MicroRNA的生物表达与结核病诊断和治疗监测的相关性及其对结核病易感基因表达调控的研究.pdf

58中国现代药物应用2024年4月第18卷第7期Chin J Mod Drug Appl,Apr 2024,Vol.18,No.7MicroRNA 的生物表达与结核病诊断和治疗监测的 相关性及其对结核病易感基因表达调控的研究谭珂于艳红孙娇孙秀华王悦贾琳邢黎莉张威【摘要】目的探究微小核糖核酸(MicroRNA)对结核病诊断和治疗监测及易感基因表达调控的意义。方法选取 136 例肺结核患者作为肺结核组,另选择 142 例健康体检者作为对照组。以实时荧光定量 PCR(qRT-PCR)法检测两组血清 hsa-miR-20b、CUL4A mRNA、GBP5 mRNA 水平；检测干扰素调节因子 8 基因(IRF8)、循环换血 RNA-103571(hsa-circRNA-103571)、-干扰素(IFN-)水平。比较两组血清 hsa-miR-20b、GBP5 mRNA、CUL4A mRNA 的表达量；比较两组血清 IRF8、hsa-ciceRNA-103571、IFN-水平；分析肺结核患者 hsa-miR-20b 与 IRF8、hsa-circRNA-103571、IFN-的相关性；回归分析肺结核发生的影响因素；分析血清 hsa-miR-20b 对肺结核的诊断效能。结果肺结核组患者血清 hsa-miR-20b、GBP5 mRNA、CUL4A mRNA 的表达水平分别为(3.350.20)、(2.940.23)、(0.410.15),对照组分别为(1.010.23)、(1.020.13)、(1.030.11)；与对照组相比,肺结核组患者血清 hsa-miR-20b、GBP5 mRNA 的表达水平均升高,CUL4A mRNA 的表达水平降低,差异均有统计学意义(P0.05)。肺结核组患者血清 IRF8(389.3946.85)pg/ml、hsa-circRNA-103571(22.48 5.06)ng/L 均高于对照组的(327.6241.76)pg/ml、(11.363.17)ng/L,IFN-(5.581.36)pg/ml 明显低于对照组的(12.724.78)ng/L,差异有统计学意义(P0.05)。Pearson 相关性分析显示,肺结核患者血清 hsa-miR-20b 与 IRF8、hsa-circRNA-103571 水平呈正相关(r=0.585、0.539,P0.05),与 IFN-水平呈负相关(r=-0.485,P0.05)。以 hsa-miR-20b、IRF8、hsa-circRNA-103571、IFN-水平为自变量,以肺结核是否发生为因变量,行 Logistic 回归分析,结果显示 hsa-miR-20b、IRF8、hsa-circRNA-103571是肺结核发生的危险因素(P0.05),IFN-是肺结核发生的保护因素(P0.05),具有可比性。1.2纳入标准满足肺结核诊断和治疗指南3中关于诊断肺结核的标准；患者自愿参与相关试验项目,并签署知情同意书。1.3排除标准患有严重的肝肾功能障碍；对试验药物过敏；患有糖尿病、肿瘤等疾病；患有严重的急性心脑血管疾病；妊娠期及哺乳期；患有精神性疾病或不能配合试验；近期使用糖皮质激素、抗感染、免疫等影响炎症反应的药物。1.4方法 1.4.1样本收集肺结核患者在住院第 2 天采集静脉血,同时收集健康体检者的静脉血,用 3500 r/min 的速度离心 3 min,提取上清液,保持在-80的环境中。1.4.2检测 hsa-miR-20b、CUL4A mRNA、GBP5 mRNA difference was statistically significant(P0.05).The pulmonary tuberculosis group had serum IRF8 of(389.39 46.85)pg/ml and hsa-circRNA-103571 of(22.485.06)ng/L,which were higher than (327.6241.76)pg/ml and(11.363.17)ng/L in the control group;the pulmonary tuberculosis group had significantly lower IFN-of(5.581.36)pg/ml than(12.724.78)ng/L in the control group;the difference was statistically significant(P0.05).Pearson correlation analysis showed that serum hsa-miR-20b was positively correlated with IRF8 and hsa-circRNA-103571 levels in patients with pulmonary tuberculosis(r=0.585,0.539;P0.05),and was negatively