小麦花药培养创建dh群体.doc

河北农业大学本科毕业论文论文题目 小麦花药培养创建DH群体 学生姓名 学号 成绩 93 学院 农学院 专业班级 指导教师姓名 指导教师职称 教授 材料目录：1、任务书 （ 1 ）份2、开题报告 （含文献综述） （ 1 ）份3、指导教师评阅书 （ 1 ）份4、答辩记录表 （ 1 ）份5、论文正文 （ 1 ）份6、其它材料河北农业大学本科毕业论文任务书学 院： 农学院 教师姓名： 刘桂茹 职 称： 教授 年 月 日专业名称农学院，农学专业论文题目小麦花药培养创建DH群体题目来源通过前人在实验室利用花药培养的研究成果目的意义： 单倍体植物在作物育种、遗传分析、基因克隆等领域已得到广泛应用，创建单倍体植物的方法有很多种，而用花药培养技术是创建小麦单倍体行之有效的方法。小麦是我国主要粮食作物之一，花药培养技术对小麦育种具有突出优点，纯合速度快，后代稳定性好，从而缩短育种年限，提高选择的准确性及可靠性，花药培养的单倍体群体通过加倍得到的纯合体植株群体即为DH群体（doubled haploid）。DH 群体为永久性群体, 不仅可获得常规育种难以或无法得到的新类型，更广泛用于基因图谱构建、分子标记等遗传学研究， 在构建遗传连锁图及QTL分析上有着突出优势,因为群体中每个个体在遗传上都是纯合的,非常适于连续性资料积累。同时，通过选择综合性状优良的品系还可培育出小麦新品种。本研究意在用花药培养技术创建小麦DH群体。可行性分析：试验查阅了大量的参考文献，实验设计合理，预期结果明确，所在课题组现已搜集了大量的种质资源，并进行了基础研究。所在作物遗传育种实验室具备良好的实验室条件和试验所需的仪器设备条件如低温培养箱，恒温培养箱等实验仪器，能确保本试验有序进行。预期结果：（1） 能通过小麦花药培养创建DH群体可能存在的问题：（1） 由于培养环境和基因型差异，花培过程中白化现象可能严重。（2） 单倍体植株自然加倍可能丢失部分优良单株。进度安排： 2012年2月-3月：选题，查阅文献资料; 3月-4月：确定方案;2012年5月：收集实验资料，在河北农业大学实验室接种花药；6月-9月：花药的脱分化，再分化，壮苗；10月-11月：分批移栽；2013年1月-4月：幼苗自然加倍5月-6月：撰写论文，准备答辩。专家意见：该实验拟对小麦花药培养创建DH群体，实验设计合理，技术路线可行，预期结果明确，进度安排合理，同意按计划执行。专家签字：年 月 日学院意见: 同意立题院长： 年 月 日 农学 学院 农学 专业 王冬旭 学生： 现把 2012-2013 学年，第 二 学期的毕业论文安排下达给你，你本学期承担的毕业论文任务如下：1、依据本任务书中论文题目、目的意义、可行性分析的内容完成开题报告。2、按照开题报告的要求按期完成毕业论文各项工作的实施。3、完成毕业论文的撰写。4、完成毕业论文的答辩。 请按相关要求完成毕业论文任务。教师签字： 年 月 日河北农业大学本科毕业论文开题报告题 目： 小麦花药培养创建DH群体 学 院： 农学院 学生姓名： 王冬旭 专 业： 农学 班级学号： 2009014010212 指导教师姓名： 刘桂茹 指导教师职称： 教授 年 月 日学生姓名王冬旭专业班级农学0902学 号2009014010212指导教师刘桂茹职 称教授所在学院农学院论文名称小麦花药培养创建DH群体选题依据： 单倍体植物在作物育种、遗传分析、基因克隆等领域已得到广泛应用，创建单倍体植物的方法有很多种，而用花药培养技术是创建小麦单倍体行之有效的方法。小麦是我国主要粮食作物之一，花药培养技术对小麦育种具有突出优点，纯合速度快，后代稳定性好，从而缩短育种年限，提高选择的准确性及可靠性，花药培养的单倍体群体通过加倍得到的纯合体植株群体即为DH群体（doubled haploid）。DH 群体为永久性群体, 不仅可获得常规育种难以或无法得到的新类型，更广泛用于基因图谱构建、分子标记等遗传学研究3， 在构建遗传连锁图及QTL分析上有着突出优势,因为群体中每个个体在遗传上都是纯合的,非常适于连续性资料积累。同时，通过选择综合性状优良的品系还可培育出小麦新品种。本研究意在用花药培养技术创建小麦DH群体。