抗、感品种棉花根系分泌物对尖孢镰刀菌生长及基因表达的影响.pdf

生物技术通报研究报告：BIOTECHNOLOGYBULLETIN2023,39(9):156-167抗、感品种棉花根系分泌物对尖孢镰刀菌生长及基因表达的影响娄慧朱金成杨洋张薇（石河子大学农学院新疆生产建设兵团绿洲生态农业重点实验室，石河子8 32 0 0 3）摘要：为探究抗、感品种棉花根系分泌物对尖孢镰刀菌生长及基因表达的影响，以棉花感病品种新海14号（XH-14）和抗病品种新海41号（XH-41）为材料，将棉花根系分泌物与尖孢镰刀菌（F327）共培养，观察尖孢镰刀菌的生长；取培养0、6、12、2 4和48 h样本，进行RNA-seq。结果表明，与XH-41根系分泌物处理的菌落相比，XH-14根系分泌物处理的菌落生长速率快、孢子萌发率高、产孢量显著增加。GO（g e n e o n t o l o g y）分析发现，XH-14根系分泌物处理的差异表达基因（differentialy expressedgenes,DEGs）主要富集在氨基酸转运、脂肪酸生物合成过程、膜的组成部分、离子通道活性；XH-41根系分泌物处理的DEGs主要富集在跨膜转运、三羧酸循环、膜的组成部分、ATP酶活性。KECG（K y o t o e n c y c l o p e d i a o f g e n e s a n d g e n o me s）分析发现，XH-14根系分泌物处理的DEGs主要富集在TCA循环、类胡萝卜素生物合成、谷胱甘肽代谢、核黄素代谢等代谢通路；XH-41根系分泌物处理的主要DEGs富集在碳代谢、其他聚糖降解、脂肪酸代谢、ABC运输工具等代谢通路。综合分析结果，获得2 4个与细胞壁降解酶相关的基因，其中感病品种棉花根系分泌物处理6 h下“水解酶活性、水解0-糖基化合物”基因富集数目最多。研究结果为筛选棉花枯萎病菌潜在的关键致病基因奠定基础，为棉花枯萎病的防控提供理论依据。关键词：棉花；根系分泌物；尖孢镰刀菌；RNA-seq；枯萎病；差异表达基因；细胞壁降解酶D0I:10.13560/ki.biotech.bull.1985.2023-0284Effects of Root Exudates in Resistant and Susceptible Varieties ofCotton on the Growths and Gene Expressions of Fusarium oxysporumLOU Hui ZHU Jin-cheng YANG Yang ZHANG Wei(Key Laboratory of Oasis Eco-agriculture of Xinjiang Production and Construction Corps,College of Agronomy,Shihezi University,Shihezi832003)Abstract:This work aims to investigate the effects of root secretions in resistant and disease-susceptible varieties of cotton on the growthsand gene expressions of Fusarium oxysporum.The cotton susceptible variety Xinhai 14(XH-14)and the disease-resistant variety Xinhai 41(XH-41)were used as materials,and the cotton root secretion and Fusarium oxysporum(F327)was co-cultured to observe the growth of thebacteria;and the samples were taken at O,6,12,24 and 48 h of incubation and RNA-seq was performed.The results showed that the coloniestreated with the XH-14 root exudates grew faster,their spore germination rate was higher,and the sporulation significantly increased,whencompared with the colonies treated with XH-41 root secretion.GO(Gene Ontology)analysis revealed that the differentially expressed genes(DEGs)of colonies treated with XH-14 root secretion were mainly enriched in amino acid