昆明地区儿童头癣临床特征与病原菌分子生物学研究.pdf

论著227皮肤病与性病 2023 年 8 月第 45 卷第 4 期 Dermatology and Venereology，Aug.2023，Vol.45，No.4【通信作者】李红宾，E-mail：【基金项目】云南省科技厅-昆明医科大学联合基金重点项目（202101AY070001-022）；云南省高层次人才培养支持计划名医专项（YNWR-MY-2019-026）【收稿日期】2023-04-20论著昆明地区儿童头癣临床特征与病原菌分子生物学研究曾跃芬1，2，郭艳琼1，董天祥1，黄云丽1，张碧志1，杨正慧1，李红宾1（1.昆明医科大学第一附属医院皮肤科，云南昆明650032；2.玉溪市人民医院皮肤科，云南玉溪653100）【摘要】目的通过研究昆明地区近期儿童头癣病例的临床特症与病原菌分子生物学，明确本地区儿童头癣感染特征，为儿童头癣临床诊疗与预防提供新的依据。方法收集2021年3月至2022年3月到昆明医科大学第一附属医院就诊的014岁头癣病例，用自制调查表收集病例临床信息，进行常规真菌镜检及培养。采用真菌通用引物 ITS1 和 ITS4 对 16 例真菌培养阳性病例的致病菌和 3 株同期收集的来源于成人体股、手癣病例的犬小孢子菌进行 rDNA 的 ITS 区 PCR 扩增并测序，将碱基序列通过 Sequencher 软件拼接，利用 BLAST 与 Genebank 数据库比对进行菌种鉴定；各个菌株序列使用 CLUSTAL序列分析软件进行多重比较，再通过 Mega 软件构建 N-J 系统树。结果共收集 26 例儿童头癣病例，男 16 例，女 10例，平均年龄 5 岁 7 个月。年龄段分布 0 3 岁 5 例（19.23%），4 6 岁 14 例（53.85%），7 9 岁 4 例（15.38%），10 14 岁 3 例（11.54%），大部分患儿为 4 6 岁儿童。可疑感染途径调查结果有动物接触史 13 例（50.00%），家长有癣病史 3 例（11.54%），自身患有其他癣病 1 例（3.85%）。本地区此次收集的病例，头癣临床类型仅见白癣和脓癣（白癣17 例，占 65.38%；脓癣 9 例，占 34.62%），无黄癣和黑癣。所有病例真菌镜检全部阳性，真菌培养阳性 16 例，培养阳性率 61.54%。培养阳性 16 株致病菌株中，用引物 ITS1 和 ITS4 扩增失败 3 株，其余 13 株分别鉴定为犬小孢菌 11 株、指（趾）间毛癣菌株 1 株、内弯节皮菌 1 株。结论本地区儿童头癣好发于 4 6 岁，男性多于女性，临床类型以白癣为主，近半数病例有宠物接触史。犬小孢子菌仍然是本地区儿童头癣的主要病原菌，传染源有可能来自动物或人。【关键词】儿童头癣；临床特征；分子生物学；研究中图分类号：R756.1文献标志码：Adoi：10.3969/j.issn.1002-1310.2023.04.001Study on clinical characteristics and molecular biology of pathogens of tinea capitis in children in KunmingZENG Yuefen1，2，GUO Yanqiong1，DONG Tianxiang 1，HUANG Yunli 1，ZHANG Bizhi 1，YANG Zhenghui 1，LI Hongbin 1（1.Department of Dermatology，The First Affiliated Hospital of Kunming Medical University，Kunming，Yunnan 650032；Dermatology Department of Yuxi Peoples Hospital，Yuxi，Yunnan 653100）【Abstract】ObjectiveTo clarify the characteristics of tinea capitis infection in children in Kunming by studying the clinical features and pathogen molecular biology of recent cases of tinea capitis.To provide a new basis for clinical diagnosis，treatment and prevention of tinea capitis in children.Methods The cases of tinea capitis aged from 0 to 14 years old at the first affiliated Hospital of Kunming Medical University from March 2021 to March 2022 were collected with self-made questionnaire,and routine fungal microscopic examination and culture.The pathogenic bacteria of 16 fungal culture positive cases