文献综述：花药培养技术王冬旭指导老师：刘桂茹（河北农业大学农学院农学0902班保定071000） 小麦是世界范围广泛种植的主要粮食作物之一，全球35%-40%的人口以它为主食，具有分布广、面积大、总产高、贸易额多、营养价值高等特点，在世界食品安全、战略贮备和农产品贸易中占有极其重要的地位1 小麦不仅经济价值高，而且营养丰富，小麦籽粒中含有人类所必需的大量的营养物质，其中碳水化合物含量占60-80，蛋白质含量占8-15，脂肪含量占1.5-2.0，矿物质含量占1.5-2.0，以及各种维生素等。而且小麦特有的化学组成、独特的面筋蛋白和丰富的营养成份，使其具有良好的黏弹性、胀发性和延伸性，可用于制作各种面食；另外，麦麸是优良的精饲料，麦秆常常用于编织和造纸2 。除被用作上述各种主食和副产品等的加工原料外，小麦还被用作储备和贸易粮种。中国既是小麦生产大国，也是小麦消费和贸易大国。由于大国效应，中国小麦的产量直接影响着世界小麦的生产发展、市场波动及国际贸易格局。2009年中国小麦的种植面积约为2421万公顷，产量约为11495万吨，平均单产为4746kg/ha3 。据有关部门测算，2015年我国小麦的人均需求量将达到9.68kg，总需求量将达到14051万吨；占粮食总需求的24.1%4，目前的生产量尚不能满足消费的需求。可见，在今后的几十年中，我国对小麦的消费需求将有增无减，小麦生产的压力会越来越大。围绕如何提高小麦的产量，世界很多国家在小麦品质育种技术研究方面取得了很大成就，培育并推广了许多农艺性状好的优质高产的小麦品种，其中花药培养育种技术在培育新品种中有不错的成效。1、 植物花药培养研究进展花药培养育种就是利用组织培养的方式将得到的单倍体植株经自然或人工加倍得到纯合二倍体的育种方法。通过这种方式可得到遗传稳定、排除杂合体中基因显隐性隐蔽、纯合的二倍体植株, 这样缩短育种时间, 提高选择的准确性及可靠性。中国自20 世纪70 年代开始进行花药培养育种研究, 已取得重大成就, 以水稻和小麦为代表的作物花培育种研究与应用处于世界领先地位, 并成功与常规杂交育种、远缘杂交育种及转基因技术相结合, 发展形成了一套较完整的育种技术体系6 。2、植物幼穗发育时期与诱导率花药培养中愈伤组织的诱导受多种生理及环境因子的影响。 首先, 花粉在接种时所处的发育时期可能比较重要, 不同物种最适接种时期各异( 多数为单核期或双核期) 。小麦根据从挑旗到抽穗期间幼穗的大小, 从外观形态上分为5个时期:小胞期，中胞期，大包期，破肚期，抽穗期；以中包期和大包期幼穗花药的愈伤诱导率最高。前人研究表明, 单核中、晚期是花药培养的最适接种时期7 。在小麦穗分化过程中, 不同穗位小花发育不同步, 所以幼穗的最适接种期弹性较大, 但已抽穗的幼穗一般不宜再用做花药培养, 以免影响愈伤诱导率。此外, 供试植株的生理状态对愈伤组织的产生也有影响, 一般情况下幼年植株的花药对诱导的反应能力较强。 其次, 接种前的预处理对愈伤组织产生也有明显影响, 尤其在诱发小孢子脱分化方面作用明显。例如: 低温( 4 ) 预处理( 24 48 h) 可促进草莓、羽衣甘蓝和石刁柏花药培养时产生更多愈伤组织 8- 9 。申书兴等10 研究认为小孢子培养开始时, 热激处理( 33 , 24 h) 后25 下培养能促进四倍体大白菜小孢子进行对称分裂, 有利于愈伤组织的产生及获得大量胚状体。乔奇等9 试验发现, 消毒方法对花药愈伤组织的形成也有影响, 但这可能与材料的生境有关。另外, 组织学研究证实, 花药壁在花粉产生愈伤组织和形成花粉胚过程中对其有一定影响作用,只有贴靠在花药壁附近的花粉才能顺利实现脱分化。这说明绒毡层起源的某些重要物质的梯度变化对愈伤诱导有重要影响11 。花药的长度及体积对其形成愈伤组织的能力也有影响。3、小麦花培的影响因素3.1培养基对小麦花培能力的影响培养基是花药培养的关键, 国内外许多研究探讨了培养基对小麦花培能力的影响。1986 年王培等12 研究指出C17 培养基是适合小麦花药培养的培养基, C17 培养基的花药愈伤组织诱导率均显著高于MS、N6、C1、D、W、麦II 和马铃薯简化培养基, 而且历年诱导提高的幅度非常稳定, 同时指出, 该培养基还不完善, 需要进一步调整微量元素和有机物的种类和配比。国内很多单位采用该培养基, 并在C17培养基的基础上进行了改进。