transport,fatty acid biosynthetic process,membranecomponents,and ion channel activity.The DEGs under XH-41 root secretion treatment were mainly enriched in transmembrane transport,tricarboxylic acid cycle,membrane components,and ATPase activity.KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)analysis uncoveredthat DEGs under XH-14 root secretion treatment were were mainly enriched in metabolic pathways such as TCA cycle,carotenoid biosynthesis,收稿日期：2 0 2 3-0 3-2 9基金项目：国家自然科学基金项目（3156 0 40 7）作者简介：娄慧，女，硕士，研究方向：棉花分子育种；E-mail:通讯作者：张薇，女，博士，教授，研究方向：棉花分子育种；E-mail:zhw_2023,39(9)glutathione metabolism and riboflavin metabolism.The main DEGs under XH-41 root secretion treatment were enriched in metabolic pathwayssuch as carbon metabolism,other glycan degradation,fatty acid metabolism and ABC transporters.The results of the comprehensive analysisshowed that 24 genes related to cell wall degradation enzymes were obtained,among which the largest number of genes were enriched in“hydrolaseactivity,hydrolysis of O-glycosyl compounds under 6 h of root secretion treatment in the susceptible cotton varieties.The results of this studyprovide a basis for screening potential key pathogenic genes of cotton wilt fungus and provide a theoretical basis for the prevention and control ofcotton wilt.Key words:cotton;root exudates;Fusarium oxysporum;RNA-seq;Fusarium wilt;differentilly expressed genes;cell wall degradingenzyme棉花（Gossypium spp.）是我国最重要的纤维经济作物之一，同时也是重要的油料作物，2 0 2 2年全国植棉面积为30 0 0.3千hm。新疆是中国最大的棉花生产地区，2 0 2 2 年占全国棉花总种植面积的8 3.2 2%（国家统计公报，http:/ oxysporum f.sp.vasinfectum,Fov),，由于其病原菌顽强、传播迅速，危害极大，一旦发生难以治愈【2 。尖孢镰刀菌通常从棉花的根尖或根部伤口人侵，在人侵棉花的过程中，孢子或微菌核受到棉花根系分泌物的刺激萌发，因此棉花根系分泌物与尖孢镰刀菌致病密切相关2-3。Jia等4 研究发现，连作马铃薯（SolanumtuberosumL.）根系分泌物会促进尖孢镰刀菌菌丝生长和孢子繁殖，同时增强其致病性，导致连作马铃薯枯菱病发生。Yang等5通过比较抗、感香蕉（MusananaLour.）品种培养液对香蕉枯萎病菌Foc4根系定殖的影响发现，抗、感品种根系分泌物中有机酸组分存在明显差异，分析表明抗病品种具有促进拮抗菌生长，且抑制病原菌定殖的作用。Li等6 通过对不同抗性西瓜Citr-ulluslanatus（T h u n b.）M a t s u m.品种根系分泌物研究发现，感病品种根系分泌物可促进尖孢镰刀菌菌丝生长、孢子萌发，抗病品种根系分泌物则具有抑制作用。转录组学是一门在整体水平上研究细胞中基因转录的情况及转录调控规律的学科，从RNA水平娄慧等：抗、感品种棉花根系分泌物对尖孢镰刀菌生长及基因表达的影响河子大学农学院棉花分子育种实验室保存。1.2方法1.2.1棉苗的种植将棉花种子浸泡在7 5%酒精中消毒10 min，用蒸馏水冲洗3次。