correlated with IFN-level(r=-0.485,P0.05).Logistic regression analysis was performed with the levels of hsa-miR-20b,IRF8,hsa-circRNA-103571,and IFN-as independent variables,and whether tuberculosis occurred or not as the dependent variable,and the results showed that hsa-miR-20b,IRF8,and hsa-circRNA-103571 were the risk factors for the occurrence of pulmonary tuberculosis(P0.05),and IFN-was a protective factor for the development of pulmonary tuberculosis(P0.05).The area under the curve(AUC)of serum hsa-miR-20b level for the diagnosis of pulmonary tuberculosis was 0.898,the cut-off value was 1.44,and its sensitivity was 83.82%and specificity was 88.03%.Conclusion There is high expression of hsa-miR-20b in the serum of patients with pulmonary tuberculosis,which is closely related to inflammation-related factors.Hsa-miR-20b may interact with inflammation-related factors to regulate the occurrence and development of pulmonary tuberculosis.【Key words】Micro-ribonucleic acid;Tuberculosis;hsa-miR-20b;Inflammatory factors表达量提取标本后,在无菌环境下操作,通过 BIOG血清miRNA提取试剂法收集总RNA,具体操作按BIOG血浆血清 miRNA 提取试剂(常州百代生物科技股份有限公司)说明书进行。以紫外分光光度计(Nano EX,泽尼萨尔有限公司)检测 RNA 浓度、纯度,并验其完整性。根据 BIOG miRNA 探针法逆转录试剂盒(常州百代生物科技股份有限公司)说明书将 RNA 逆录成cDNA。利用 BIOG miRNA 探针法荧光定量 PCR 试剂(常州百代生物科技股份有限公司)及 PCR 仪(Rotor-Gene Q,凯杰企业管理有限公司)将 cDNA 扩增,qPCR检 测。hsa-miR-20b、CUL4A mRNA、GBP5 mRNA 以hsa-miR-16 为 内 参。以 2-Ct法 计 算 hsa-miR-20b、CUL4A mRNA、GBP5 mRNA 相对表达量。1.4.3检测血清 IRF8、hsa-circRNA-103571、IFN-水平提取出样本后,用人IRF8酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒(KHG0111,上海研卉生物科技有限公司)、hsa-circRNA-103571(ELISA)试 剂 盒(OSD_H0170,长沙达尔锋生物科技有限公司)、IFN-(ELISA)试剂盒(BS-E3748 h1,广州徕智生物科技有限公司),通过ELISA 法对 IRF8、hsa-circRNA-103571、IFN-水平进行检测。1.5统计学方法数据通过 SPSS22.0 软件进行统计。计量资料以均数 标准差(x-s)表示,采用 t 检验；计数资料以率(%)表示,采用2 检验。肺结核患者的hsa-miR-20b 与 IRF8、hsa-circRNA-103571、IFN-的相关性检验采用 Pearson 相关进行；采用 Logistic 回归分析肺结核发生的危险因素；采用受试者工作特征曲线(ROC 曲线)分析 hsa-miR-20b 的表达量对肺结核的诊断效能。P0.05 表示差异有统计学意义。2结果2.1两组血清 hsa-miR-20b、GBP5 mRNA、CUL4A 60中国现代药物应用2024年4月第18卷第7期Chin J Mod Drug Appl,Apr 2024,Vol.18,No.7mRNA 的表达量比较与对照组相比,肺结核组患者血清 hsa-miR-20b、GBP5 mRNA 的表达水平均升高,CUL4A mRNA 的表达水平降低,差异均有统计学意义(P0.05)。见表 1。