王培等13 利用C17 的浸润培养基进行花药培养, 发现花药愈伤组织诱导率从固体培养基的13. 94% 提高到29. 95% , 愈伤组织的绿苗分化率也明显提高。陈荣敏等14 选取3 个冬小麦杂交组合为材料, 以C17 培养基为基本培养基, 分别添加不同浓度的ABA, 结果表明随着ABA浓度的增加对出愈率影响不大, 但分化率和绿苗率均表现先升后降的趋势, 在添加0. 1 mg/ L 浓度的ABA 时, 分化率和绿苗率最高3.2培养条件对小麦花培能力的影响在相同培养基情况下, 不同的培养条件对花培能力的影响也很大。温度是影响花药培养的重要因素, 王培等15, 16 采用5 个温度进行花药诱导率试验, 结果表明诱导花药培养的温度在2830时诱导效率最高。梁辉等17 采用33和36的高温培养不同时间, 再转到28培养, 结果表明24 h 的高温培养可以较大幅度的提高小麦绿苗分化率, 而对愈伤组织诱导率则有明显降低的趋势。宣朴等18 研究了转愈初期短期低温处理对小麦愈伤组织绿苗分化率的影响。结果表明, 在转愈伤组织初期, 采用了4和6低温培养13 d 能大幅度提高小麦花培愈伤组织绿苗分化率, 提高育种效率。在花培期间不同的光暗培养对花药培养能力也有影响, Ekiz H 等19 研究了光照对春小麦花药培养愈伤组织诱导和分化的影响, 结果表明在诱导愈伤培养过程中暗培养愈伤诱导率最高, 而在分化阶段采用15 d 暗培养加7 dgro-lux 光培养, 绿苗分化率最高。愈伤组织的培养时间也影响幼苗的分化率, 崔国惠等20 研究了愈伤组织向分化培养基上转移时间对绿苗分化的影响, 结果表明, 随着花药接种时间的延长, 愈伤组织分化绿苗的能力下降, 花粉愈伤组织向分化培养基上转移的时间以在接种3050 d 内, 选择颜色淡黄, 结构臻密, 直径在2 mm 左右的愈伤组织, 分23 批转移为宜, 这样可以避免愈伤组织绿苗分化潜力的降低。3.3 生长调节物质对愈伤组织诱导的影响 在花药培养过程中, 大部分小孢子退化, 只有少部分小孢子发生分裂形成多核花粉粒, 并进一步产生愈伤组织而撑破花药壁, 这也是产生单倍体植株( 或胚状体) 的前提。培养过程中小孢子的去向主要有4 种: 萎缩、发芽、肥大和产生愈伤组织( 或形成胚) 。大量试验结果证实, 花药离体培养过程中, 生长调节物质配比及含量对愈伤组织的诱导具有重要作用, 显著影响出愈率, 对愈伤的起源有重要调控作用21-233. 4 其他培养基成分对愈伤组织诱导的影响基本培养基种类及各无机成分配比的变化对花药离体培养中愈伤组织的产生有决定性的影响。黄莺等 24 证实, 提高培养基中微量元素倍数或降低大量元素的倍数有利于烟草花培出愈。培养基中的有机成分对愈伤组织的诱导同样具有重要作用。碳源不但提供能源, 还是渗透调节物质, 对培养效果影响明显。 4、 小麦花药培养试管苗的移栽与管理4.1 炼苗 把将要移栽的小麦单倍体试管苗的试管，不要打开瓶塞放在移栽环境下，练苗5-7天；4.2 移栽土壤 移栽前及时整地，翻耕土地，浇足底墒水；4.3移栽方法 经过炼苗的小麦单倍体植株用镊子从试管中取出, 用清水洗净植株基部的培养基并栽人田间, 栽后将根的四周用手指压实, 栽满一个畦后及时浇水,4.4 移栽时间 移栽时间早晚对移栽成活率影响很大。把握在11月20 日左右, 此时气温虽然已降为6 ，但小麦单倍体植株生长在塑料棚内, 温度仍能保持在10.3。小麦分蘖和次生根大量发生最适宜的温度为14 ，这个温度有利于小麦单倍体试管苗的分蘖和次生根的生长, 并能及时从土壤里吸收营养,同时由于移栽温度低也控制了各种病害的浸染。翌年春天气温升至2 3 时揭开塑料棚, 移栽的小麦单倍体植株95% 以上都能成活参考文献1赵广才,何中虎,王德森,等.栽培措施对面包小麦产量及烘烤品质的调控效应J.作物学报,2002,28(6):797802.2于振文.作物栽培学各论M.北京.中国农业出版社,2003,2223.3.李应中.2009年粮食市场情况分析（下）J.中国农业信息,2010(3):3638.4纪军,钟冠昌,李俊明,等.我国优质麦生产现状及品质育种方法J.安徽农业科学,2001,29(6):729730. 5 李思经 国际农业生物技术进展 北京: 中国农业科技出版社, 1997- 56王茂良, 冯慧.