将其铺至有3层157研究基因的表达情况。目前已被应用于尖孢镰刀菌生长发育和致病过程中的基因表达分析-。Yang等5】通过对香蕉尖孢镰刀菌（F.oxysporumf.sp.cubense）的转录组分析发现，氨基糖代谢通路对于厚垣孢子的形成具有关键作用。Lu等9 通过高通量转录组测序分析发现，磷脂酶D信号通路受到抑制，可能会导致黏团专化型尖孢镰刀菌生理1号小种（F.oxysporumf.sp.conglutinans）菌丝生长缓慢、致病力减弱。Sun 等10 研究发现,番茄尖孢镰刀菌(F.oxysporumf.sp.lycopersici）转录因子FolCZF1的转录水平在分生孢子和早期侵染阶段上调表达，进一步通过基因敲除获得的FolCZF1突变体菌株在生长速度、产孢、分生孢子形态以及致病力等方面均表现出缺陷，表明FolCZF1为其生长发育所必需。虽然这些研究在一定程度上揭示了尖孢镰刀菌生长发育及其致病的分子机制，但关于不同棉花品种的根系分泌物对尖孢镰刀菌基因表达的影响仍未见报道。本研究通过抗、感棉花品种根系分泌物与枯萎病菌的共培养，探究根系分泌物对棉花枯萎病菌生长的影响，同时对差异表达基因（DEGs）进行GO功能注释和KEGG富集分析，从转录水平对其相互作用机制进行探讨，为筛选潜在的关键致病基因及棉花枯萎病的防治奠定理论基础。1材料与方法1.1材料棉花感病品种新海14号（XH-14）和抗病品种新海41号（XH-41），枯菱病菌株（F327）均由石158生物技术通报BiotechnologyBulletin2023,Vol.39,No.9纱布的发芽盒内生长至脱壳，用海绵包裹棉花根系穿过35孔泡沫板，防止根系受到伤害，然后将泡沫板放于装有5L霍格兰营养液的塑料盆中，同时使用氧气泵连续通氧。45d后获得根系分泌物粗收集液，经定容、过滤后调整浓度为0.2 g/mL（指每mL收集液中含0.2 g鲜根重的根系分泌物）。1.2.2尖孢镰刀菌样本的制备采用查氏培养基培养Fov分生孢子，在2 5、2 2 0 r/min黑暗条件下培养5d后，进行过滤，收集新鲜的分生孢子用于根系分泌物的培养。称取0.5g分生孢子悬浮在10 mL根系分泌物水溶液中，在2 5、2 2 0 r/min条件下进行培养，于培养后6、12、2 4和48 h分别离心收集菌体。液氮速冻后于-8 0 冰箱保存，用于转录组测序。选取Oh的Fov样本，标记为FO；感病品种XH-14根系分泌物培养的Fov，分别标记为G6、G12、G 2 4和G48；抗病品种XH-41根系分泌物培养的Fov，分别标记为K6、K 12、K 2 4和K48；水培养的Fov，分别标记为W6、W 12、W 2 4和W48。共13个样本，每个处理2 个生物学重复，共构建2 6个文库。1.2.3根系分泌物对尖孢镰刀菌生长的影响1.2.3.1根系分泌物对菌丝生长的影响将马铃薯培养基倒人玻璃培养皿中，冷却凝固，将2 mL根系分泌物水溶液在培养基表面涂抹均匀。待分泌物浸人培养基表面后，用灭菌的5mm打孔器在菌落上制作菌饼，接种于培养基中心位置，每皿1个菌饼，每个处理3个重复，以不加根系分泌物的培养基作为对照（CK），每个处理组设置3个重复。倒置于人工气候箱中（温度2 8，相对湿度7 5%）暗培养3、5、7 d，利用十字划线法测定菌落直径。1.2.3.2根系分泌物对孢子萌发的影响将0.5mL孢子混悬液与等量根系分泌物水溶液滴于凹玻片，放于恒温箱（2 8）培养2、4、6、8 和10 h，并统计孢子萌发数，以无菌水为对照（CK），每个处理组设置3个重复。1.2.3.3根系分泌物对菌生物量的影响将直径5mm同龄等量的菌饼分别接种于抗、感品种根系分泌物培养基上，每个处理组设置6 次重复。将培养皿倒置于恒温箱（2 8）培养3、5、7 d，干重比色法测定菌的生物量。1.2.4根系分泌物培养尖孢镰刀菌的转录组分析1.2.4.1RNA的提取采用Tiagen公司RNAsimpletotal RNA提取试剂盒提取Fov中的总RNA。1.2.4.2RNA测序文库的创建测序RNA测序文库的创建和测序工作均由北京百迈客生物科技有限公司完成，使用Illumina HiSeq TM4000测序仪进行测序。1.2.4.3RNA测序数据的分析及差异表达基因的筛选通过HISAT软件将Clean reads比对Fov的参考基因组（https:/fungi.ensembl.org/Fusarium_ox-ysporum_f_sp_vasinfectum_25433_gca_000260175/ln-fo/Index），统计Reads在参考基因组上的分布和覆盖率，并对其进行FPKM转换，从而获得全部基因的表达水平。再用DEGseq进行差异分析，筛选阈值为qvalue1。然后,对DEGs（上调和下调）进行GO功能富集分析及KEGG代谢通路富集分析。1.2.4.4利用RT-qPCR对DEGs进行验证为验证RNA-seq结果的可靠性，选择12 个DEGs进行RT-qPCR验证。