and 3 strains of Microsporum canis collected from adult human femoral and hand tinea cases at the same time were amplified by PCR of rDNA ITS region and sequenced by using universal fungal primers ITS1 and ITS4.The base sequences were spliced by Sequencher software，and the strains were identified by BLAST and Genebank database.The sequences of each strain were compared by CLUSTAL sequence analysis software，and then the Nmurj system tree was constructed by Mega software.ResultsA total of 26 children with tinea capitis were collected，including 16 males and 10 females，with an average age of 5 years and 7 months，5 cases aged 0 3 years（19.23%），14 cases aged 4 6 years（53.85%），4 cases aged 7 9 years（15.38%）and 3 cases aged 10 14 years（11.54%）.Most of the children were 4 6 years old.The investigation results of suspected infection routes showed that 13 cases（50.00%）had a history of animal contact，3 cases（11.54%）had a history of tinea in their parents，and 1 case（3.85%）had other tinea.Among the cases collected in this area,the clinical types of tinea capitis were only white tinea and pus tinea（17 cases of white tinea，accounting for 65.38%，9 cases of pus tinea，34.62%），and no yellow tinea and black tinea.Fungal microscopic examination was positive in all cases，fungal culture was positive in 16 cases，and the culture positive rate was 61.54%.Among the 16 strains with positive culture，3 strains failed to be amplified by primer ITS1 and ITS4，and the other 13 strains were identified as 11 strains of Microsporum canis，1 strain of tinea interphalangeal and 1 strain of Arthroderma endodermis,respectively.ConclusionTinea capitis is common among children in this area at the age of 4 6 years old，with more males than females.The main clinical type is tinea albino，and nearly half of the cases 228论著皮肤病与性病 2023 年 8 月第 45 卷第 4 期 Dermatology and Venereology，Aug.2023，Vol.45，No.4头癣（Tinea capitis）是皮肤癣菌感染引起的头皮和头发的感染性疾病，是儿童最常见的真菌感染性疾病1。该病主要通过直接或间接接触患者或患病的动物而传染2-3，由皮肤癣菌感染所致的强烈的炎症反应将造成瘢痕和永久性脱发，严重影响患儿身心健康4。头癣的发病状况受社会经济、地理位置、气候特征、生活习惯及人群流动等诸多因素的影响，因此，不同地区头癣的发病状况不同，即便是相同地区，由于生活习惯和医疗卫生状况的改变，以及人群流动增加，头癣的流行病学也不断发生改变。昆明地处我国西南高原地区，具有典型的高原季风气候，四季变化不明显，气候干燥、日照强烈，湿度相对较低。另一方面，昆明被誉为“春城”，又是旅游热点，人群流动大，因此，昆明地区儿童头癣发病率呈现波动趋势。