花药离体培养研究进展. 北京农学院学报. 2010 年10 月第25卷 第3 期7 欧阳俊闻. 小麦花药培养研究进展, 见: 胡含, 王恒立主编. 植物细胞工程与育种, 北京: 北京工业大学出版社, 1990, 168 王超楠, 冯辉, 姜凤英, 等. 羽衣甘蓝花药培养胚状体诱导初报 J . 中国蔬菜, 2006 ( 6) : 23-4.9 乔奇, 张振亚, 勒秀兰. 消毒方法对草莓花药愈伤组织形成的影响 J . 河南农业科学, 1999 ( 7) : 29.10 申书兴, 赵前程, 刘世雄, 等. 四倍体大白菜小孢子植株的获得与倍性鉴定 J . 园艺学报, 1999, 26 ( 4) : 232-237. 11 周毓君, 朱宝成, 郭明申, 等. 草莓花药愈伤组织的形成及形态发生 J . 园艺学报, 1996, 23 ( 2) : 119-22. 12 王培, 陈玉蓉. C( 17) 培养基在花药培养中应用的研究 J . 植物学报, 1986, 28( 1) : 3845. 13 王培, 陈玉蓉. 固体培养基上浸润培养提高花粉植株诱导率的研究 J . 华北农学报, 1992, 7( 3) : 5965.14 陈荣敏, 温书敏. 脱落酸( ABA) 对小麦花药培养的影响 J . 河北农业大学学报, 1999, 022( 002) : 2426.15 王培, 陈玉蓉. 培养温度对花药愈伤组织诱导率的研究 J . 华北农学报, 1986, 1( 1) : 2025.16 王培, 陈玉蓉. 提高冬小麦花粉植株诱导率的研究 J . 华北农学报, 1986, 1( 1) : 2025.17 梁辉, 欧阳俊闻. 小麦花药培养初期高温处理对培养反应的影响 J . 科学通报, 1997, 42( 13) : 14361439.18 宣朴, 郭元林. 低温对小麦花培愈伤组织绿苗分化率的影响 J . 西南农业学报, 2004, 17( 2) : 146148. 19 E kiz H, Konzak C F. Ef f ect s of ligh t regimes on an ther culture response in bread w heat J . Plant Cell, T issue and Organ culture,1997, 50( 1) : 712.20 崔国惠, 刘志萍. 小麦花培过程中转愈时间对绿苗分化的影响 J . 内蒙古农业科技, 1996, 1: 1011. 21 张冰玉, 苏晓华, 周祥明, 等. 林木花药培养研究进展及展望 J . 植物学通报, 2003, 20 ( 6) : 656-663. 22 张馨宇, 王永成, 刘爱群, 等. 辣椒花药培养研究新进展. 中国农学通报, 2007, 23 ( 8) : 331-334. 23 张玉芳, 岳岚, 何松林, 等. 观赏植物花药培养的主要影响因素 J . 中国农学通报, 2008, 24 ( 6) : 58- 61. 24 黄莺, 刘仁祥, 武筑珠, 等. 活性碳、微量元素、大量元素对烟草花药培养的影响 J . 贵州农业科学, 1999, 27( 4) : 1-5研究方法、内容： 1 材料和方法1.1 试验材料试验材料为河北农业大学小麦育种组配制的5个小麦组合，分别为：12（233），12（238），12（620），12（664）和12（667）。 1.2 方法1.2.1 小麦单倍体的创建 1.2.1.1 接种花药，培养愈伤组织 4月29日5月2日取花粉处于单核靠边期的5个组合小麦的植株幼穗，在无菌操作室内，用0.1%的升汞对幼穗进行表面消毒8分钟，蒸馏水洗去残留升汞。在超净工作台上取小麦花药，接种在培养基表面，置于无菌培养室内避光培养进行脱分化诱导，培养温度为2830。所用脱分化培养基为C17培养基，约20天后陆续长出愈伤组织。1.2.1.2 分化幼苗 花药脱分化培养30天后，待愈伤组织长到直径约1.01.5mm时，将其转入分化培养基中，10天左右可诱导出绿苗。分化培养基用C17+KT 0.5mg/L+NAA 0.2mg/L ，30g/L蔗糖。培养温度在25，光照长度12h/ d，光照强度10000LX。1.2.1.3 生根培养 花粉绿苗长到45cm高时，在超净工作台上将其转入生根培养基中培养，715天后促进根系发达。