T∕CACM 1326.26-2019 秋枫种子超低温保存技术规程.pdf

ICS 11.120.01 C 23 团体标准 T/CACM 1326.262019 秋枫种子超低温保存技术规程 Technical code of practice for cryopreservation of Bischofia javanica Bl.seeds 2019-10-17 发布 2019-10-17 实施 中 华 中 医 药 学 会 发 布T/CACM 1326.262019 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 种子的采收及选择.2 4.1 种子采收.2 4.2 种子选择.2 5 种子前处理.2 5.1 活力.2 5.2 含水量范围.2 6 种子保存量.3 7 种子冷冻方式.3 8 恢复培养.3 8.1 种子解冻处理.3 8.2 冻后种子活力检测.3 8.3 萌芽成苗.3 附录 A（规范性附录）BTB 的配制和保存方法.4 参考文献.5 T/CACM 1326.262019 II 前 言 本标准是药用植物顽拗性种子超低温保存系列标准之一，该系列标准结构和名称如下：T/CACM 1326.1 药用植物顽拗性种子超低温保存技术通则；T/CACM 1326.2 白木香种子超低温保存技术规程；T/CACM 1326.3 降香种子超低温保存技术规程；T/CACM 1326.4 益智种子超低温保存技术规程；T/CACM 1326.5 高良姜种子超低温保存技术规程；T/CACM 1326.6 朱砂根种子超低温保存技术规程；T/CACM 1326.7 草豆蔻种子超低温保存技术规程；T/CACM 1326.8 化州柚种子超低温保存技术规程；T/CACM 1326.9 樟种子超低温保存技术规程；T/CACM 1326.10 两面针种子超低温保存技术规程；。本标准按照 GB/T 1.12009标准化工作导则 第 1 部分：标准的结构和编写给出的规则起草。本标准由中国医学科学院药用植物研究所海南分所提出。本标准由中华中医药学会归口。本标准起草单位：中国医学科学院药用植物研究所海南分所、中国医学科学院药用植物研究所。本标准主要起草人：曾琳，魏建和，郑希龙，李榕涛，王秋玲，何明军，金钺，顾雅坤，符丽。T/CACM 1326.262019 1 秋枫种子超低温保存技术规程 1 范围 本标准规定了秋枫（Bischofia javanica Bl.）种子超低温保存过程中的术语和定义、种子的选择、种子前处理、种子保存量、种子冷冻方式、恢复培养等内容。本标准适用于秋枫种子的超低温长期贮藏。2 规范性引用文件 下列文件对本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 3543.6 农作物种子检验规程 水分测定 GB/T 3543.7 农作物种子检验规程 其他项目检验 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 秋枫 Bischofia javanica Bl.为大戟科（Euphorbiaceae）秋枫属（Bischofia Bl.）常绿乔木，别称万年青树、重阳木。是热带和亚热带常绿季雨林中的主要树种。根有祛风消肿作用，主治风湿骨痛、痢疾等。收载于全国中草药汇编（卷二）（2014）。3.2 秋枫果实 Bischofia javanica Bl.fruits 果实浆果状，圆球气形或近圆球形，直径 6 mm13 mm，淡褐色，内有种子 36 粒。3.3 秋枫种子 Bischofia javanica Bl.seeds 秋枫的播种材料为完整种子，贮藏特性判断为顽拗性种子。种子淡黄色，长圆形，长约 5 mm。3.4 种子超低温保存 seed of cryopreservation 将经过前处理的秋枫种子置于液氮（-196）中保存。