我们团队前期研究发现，20012010 年儿童头癣发病率位居本地区儿童浅部真菌感染性疾病的首位5，随后的十年（20112020）中虽然下降至第三位，但仍有较高的发病率6，进一步研究本地区儿童头癣的流行状况，对于儿童头癣的预防与治疗具有指导意义。真菌镜检阳性可以诊断为真菌感染，但不能明确致病菌的种类，既往有学者运用传统的真菌形态分类来诊断致病菌的种类，但真菌的形态特征复杂，而且少数菌落形态特征和生理生化指标随着环境的变化而不稳定，因此，在传统的真菌分类中常引起分类系统的不稳定或意见分歧7，形态学可作为初步诊断，分子生物学鉴定能准确的鉴定出菌株种类，并且准确率较高。头癣致病菌主要为丝状菌，丝状菌生长缓慢，导致鉴定时间长，不能及时、快速诊断及对症治疗8。对于这种生长缓慢的致病菌 PCR特别适合运用其中9，已有学者使用真菌通用引物ITS1 和 ITS4 来鉴定丝状真菌，得到快速、准确的结果10。头癣患者起病慢，病情发展迅速，我们采用ITS1、ITS4 为引物，PCR 扩增的方法来明确菌种是非常有必要的，不仅能为治疗提供有效依据，还应用“CLUSTAL”序列与其他部位同种病原菌共建进化树，分析各个菌株之间的亲缘性，了解可疑感染途径。1资料与方法1.1病例资料2021 年 3 月 2022 年 3 月在昆明医学院第一附属医院皮肤科门诊就诊的儿童头癣患者。纳入标准：同时符合下面条件者可纳入研究：年龄小于 14 岁，有典型头癣临床表现11且真菌镜检阳性者；同意加入项目研究并签署知情同意告知书。使用自制调查表，对入选患者进行临床基础信息及诱发因素调查，包括性别、年龄、主要临床表现、病程、生活环境、有无其他癣病史、发病前有无理发史、父母有无癣病史、有无动物接触史等既往相关病史。1.2真菌镜检及培养取患儿头癣皮损区皮屑及病发用真菌荧光染液镜检，找到菌丝和/或大量孢子为阳性。真菌培养取皮损区皮屑及病发接种于沙氏培养基上（4%葡萄糖 40.0g/L，1.8%琼脂 10.0g/L，1%蛋白胨 18.0g/L，氯霉素 0.05g/L，放线菌酮 0.5g/L）于26恒温培养，菌种鉴定依据真菌形态学和生化特性鉴定12，14 天无生长判为阴性。1.3病原菌分子生物学鉴定1.3.1DNA 的提取实验菌株在 YPD 培养基 37培养 24h 48h 活化后收集菌体，采用 CTAB 法使用HP 真菌 DNA 小量抽提试剂盒（OMEGA）提取实验菌株 DNA，按照试剂盒操作说明进行。1.3.2ITS 区扩增用 ITS1 和 ITS4 做通用引物，ITS1：5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3，ITS4：5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3。PCR 反应体积为25L，包括引物 ITS1 及 ITS4 各 1L，模板 DNA 1L，Premix 12.5L 及 ddH2 O9.5L。PCR 反应条件为：95预变性 5min，93变性 1min，50退火1min，72延伸1min，40个循环，72延伸7min，4保存。反应结束以后，将产物置于-20冰箱内冷冻保存。1.3.3碱基序列测定用 1%琼脂糖凝胶电泳检测ITS1、ITS4 PCR 扩增产物正反引物进行 DNA 碱基序列测定。1.3.4BLAST序列比对培养所得菌株的 ITS 区DNA 碱基序列测定结果提交至 Genbank 数据库进行BLAST 比对，与已报道的菌株 ITS 序列相比对进行菌种鉴定。1.4统计学方法用 SPSS17.0 软件进行数据处理及分析。计数资料采用 n（%）描述。2结果2.1一般资料共收集儿童头癣病例 26 例，男性 16例，女性 10 例，男女比例为 1.6 1，年龄 2 岁11岁，平均年龄 5 岁 7 个月；年龄段分布 03 岁有 5例（19.23%），46 岁有 14 例（53.85%），79岁有 4 例（15.38%），1014 岁 3 例（11.54%），以 46 岁为主。病程 10d 至 2 年，平均 4.2 月。26have a history of pet contact.Microsporum canis is still the main pathogen of tinea capitis in children in this area，and the source of infection may come from animals or people.【Key words】Tinea capitis in children；Clinical characteristics；Molecular biology of pathogens；Study论著229皮肤病与性病 2023 年 8 月第 45 卷第 4 期 Dermatology and Venereology，Aug.2023，Vol.45，No.4例儿童头癣病例中有动物接触史 13 例（50.00%），家长有癣病史 3 例（11.54%），自身患有其他癣病 1例（3.85%）。5 例患儿在我院就诊前经过抗真菌药物系统治疗，4 例口服特比萘芬，1 例口服伊曲康唑。2.2 临 床 类 型 儿 童 头 癣 病 例 白 癣 17 例，占65.38%，脓癣 9 例，占 34.62%，无黑癣和黄癣。白癣主要表现为脱发、鳞屑及红斑，见图 1。