通过PrimerPremier5.0设计特异性引物，使用SYBR Green Mix在罗氏LightCycler480上进行分析，按照2-Ac法计算基因的相对表达量，以Fov微管蛋白基因（-tubulin-F:5-CGTCTAGAG-GTACCCATACCGGCA-3,-tubulin-R:5-GCTCTA-GACTGCTTTCTGGCAGACC-3）为内参基因（表1）。引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。实验参数为941min;9415s，58 2 0 s，7 2 2 0 s;40次循环，设置3次重复。1.2.5数据处理及作图用GraphpadPrism8软件对数据进行处理和绘图。2结果2.1根系分泌物对尖孢镰刀菌生长的影响通过抗、感品种根系分泌物对尖孢镰刀菌的处理，结果发现，随着萌发时间的延长，XH-41根系分泌物处理组的孢子萌发率显著低于XH-14根系分泌物处理组和CK对照组，其中XH-41处理组在第10小时时孢子萌发率为7 2.10%，与CK对照组相比显著降低，降低了2 7.2 1%（图1-A）。在培养第7 天2023,39(9)基因名称Gene nameFOTG_00376FOTG_00798FOTG_00997FOTG_01540FOTG_02351FOTG_05128FOTG_05209FOTG_06306FOTG_07131FOTG_08398FOTG_16221FOTG_18094时，XH-14和XH-41根系分泌物处理组菌的生物量分别为10 1.31和6 8.51mg，与CK对照组相比，XH-14根系分泌物处理组提高了10.9 4%，而XH-41根系分泌物处理组降低了2 4.98%（图1-B）。XH-14根系分泌物处理组的孢子萌发率，显著高于XH-41根系分泌物组和CK对照组，其中XH-14处理组在10h时孢子萌发率为9 8.6 1%，与CK对照组相比有所增加，提高了0.6 2%。XH-41根系分泌物处理组抑菌圈显著小于其他两组处理，在7 d时菌落直径为5.4cm，相比XH-14根系分泌物处理组和CK对照组，分别降低了12.52%和3.41%。而在培养3-7d的XH-14根系分泌物处理组菌落直径为3.4-6.4cm，显著大于CK对照组（图1-C,D）。以上结果表明，感病品种XH-14根系分泌物促进尖孢镰刀菌的生长，抗病品种XH-41根系分泌物抑制尖孢镰刀菌的生长。娄慧等：抗、感品种棉花根系分泌物对尖孢镰刀菌生长及基因表达的影响表1引物序列Table 1Primer sequences引物序列 Primer sequence（5-3）TGCAGCCCTCATCCTTGC（F)ACAGCGCGGATGGTATCG（R)AGCTGCAATCCCACGCTT(F)AAAAGCAAAGGCAGCGGC(R)CCAGCGAGTTCTCGACCC(F)CAGAGAAGGGCCGCCAAA（R)TCTCCAGGGGCCAGTGTT(F)ACTTTGGCCCGATCGCAA（R)CTTCCCAGGCGTGGCTTT（F)GTCAAACAGGGCGAGCCT(R)GCCTCATCACCACCCGTC(F)GCGAGACCAGGTGACCAC（R)AAGACCGGTGCTTCTGCC（F)TGGAGGCGGAGAAGACGA(R)TCAGCCCTGCCGATGTTG（F）GTCGAGACCGAGCAGCTC(R)TGGCTCCAAGCTCTGTGC（F）CTGAGTTTCCGTGGCCGT（R)TGCTTGGTATGGGCGGTG（F)CAGTGCCCAGCTTTCGGA（R)CCCCAGGAGGCCTCAGAT（F)AGCTCCCGCAAACCTGAC(R)ACCACCATCCGCAACCTG(F)AGGTCCCGTTCGTTGCTG（R）1592.2转录组分析2.2.1RNA-seq质量评估和转录组模式分析通过对抗、感棉花根系分泌物培养的尖孢镰刀菌2 6 个样本进行RNA-seq，共获得17 5.8 5GbCleandata，各样品Cleandata均达到5.7 0 Gb，Q 30 碱基百分比在91.94%及以上。Cleanreads比对到Fov参考基因组上的 reads数Mapped reads占8 6.7 1%-94.7 9%（表2和图2)。每个样本的两个生物学重复间FPKM分布的皮尔逊相关系数R均在0.9 45-0.9 8 7 之间（P 0.0 0 1），表明RNA-seq数据可靠，具有较好的重复性。2.2.2尖孢镰刀菌差异表达基因分析此次分析共检测到表达基因2 0 419个，已知基因18 90 5个，新基因1514个。基于表达量定量结果，进行DEGs筛选（图3）。感病品种XH-14根系分泌物处理组样本与同时间水处理样本（W6、12、2 4、48 h）相比，培养6、12、2 4和48 h后分别鉴定到158 3个（7 44个上调和8 39个下调）、1117 个（7 0 8 个上调和40 9个下调）16 11个（7 6 5个上调和8 46 个下调）和1715个（945个上调和7 7 0 个下调）DEGs（图4-A，D）。