生根培养基采用MS+KT 0.2mg/L+NAA 0.5mg/L， 80g/L蔗糖，培养温度在25，光照长度12h/ d，光照强度10000LX。1.2.1.4 壮苗培养和移栽 根系发达的小麦苗同转生根培养基方法相同再转入壮苗培养基中。壮苗培养基用1/2MS+KT 0.2mg/L+NAA 0.5mg/L+0.5mg/L矮壮素，80mg/L蔗糖，培养温度在25，光照长度14h/ d，光照强度10000LX。在培养箱中培养23天苗见长后移入春化培养箱，温度8，进行春化培养35天。10月下旬移栽到田间。幼苗移栽时, 需提前35天打开培养瓶的盖子, 置于室温下炼苗, 移栽时需洗去培养基，覆盖塑料膜保温、保湿。1.2.1.5 白化苗培养在C17培养基的基础上，附加0.5mg/L活性炭对小麦白化苗培养，以培养基中不添加活性炭的为对照，观察白化苗变化。1.2.2 小麦单倍体加倍 把移栽的单倍体幼苗置于温棚中进行自然加倍；1.2.3 统计方法主要指标计算方法如下：花粉愈伤组织诱导率（简称出愈率）（%）=花粉愈伤组织总数/接种花药总数100；绿（或白）苗分化率（%）=分化绿（或白）苗数/花粉愈伤组织数100；绿苗诱导率（%）=分化绿苗数/接种花药数100。这里出愈率代表花粉脱分化能力，分化率代表愈伤组织的分化能力，绿苗诱导率代表花粉绿苗的产量。另外，在分化绿苗的愈伤组织中，愈伤组织分化出的白、绿嵌合苗，这一部分愈伤组织计算到分化绿苗的愈伤组织数里。进度安排： 2012年2月-3月：选题，查阅文献资料; 3月-4月：确定方案;2012年5月：收集实验资料，在河北农业大学实验室接种花药；6月-9月：花药的脱分化，再分化，壮苗；10月-11月：分批移栽；2013年1月-4月：幼苗自然加倍5月-6月：撰写论文，准备答辩。指导教师意见：论文选题针对性强，试验材料有代表性，试验方案可行，预期结果明确，同意开题指导教师：年 月 日审 核 小 组 成 员姓 名职 称备 注姓 名职 称备 注开题报告记录：审核小组评语：审核小组组长：（签字）年 月 日学院意见：院长：年 月 日河北农业大学本科毕业论文指导教师评阅书学生姓名：王冬旭 学号：2009014010212专业班级：农学0902班 所在学院：农学院论文题目：小麦花药培养创建DH群体 指导教师评语： 该同学遵守学校的各项规章制度，对工作认真负责，能够较好的完成各项实习任务。学习态度端正，具有较扎实的生物科学基础理论和专业知识。论文对小麦花药培养DH群体的研究，论文选题针对性强，依据充分，具有一定的科学意义和应用价值。实验设计科学合理，研究方法可行，工作量较大，符合本科论文要求，论文写作格式规范，条理清楚，符合一般科技论文写作要求。该生阅读文献资料较多，基本掌握了本学科领域的基础理论和专业知识。论文不足之处：（1） 文中材料和方法部分过于繁琐，部分内容可用一句话概括，使其简单明了（2） 文章参考文献尚需进一步完善（3） 注意文中个别专业词成 绩 评 定：是否同意答辩： 指导教师（签名）： 年 月 日河北农业大学本科毕业论文答辩评分表评分指标分 值评 价 内 容得 分论文选题10选题有重要理论意义或实用价值。立题依据充分。文献引用12阅读、引用文献资料较广泛，较全面了解本领域学术动态，综合分析能力较强。论文难度及工作量14难度较大，工作量大。论文成果的创新性12有独到见解，有较大的创新性成果。理论基础与科研能力16具有坚实的基础理论和系统的专门知识，具有较强的独立从事科研工作的能力，研究方法和技术体系得当。写作能力16条理清楚，层次分明，说理透彻，文笔流畅，表格、绘图准确规范，中外文摘要简明扼要，语句通顺，语法正确，符合科技写作规范。答辩报告10能简明扼要、重点突出地阐述论文或设计的主要内容，有新见解，结论明确；时间掌握恰当。回答问题10思维敏捷，逻辑性强，准确流利地回答各种问题。总 分100注：本表为答辩小组成员评分用表，评分标准参照河北农业大学毕业论文质量评定参考标准河北农业大学 届本科毕业论文答辩记录表所在学院： 专业班级： 时间： 年 月 日学 生 姓 名学 号指导教师姓名职 称毕业论文题目：答 辩 小 组 成 员姓 名职 称成 绩姓 名职 称成 绩答辩小组评语：答辩小组组长：（签字）年 月 日答 辩 成 绩：注：本表与学生毕业论文（设计）一同在学院存档（必须用钢笔书写）小麦花药培养创建DH群体农学专业0902班：王冬旭指导老师：刘桂茹摘要：本文对亲本性状差异较大、来源不同的5个小麦组合的F1代植株进行花药培养，创建DH群体，该群体在遗传学、形态发生学和分子生物学等基础研究提供了丰富的背景和遗传稳定的材料, 而且对于单倍体的育种实践也有重要意义。