T/CACM 1326.262019 2 4 种子的采收及选择 4.1 种子采收 8 月10 月间，待果皮呈棕褐色时即可采收。采收后，堆沤 45 d，待种皮软化，洗去皮肉，选出种子晾干。4.2 种子选择 挑选发育饱满、均匀、健康的种子，置于 10 冰箱中保存备用（存放时间不超过 3 个月）。5 种子前处理 5.1 活力 5.1.1 检测 秋枫种子活力以种子生活力为判别标准。按照植物生理学实验指导中的溴麝香草酚蓝（BTB）法检测秋枫种子生活力。待测种子在 30 35 温水中浸种 2 h，随后取吸胀种子 20 粒，整齐地埋于备好的 1.5 BTB 琼脂凝胶中，注意要将胚埋入凝胶中。将培养皿置于 35 温箱中 18 h 后观察结果。BTB 的配制和保存方法见附录 A。5.1.2 鉴定及要求 在光下用放大镜对染色结果进行观察鉴定。凡种胚周围出现黄色晕圈的种子为有活力的种子，否则为无活力的种子。待保存的秋枫种子生活力应 70。5.1.3 计算 生活力按照公式（1）进行计算：式中：A生活力；y有活力的种子数；x总的种子数。5.2 含水量范围 用尼龙网袋包裹秋枫种子，置于盛有变色硅胶的干燥器内，硅胶与种子的体积比为 60:1，室温条件下干燥处理 0 h8 h，在干燥过程中定期测定种子含水量，将种子含水量由 1825 降至 1418。按照 GB/T 3543.6 中的高恒温烘干法（130 烘干 1 h）测定种子含水量（W0），按照公式（2）进行计算。T/CACM 1326.262019 3 式中：W0含水量，用百分数表示（）；M1种子鲜重，单位为克（g）；M2种子烘后重量，单位为克（g）。6 种子保存量 秋枫种子保存量不少于 500 粒，以便后期的生活力检测使用。7 种子冷冻方式 秋枫种子超低温保存的冷冻方式为直接冷冻法，即将待保存的秋枫种子放入 2 mL 冻存管（每管 50 粒种子）中，迅速投入液氮中保存。8 恢复培养 8.1 种子解冻处理 液氮中至少冻存 24 h 后，取出 1 个冻存管，立即放入 40 水浴中快速解冻 2 min。8.2 冻后种子活力检测 取出 25 粒解冻后的种子，按照 5.1 活力检测方法，进行超低温保存后的初始生活力检测。当种子生活力 50 时视为保存成功。8.3 萌芽成苗 将剩下 25 粒解冻后的秋枫种子，播种到带有无菌滤纸的发芽盒中，温度 25 30，湿度7085 条件下培养。秋枫种子出芽周期大概 25 d。T/CACM 1326.262019 4 A A 附 录 A（规范性附录）BTB 的配制和保存方法 A.1 BTB 的保存方法 精密称取 BTB 0.1 g，溶解于煮沸过的 100 mL 纯水中，然后用滤纸去残渣。滤液若呈黄色，可加数滴氢氧化钠溶液，使之变为蓝色或蓝绿色，置于棕色瓶中长期贮存。A.2 1.5 BTB 琼脂凝胶配置方法 称量 0.1 BTB 溶液 40 mL 置于烧杯中；称取 0.5 g 琼脂，将其剪碎后加入杯中；加热并不断搅拌使之完全溶解；待溶液稍稍冷却即可趁热倒入 9 cm 培养皿中，使之成一均匀的薄层，完全冷却后备用。B T/CACM 1326.262019 5 参 考 文 献 1 王国强等.全国中草药汇编（卷二）M.北京，人民卫生出版社，2014：741 2 中 国 科 学 院 中 国 植 物 志 委 员 会.中 国 植 物 志.第 44(1)卷 M.科 学 出 版社,2004(1994):185.3 Li Ping-tao,Chiu Hua-hsing.et al.EuphorbiaceaeM/Flora Of China Beijing:Science Press/St.Louis:Missouri Botanical Garden Press.2008.11:217-218.4 傅家瑞，宋松泉.顽拗性种子生物学M.中国科学文化出版社，2004:1 5 Reed BM.Plant CryopreservationA Practical GuideM.Springer,2010:3 _