人一定量的混合对照品溶液，在“2.3 项下条件进样，计算各物质的加样回收率，结果见表2，说明该方法准确度良好，符合含量测定要求（RSD5%）。2.5样品测定结果精密移取6 个不同比例配伍的黄芪、术药对，按“2.2.2 项制备供试品溶液，按2.3项下色谱条件，每个溶液进样2 次测定峰面积。不同配伍比例的黄芪莪术药对中-榄香烯、术醇、吉马酮、新术二酮的含量结果见表3。3小结与讨论3.1分析方法优化GC实验考察了顶空与非顶空的进样方法，采用顶空进样时，色谱分析时间较长，顶空适用于沸点在2 0 0 以下的样品中挥发性组份的定性、定量38黄芪莪术不同比例配伍后莪术4种挥发性成分的含量变化研究表2加样回收率结果（n=6）已知量加标量测得量回收率平均回收RSD化合物(mg)(mg)(mg)(%）率(%)（%）0.032397.880.032397.88-榄香0.031 495.150.01300.020096.921.21烯0.032297.580.031695.760.032197.270.632298.030.628 297.410.633898.28术醇0.31390.331097.280.990.628297.410.625797.020.616295.550.314396.530.310195.240.311995.79吉马酮0.146 60.179095.201.020.305393.770.310595.360.307794.500.005391.380.005 594.83新术0.005 493.100.00230.003593.392.72二酮0.005696.550.005 289.660.005 594.83表3不同配伍比例中4种挥发油成分含量测定结果（mgmL-)黄芪：莪术-榄香烯术醇吉马酮新术二酮1:13.626871.644135.48710.58302:113.2887322.3509151.08592.19103:19.9011255.2948126.61631.58545:19.5622193.7540115.82781.14601:211.9269196.599 696.93530.9542单味术8.8041207.935 899.648 61.4292分析。本实验的对照品沸点均大于2 0 0，所以选择液体直接进样的方法。考察DB-WAX、H P-5色谱柱，查阅资料可知DB-WAX是强极性色谱柱，适用于分析酸、醇、醛、酯、腈、酮、基油和DDT等8 种农药;HP-5是非极性色谱柱，适用于分析多核芳烃、酚、酯、碳氢化合物药物、醇等。结合文献资料及最终的分离效果选择HP-5色谱柱进行分离。分析方法考察发现，使用外标法时，测得的精密度、重复性都较低，内标法通过被测组分的峰面积与内标物峰面积的比值来进行计算并定量，测定结果较为准确，在一定程度上可以避免实验操作条件（如进样量）等的不同而引起的误差，所以选择内标法作定量方法。3.2待测目标成分的选择本次试验主要考察不同黄芪术配伍比例对术中挥发油成分的影响。术挥发油是莪术的生物活性成分，主要由术醇、术二酮、吉马酮、-榄香烯等化合物 4.5 组成。-榄香烯是目前广泛用于临床的抗肿瘤成分，如榄香烯乳状注射液，具有显著的抗乳腺癌、肺癌等恶性肿瘤的活性术醇在抗肿瘤方面也表现出潜在的活性，如肺癌口乳腺癌8 鼻咽癌9 等，研究证实吉马酮对于胶质瘤细胞、肺癌细胞、肝癌细胞都具有促进癌细胞增殖、加快其凋亡的作用 0。术中倍半类成分多具有1,5-二烯结构（如牛儿酮、莪术二酮、呋喃二烯等），GC法测定易导致热重排和热转化，重现性和可操作性不理想叫。因此，选择上述4种可以表明术挥发油抗肿瘤效果且适宜用气相色谱检测的重要化学成分为待测指标3.3黄芪一术药对挥发油成分含量分析黄芪、术配伍成药对在临床使用较多，是中医药历史经验总结，具有丰富的内涵。术中含有丰富的挥发油，但黄芪术药对配伍后对莪术挥发性成分的影响的研究较少。本实验通过使用GC法测定术以及黄芪莪术药对中挥发性成分，发现当黄芪：莪术为2:1时，4个成分含量最高，配比为3:1时次之，且这两个配比的含量均高于单味术的各成分含量。因为此次测定的4种成分均为类化合物，化学性质相似，因此配伍后含量变化趋势相似。推测当术与黄芪配伍时，黄芪中的成分对术挥发油中这4个脂溶性挥发油成分起到增溶作用或是保护其不被破坏，从而使得含量高于单味药物。其中最有可能的是黄芪中含量较高的黄芪皂苷类及黄酮类成分。部分成分结果与文献研究一致 2 。3.4含量变化的药效分析中药黄芪与莪术相伍时可以抑制肿瘤的生长。不同配伍比例的黄芪术各成分的含量变化结果表明，黄芪-术以2:1配伍时,-榄香烯、术醇、吉马酮、新术二酮的含量均较高，配伍后抗肿瘤效果较好。这与很多药理研究结果一致：邓樱等 13 设定1:1、2:1、3:1、单独用药组，发现2:1组抗乳腺肿瘤细胞效果最明显孙若岚等 4发现黄芪-莪术2:1组对小鼠结肠癌干预作用最优。可见，挥发油成分-榄香烯、术醇、吉马酮等含量较高可增强其抗肿瘤效果。4结论气相色谱法分析了不同比例的黄芪莪术药对39PharmaceuticalandClinicalResearch药学与临床研究挥发油中抗肿瘤成分的含量，得出了黄芪莪术以2：1的比例配伍时，-榄香烯、术醇、吉马酮、新莪术二酮含量最高，由此推测出黄芪-莪术2:1时，术中抗肿瘤效果或者潜在的抗肿瘤活性最高,为临床应用和新药开发提供依据。参考文献1 臧文华，唐德才.黄芪、术配伍抗肿瘤作用基础研究.辽宁中医药大学学报，2 0 13，15(8)：143-5.2 唐德才。活血化瘀药在抗肿瘤及转移中的运用思考 J.南京中医药大学学报，2 0 19，35(1)：1-4.3 国家药典委员会.中华人民共和国药典 M.北京：中国医药科技出版社，2 0 2 0.4黄辉锋，郑彩娟，陈光英，等术油与药渣残油的化学成分和抗菌活性比较 J。中国实验方剂学杂志，2 0 15,21(20):67-71.5 张贵杰，黄克斌。广西术化学成分和药理作用研究进展 .