试验共获得小麦单倍体植株893株，DH植株343，平均出愈率14.58%，绿苗分化率平均为15.74%，平均加倍率为35.5%。研究还表明，在培养基中添加活性炭等改善培养条件，可使白化苗转绿，提高绿苗分化率。 关键词：小麦；花药培养；单倍体，DH群体Creating DH population with anther culture in wheatAbstract: The parental traits among 5 wheat combination greatly, different sources of F1 generation plants in anther culture, create DH group, the population based studies and molecular biology provides the background and rich genetic stability of the material in genetics, morphology, and have an important significance in the practice of haploid breeding. Test of 893 strains of wheat haploid plants were obtained, DH plants are 343, average rate of 14.58%, the green plantlet differentiation rate averaged 15.74%,The average doubling rate was 35.5%. Research also shows that, in the culture improvement of adding active carbon in the medium conditions, can make the albino turned green, increase the frequency of green plantlet differentiation Key words: wheat, anther culture, haploid，DH population单倍体植物在作物育种、遗传分析、基因克隆等领域已得到广泛应用，创建单倍体植物的方法有很多种，而用花药培养技术是创建小麦单倍体行之有效的方法1。小麦是我国主要粮食作物之一，花药培养技术对小麦育种具有突出优点，纯合速度快，后代稳定性好，从而缩短育种年限，提高选择的准确性及可靠性2。花药培养的单倍体群体通过加倍得到的纯合体植株群体即为DH群体（doubled haploid），DH 群体为永久性群体, 不仅可获得常规育种难以或无法得到的新类型，更广泛用于基因图谱构建、分子标记等遗传学研究3， 在构建遗传连锁图及QTL分析上有着突出优势,因为群体中每个个体在遗传上都是纯合的,非常适于连续性资料积累4，5。本研究意在用花药培养技术创建小麦DH群体。1 材料和方法1.1 试验材料试验材料为河北农业大学小麦育种组配制的5个小麦组合，分别为：12（233），12（238），12（620），12（664）和12（667）。 1.2 方法1.2.1 小麦单倍体的创建 1.2.1.1 接种花药，培养愈伤组织 4月29日5月2日取花粉处于单核靠边期的5个组合小麦的植株幼穗，在无菌操作室内，用0.1%的升汞对幼穗进行表面消毒8分钟，蒸馏水洗去残留升汞。在超净工作台上取小麦花药，接种在培养基表面，置于无菌培养室内避光培养进行脱分化诱导，培养温度为28306。所用脱分化培养基为C17培养基，约20天后陆续长出愈伤组织。1.2.1.2 分化幼苗 花药脱分化培养30天后，待愈伤组织长到直径约1.01.5mm时，将其转入分化培养基中，10天左右可诱导出绿苗。