2.2两组血清 IRF8、hsa-ciceRNA-103571、IFN-水平比较与对照组相比,肺结核组患者血清 IRF8、hsa-circRNA-103571 水平较高,IFN-水平明显较低,差异均有统计学意义(P0.05)。见表 2。表 1两组血清 hsa-miR-20b、GBP5 mRNA、CUL4A mRNA 的表达量比较(x-s)组别例数hsa-miR-20bGBP5 mRNACUL4A mRNA肺结核组136 3.350.20a 2.940.23a 0.410.15a对照组1421.010.231.020.131.030.11t 90.35786.14539.417P 0.0000.0000.000注：与对照组比较,aP0.05表 2两组血清 IRF8、hsa-ciceRNA-103571、IFN-水平比较(x-s)组别例数IRF8(pg/ml)hsa-circRNA-103571(ng/L)IFN-(pg/ml)肺结核组136 389.3946.85a 22.485.06a 5.581.36a对照组142327.6241.7611.363.1712.724.78t11.61622.05617.093P0.0000.0000.000注：与对照组比较,aP0.052.3肺结核患者 hsa-miR-20b 与 IRF8、hsa-circRNA-103571、IFN-的相关性分析Pearson 相关性分析显示,肺结核患者血清 hsa-miR-20b 与 IRF8、hsa-circRNA-103571 水平呈正相关(r=0.585、0.539,P0.05),与 IFN-水平呈负相关(r=-0.485,P0.05)。2.4肺结核发生的影响因素分析以 hsa-miR-20b、IRF8、hsa-circRNA-103571、IFN-水平为自变量,以肺结核是否发生为因变量,行 Logistic 回归分析,结果 显 示 hsa-miR-20b、IRF8、hsa-circRNA-103571 是肺结核发生的危险因素(P0.05),IFN-是肺结核发生的保护因素(P0.05)。见表 3。表 3肺结核发生的影响因素分析指标BSEWald-2POR95%CIhsa-miR-20b0.6170.2774.9610.0261.8541.077,3.192IRF80.5500.2216.2160.0301.7341.125,2.673hsa-circRNA-1035710.6220.2874.6970.0301.8621.061,3.267IFN-0.5680.10628.7130.0000.5670.461,0.6982.5血清 hsa-miR-20b 水平对肺结核的诊断效能分析ROC 曲线显示,血清 hsa-miR-20b 水平对肺结核发生诊断的曲线下面积(area under curve,AUC)为 0.89895%CI=(0.860,0.936),截断值为 1.44,其灵敏度、特异度分别为 83.82%、88.03%。见图 1。3讨论miRNA 是大量存在于人体血液中的小 RNA,并且不参与生物编码,在人体新陈代谢等生命活动中都有参与,所以肺结核等肺部疾病患者其水平会显著升高。经 Ndzi 等4试验证实,当发生肺结核时 hsa-miR-20b会出现异常的表达。既往研究显示,CUL4A 在肺结核患者的表达中会出现差错,其表现贯彻整个疾病的演变过程5-9。此次试验证实,肺结核患者的 hsa-miR-20b 表达显著高于健康人群,同时 CUL4A mRNA 的表达出现下降,证明 hsa-miR-20b 表达上升和 CUL4A 表达下降可以预示肺结核的出现和恶化。在肺结核的恶化进程中,免疫因子都有相应的参与,其中,IRF8 作为一种重要的细胞因子,在细胞的分化和发育中起重要作用10-14。circRNAs 是一类由 3 端反向与 5 端连接形成共价闭环结构的新型内源性 RNA,随着对研究的不断深入,发现 circRNAs 具有与常规线性 RNA 不同的生物学特性,包括广泛性、高度保守性、高稳定性以及组织特异性15-19。此外,IFN-可激活免疫细图 1血清 hsa-miR-20b 水平对肺结核的诊断效能1-特异度灵敏度1.01.00.80.80.60.60.40.40.20.20.00.061中国现代药物应用2024年4月第18卷第7期Chin J Mod Drug Appl,Apr 2024,Vol.18,No.7胞,在抗结核过程中发挥重要作用,肺结核患者血清中IRF8、hsa-circRNA-103571 水平升高,IFN-水平降低。相关研究20中,经结核药联合利福喷丁治疗后,IRF8、hsa-circRNA-103571 水平降低,IFN-水平升高,IRF8、hsa-circRNA-103571、IFN-均可能参与且影响肺结核发病进展。本研究中肺结核组患者血清IRF8、hsa-ciceRNA-103571 水平均明显高于对照组,IFN-水平明显低于对照组(P0.05)；由此提示炎症相关因子 IRF8、hsa-circRNA-103571、IFN-可能在肺结核发病过程中起一定作用。