广州化工，2 0 15,43(11)：2 4-6.6 史亚博，陈婷婷榄香烯抗肿瘤药效及临床应用研究进展 中医临床研究，2 0 2 0，12(18)：40-5.7Zhang WW,Wang ZP,Chen TS.Curcumol inducesapoptosis via caspases independent mitochondrial path-way in human lung adenocarcinoma ASTC-a-1 cellsJ.Med 0ncol,2011,28(1):307-14.8 Ning L,Ma H,Jiang ZY,et al.Curcumol suppressesbreast cancer cell metastasis by inhibiting MMP-9 viaJNK1/2 and Akt-dependent NF-kappaB signaling path-waysJ.Integr Cancer Ther,2016,15(2):216-225.9HE JN,YAO DF,LI JE.Effect of curcumol on prolif-eration,apoptosis and cell cycle of nasopharyngeal car-cinoma CNE2 cells J.Chin J Otorhinolaryngol SkullBase Surg,2011,17(3):171-4.10 陈琼芳，王钢，李钊飞，等.吉马酮药理作用的研究进展 .中华中医药刊，2 0 17，35(9)：2 312-5.11 杨秀春，张建梅，李琳，等呋喃二烯长循环脂质体的制备与表征 J.中国新药杂志，2 0 16，2 5(2 1)：2 50 0-5.12 吴佳菲，姚映芷，尹刚，等.HPLC对黄芪和莪术单煎、单煎后合并及共煎的有效成分含量分析 J.中华中医药杂志，2 0 18，33(4)：156 7-7 0.13 邓樱，唐润伟，卫菊，等黄芪-莪术对人乳腺癌的抑制作用及其机制 J.山西医科大学学报，2 0 2 1，52(3):255-63.14孙若岚，唐德才，顾俊菲黄芪-术配伍对结肠癌原位移植瘤小鼠模型抗结肠癌生长转移的干预效应研究中国中药杂志，2 0 2 1,，46(9)：2 2 6 7-7 5.Study on the content changes of four volatilecomponents in CurcumaeRhizoma with different proportions of Astragali Radix and Curcumae Rhi-*zomaTAN Xiying,LIU Shun,LU Yuan,SUN Cheng,ZHANG ZhonghuaAffiliated Hospital of Nanjing University of Traditional Chinese Medicine,Nanjing,210029,China,2NanjingUniversity of Traditional Chinese Medicine,Nanjing 210023,ChinaABSTRACTObjective:To investigate the changes in the content of anti-tumor active ingredients in thevolatile oil of Curcumae Rhizoma in different compatibility ratios of Astragali Radix and Curcumae Rhi-zoma.Methods:Gas chromatography was used to determine the contents of-elemene,curcuman alcohol,gemarone and neocaridione in single Curcumae Rhizoma,Astragali Radix and Curcumae Rhizoma in thecompatibility ratios of 1:1,2:1,3:1,5:1,1:2.HP-5 gas chromatography column was used with programmedwarming method,and the inlet temperature was 250.T h e t e mp e r a t u r e o f t h e FID d e t e c t o r i s 2 8 0.T h esample size was 1 L,and the standard internal substance was methyl salicylate.Results:The four volatileoils of-olive,curcumin,gemarone and neocaridione were 0.003 0-0.1920mgmL-(r=0.9969),0.0233-2.979 0 mgmL-l(r=0.999 3),0.005 9-0.3760 mgmL-1(r=0.999 4)and 0.0175,respectively.The range of-1.1180mgmL-I(r=0.994 3)showed a good linear relationship.When Astragali Radix and Curcumae Rhi-zoma were mixed at a 2:1 ratio,the dissolution amount of each component was the highest.Conclusions:With the different compatibility ratios of Astragali Radix and Curcumae Rhizoma,the content of antitumormembers in volatile oil has changed,and the compatibility ratio of 2:1 and 3:1 is the best,which providesthe basis for clinical application and pharmacodynamics research.KEY WORDSSAstragali radix;Curcumae rhizoma;GC;Content determination