分化培养基用C17+KT 0.5mg/L+NAA 0.2mg/L ，30g/L蔗糖。培养温度在25，光照长度12h/ d，光照强度10000LX。1.2.1.3 生根培养 花粉绿苗长到45cm高时，在超净工作台上将其转入生根培养基中培养，715天后促进根系发达。生根培养基采用MS+KT 0.2mg/L+NAA 0.5mg/L， 80g/L蔗糖，培养温度在25，光照长度12h/ d，光照强度10000LX。1.2.1.4 壮苗培养和移栽根系发达的小麦苗同转生根培养基方法相同再转入壮苗培养基中。壮苗培养基用1/2MS+KT 0.2mg/L+NAA 0.5mg/L+0.5mg/L矮壮素，80mg/L蔗糖，培养温度在25，光照长度14h/ d，光照强度10000LX。在培养箱中培养23天苗见长后移入春化培养箱，温度8，进行春化培养35天。10月下旬移栽到田间。幼苗移栽时, 需提前35天打开培养瓶的盖子, 置于室温下炼苗, 移栽时需洗去培养基，覆盖塑料膜保温、保湿7。1.2.1.5 白化苗培养在C17培养基的基础上，附加0.5mg/L活性炭对小麦白化苗培养，以培养基中不添加活性炭的为对照，观察白化苗变化。1.2.2 小麦单倍体加倍 把移栽的单倍体幼苗置于温棚中进行自然加倍；1.2.3 统计方法主要指标计算方法如下：花粉愈伤组织诱导率（简称出愈率）（%）=花粉愈伤组织总数/接种花药总数100；绿（或白）苗分化率（%）=分化绿（或白）苗数/花粉愈伤组织数100；绿苗诱导率（%）=分化绿苗数/接种花药数100。这里出愈率代表花粉脱分化能力，分化率代表愈伤组织的分化能力，绿苗诱导率代表花粉绿苗的产量8。另外，在分化绿苗的愈伤组织中，愈伤组织分化出的白、绿嵌合苗，这一部分愈伤组织计算到分化绿苗的愈伤组织数里。2.结果与分析2.1 小麦花药出愈率试验共接种38313枚花药，培养出愈伤组织5462块，平均出愈率14.58%，5个组合出愈情况见表1。其中以12（620）组合出愈率最高为15.73%，12（238）组合最低为13.12%。表1 5个组合小麦花药出愈率Table 1 5 combinations of Wheat Anther Callus Induction组合名称Group name接种花药数Number of inoculated anthers愈伤组织块数Numbers of callus出愈率Increasing the rate of12（233）543681715.03%12（238）15282200513.12%12（620）6923108915.73%12（664）519870513.56%12（667）547484615.45%2.2 小麦花药愈伤组织幼苗分化率和幼苗诱导率 表2 5个组合小麦花药培养绿苗分化率和绿苗诱导率Table 2 5 combinations of green plantlet differentiation rate of wheat anther culture and Plantlet induction frequency 组合名称Group name分化绿苗数Green seedling differentiation绿苗分化率Green plantlet differentiation rate绿苗诱导率Green plantlet induction rate12（233）698.45%1.27%12（238）32416.16%2.12%12（620）27224.98%3.93%12（664）9213.05%1.77%12（667）13616.08%2.48%试验共获得893株绿苗，绿苗分化率和绿苗诱导率平均为15.74%和2.31%，（表2），以12（620）组合花药愈伤组织幼苗分化率和绿苗诱导率最高，分别为24.98%和3.93%，12（233）组合最低，分别为8.45%和1.27%。不同组合花药愈伤组织幼苗分化率差异明显。2.3 小麦DH获得量及加倍率表3 5个组合小麦DH获得量及加倍率Table 3 5 combinations of wheat DH and the double rate 组合名称Group name分化绿苗数Green seedling differentiationDH数Numb