脓癣临床表现为脱发、脓疱、结节和脓肿，见图 2。图 1白癣病例皮损特点，可见脱发、鳞屑及红斑图 2脓癣病例皮损特点，可见脱发、脓疱、结节及脓肿2.3真菌镜检与培养结果26 例儿童头癣真菌镜检阳性，均为发外孢子和菌丝，未见发内孢子和菌丝。真菌培养阳性 16 例见图 4，培养阳性率 61.54%。2.4病原菌鉴定结果26 例头癣中，真菌培养出 16株皮肤癣菌，分子生物学鉴定为犬小孢子菌 11 株，1 株指（趾）间毛癣菌，1 株内弯节皮菌，另有 3 株PCR 扩增失败，经形态学鉴定为犬小孢子菌，见表 1。2.5儿童头癣菌种鉴定结果与临床类型分布14 株犬小孢子菌白癣 12 株（100%），脓癣病原菌分布相对分散，犬小孢子菌 2 株（50%），指（趾）间毛癣菌 1 株（25%），内弯节皮菌 1 株（25%），见表 2。表 1儿童头癣病原菌分子生物学鉴定结果编号样品名称临床编号 样本取材部位PCR 结果1362头部犬小孢子菌21698头部犬小孢子菌31863头部犬小孢子菌41906头部犬小孢子菌52028头部犬小孢子菌62136头部犬小孢子菌72992头部犬小孢子菌83049头部犬小孢子菌94155头部犬小孢子菌104169头部Arthroderma incurvatum 内弯节皮菌114547头部指（趾）间毛癣菌124847（BH15）头部犬小孢子菌136318（BH20）头部犬小孢子菌表 2头癣临床类型与相应致病菌菌种分析n（%）临床类型例数犬小孢子菌指（趾）间毛癣菌内弯节皮菌白癣1212（100%）00脓癣42（50%）1（25%）1（25%）合计1614112.6儿童头癣犬小孢子菌与来自体股癣和手癣犬小孢子菌进化树，见图 3图 3头癣的犬小孢子菌与来自体股癣和手癣的进化树图 3 显示，来自儿童头癣的犬小孢子菌分成两个分支，两个分支之间相差 2%，分支内的菌株具有极高的亲缘性。来自股癣和体癣的 H12 和 H19 犬小孢子菌位于第一分支，来自手癣的犬小孢子菌 H7 分布在另一分支，3 株非头癣来源的犬小孢子菌在分支内与其他菌株具有非常相近的亲缘性。230论著皮肤病与性病 2023 年 8 月第 45 卷第 4 期 Dermatology and Venereology，Aug.2023，Vol.45，No.43讨论头癣是儿童常见的浅部真菌感染性疾病，通过接触可由头癣患者和皮肤癣菌感染动物直接感染，也可通过接触感染者用过的梳子、帽子、理发工具等生活用品及动物毛皮而间接传染，因此，头癣有时会在学校、幼儿园等儿童聚集等场所流行15-16，尤其是经济、卫生条件较差的地区17-18。由于不同地区地理气候条件、生活习惯及卫生条件的不同，头癣的发病率、临床类型、病原菌种类都存在较大的差异。国内多数地区报道，头癣的病原菌以犬小孢子菌为主19。2011 年我们研究团队对昆明地区 20072010 年来儿童头癣的流行状况研究发现，本地区的致病菌以亲动物性的犬小孢子菌为主，并通过分子生物学方法证实，引起儿童头癣的犬小孢子菌主要来自狗和猫，其次是亲人性的铁锈色小孢子菌，致病真菌可能来源于患儿密切接触的伙伴20。20012010 年，头癣是昆明地区儿童浅部真菌第一位的病种，铁锈色小孢子菌成为第一位病原菌，占 66.67%；犬小孢子菌仅占 27.78%5。近 10 年本地区头癣发病率明显下降，体癣和足癣超过头癣，儿童头癣下降至第三位，对昆明地区儿童头癣发病现状、临床特征、病原菌进行深入的研究很有必要。此次调查显示，头癣患者男性多于女性，男女为 1.6 1，与多数文献报道相符21-25，年龄分布以 46 岁学龄前期为主。头癣根据临床表现分为四型：黄癣、白癣、黑点癣和脓癣，此次调查本地区儿童头癣临床类型仅有白癣和脓癣，以白癣为主，占 65.38%，无黑点癣和黄癣。国内多数地区报道头癣临床分型主要以白癣为主，但同时存在脓癣和黑点癣。少部分地区如湖北、武汉和新疆，黑点癣比例较高，主要病原菌为紫色毛癣菌26-27，宁夏银川部分地区则主要是脓癣（占 72.40%）28。近 20 年，亲动物性皮肤癣菌是我国大部分地区头癣的主要病原菌，宠物的接触是重要的传播途径17等。此次调查的 26 个病例中 13 例（50%）有动物接触史，传染源很有可能来自动物，病原菌鉴定结果也支持此推断。真菌培养的 16 株儿童头癣病原菌均为亲动物性皮肤癣菌，14 株为犬小孢子菌，1 株指（趾）间毛癣菌（须癣毛癣菌复合体中的亚种），1 株内弯节皮菌（石膏小孢子菌亚种）。为进一步寻找传染源，我们选择了 3 株同时期就诊成年患者体癣、股癣和手癣分离的犬小孢子菌，与头癣分离的犬小孢子菌一起构建了进化树。进化树分为 2 个分支，分离自体癣和股癣的 2 株犬小孢子菌分布于第 1 分支，来自手癣的犬小孢子菌位于第 2分支，分支内菌株之间亲缘性极近，因此推测，感染儿童的病原菌亦有可能来自家人和玩伴。参考文献：1 Nguyen CV，Collier S，Merten AH，et al.Tinea capitis：A single-institution retrospective review from 2010 to 2015J.Pediatr Dermatol，2020，37（2）：305-310.2 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