本研究中肺结核患者血清 hsa-miR-20b 与 IRF8、hsa-circRNA-103571 水平呈正相关(r=0.585、0.539,P0.05),与 IFN-水平呈负相关(r=-0.485,P0.05)；由此提示 hsa-miR-20b 可能与 IRF8、hsa-circRNA-103571、IFN-等因素关系密切,可以对肺结核的演化进行干预。本研究结果显示,hsa-miR-20b、IRF8、hsa-circRNA-103571 是肺结核发生的危险因素,IFN-是肺结核发生的保护因素,提 示 hsa-miR-20b、IRF8、hsa-circRNA-103571 水 平升高、IFN-水平降低均可能使肺结核患病风险升高,及时监测 hsa-miR-20b、IRF8、hsa-circRNA-103571、IFN-浓度可以提早发现肺结核。综上所述,肺结核患者血清 hsa-miR-20b 表达上调,hsa-miR-20b 与炎症相关因子具有一定相关性,其可能与炎症因子共同影响肺结核疾病病变过程。参考文献1 翁绳凤,李宁,邢俊蓬,等.Xpert MTB/RIF 检测结核分枝杆菌及利福平耐药性的应用价值研究.分子诊断与治疗杂志,2019,11(3):229-232.2 Dalvi SM,Ramraje NN,Patil VW,et al.Study of IL-6 and vitamin D3 in patients of pulmonary tuberculosis.Indian J Tuberc,2019,66(3):337-345.3 中华医学会结核病学分会.肺结核诊断和治疗指南.中国实用乡村医生杂志,2013,20(2):7-11.4 Ndzi EN,Nkenfou CN,Mekue LM,et al.MicroRNA hsa-miR-29a-3p is a plasma biomarker for the differential diagnosis and monitoring of tuberculosis.Tuberculosis(Edinb),2019(114):69-76.5 Ren Y,Zhang Y,Fan L,et al.The cullin4A is upregulated in chronic obstructive pulmonary disease patient and contributes to epithelialmesenchymal transition in small airway epithelium.Respir Res,2019,20(1):84-94.6 贾谷,马艳萍,张灵,等.多发性骨髓瘤患者骨髓单个核细胞与 U266 细胞中 ICSBP/IRF-8 基因表达沉默的初步研究.中国实验血液学杂志,2012,20(5):1127-1130.7 李标.环状 RNA circMARS 和 circITPR1 在抗结核药物性肝损伤中的诊断价值及作用机制研究.华北理工大学,2019.8 谢晓霞.结核病诊断中 MicroRNA 的功能介绍.幸福生活指南,2020(31):0163.9 王明阳,王光磊,陈新亮,等.MicroRNA 的生物学功能及其与肿瘤诊断和治疗的研究进展.动物医学进展,2018,39(1):95-98.10 郄霜,张庆波,冯晓燕.microRNA 与结核病诊断的研究进展.生物技术通讯,2014,25(3):433-435.11 张恒,多杰.MicroRNA 在部分呼吸系疾病中的研究进展.临床肺科杂志,2016,21(2):344-346.12 央拉,李长山.肺结核相关microRNA研究进展.中国防痨杂志,2015,37(2):194-198.13 杨静,董剑.miRNA 与结核分枝杆菌感染的研究进展.重庆医学,2015,44(8):1132-1134.14 尚晓倩,赵慧,马秀敏,等.microRNA 与结核分枝杆菌感染的致病机制研究进展.中华医院感染学杂志,2019,29(3):477-480.15 曹帅丽,袁俐.结核病相关 microRNA 研究进展.中国人兽共患病学报,2014(7):757-760,771.16 樊宇,杨春,何永林,等.microRNA 与结核病相互关系的研究进展.重庆医科大学学报,2015,40(9):1167-1171.17 王杰,刘春法,崔永勇,等.结核分枝杆菌感染相关 microRNA的研究进展.畜牧与兽医,2016,48(10):130-133.18 王方璐,王文涛,伊正君,等.microRNA 调控结核分枝杆菌感染巨噬细胞凋亡的研究进展.中华微生物学和免疫学杂志,2021,41(2):143-148.19 张益源,伊正君,付玉荣.microRNA 在结核分枝杆菌抗细胞自噬作用中的研究进展.生物化学与生物物理进展,2019,46(1):43-50.20 洪旭华,陈凯.结核药联合利福喷丁对肺结核患者免疫功能、炎症因子、VEGF 及 MMP-9 的影响.昆明医科大学学报,2016,37(2):111-114.收稿日期：2023-05-31