抗病品种XH-41根系分泌物处理组样本与同时间水处理样本（W6、12、2 4、48 h）相比，培养6、12、2 4和48 h后分别鉴定到9 2 6 个（550 个上调和376个下调）、58 9 个（318 个上调和2 7 1个下调）1920个（8 9 1个上调和10 2 9 个下调）和16 53个（7 90 个上调和8 6 3个下调）差异表达基因（图4-B，D)。（G v s W）v s（K v s W）共获得DEGs数量为4248个，GvsW的DEGs数量为12 7 7 个，KvsW的DEGs数量为7 16 个，二者共同富集的DEGs数量为2 2 55个（图4-C）。结果发现，抗、感品种根系分泌物培养的样本均存DEGs，其中在感病品种XH-14根系分泌物培养的样本中上调的DEGs多于抗病品种XH-41根系分泌物培养的样本，与培养24、48 h 相比，培养6、12 h的DEGs显著上调。表明Fov对不同抗性品种的根系分泌物均能够产生响应，但对感病品种根系分泌物的响应较为强烈。2.2.3尖孢镰刀菌的DEGs功能注释对已注释的DEGs进行GO功能富集和KECC通路分析，GO功能富集结果显示，感病品种XH-14根系分泌物处a160生物技术通报BiotechnologyBulletinA12090-2023,Vol.39,No.9CKXH-14CKXH-14aOXH-41XH-41Bb816ba60-30-0C120-Bu/ssewoiqun.odsixo90-4b工dC2a2046萌发时间Germination time/hCK8XH-14XH-41aab103培养时间Incubation time/dD57a60-CK30-0A：根系分泌物对孢子萌发的影响；B：根系分泌物对尖孢镰刀菌生物量的影响；C、D：根系分泌物对菌落直径的影响。不同字母表示差异显著P0.05，下同A:Effects of root exudates on spore germination.B:Effects of root exudates on F.oxysporum biomass.C and D:Effect of root exudates on bacterial colony diameter.Differentletters indicate significant difference P 0.05,the same below理样本中，在生物过程方面，DEGs主要富集在氨基酸转运（amino acid transport,GO:0006865）、跨膜转运（transmembrane transport,GO:0055085）、脂肪酸生物合成过程（fattyacidbiosynthetic process,GO:0006633）等条目上；在细胞组分方面，主要富集在膜的组成部分（integral component of membrane,GO:0016021）条目上；在分子功能方面，主要富集在阳离子转运ATP酶活性（cation-transportingATPase activity,GO:0019829）、转移酶活性、转移酰基（transferase activity,transferring acyl groups,GO:0016746）、离子通道活性（ion channel activity,GO:0005216）等条目上（图5-A）。抗病品种XH-41根系分泌物处理样本中，结果（图5-B）显示，在生物过程方面，DEGs主要富集在跨膜转运（t r a n s m e m b r a n e t r a n s p o r t,G O:0 0 550 8 5）、三羧酸循环XII-1435培养时间 Incubation time/d图1根系分泌物对尖孢镰刀菌生长的影响Fig.1Effects of root exudates on the growth of Fusarium oxysporum（t r i c a r b o x y l i c a c i d c y c l e,G O:0 0 0 6 0 99）、氨基酸转运（a mi n o a c i d t r a n s p o r t,G O:0 0 0 6 8 6 5）过程等条目上；在细胞组分方面，主要富集膜的组成部分（integralcomponentof membrane,GO:0016021）条目上；在分子功能方面，主要富集在阳离子转运ATP酶活性（cation-transporting ATPase activity,CO:0019829)、ATP酶活性（ATPase activity,GO:0016887）、磷酸二酯水解酶活性（phosphoric diester hydrolase activity,G0:0008081）等条目上。KEGG富集分析结果显示，感病品种XH-14根系分泌物处理样本中，共有98 8 个差异基因注释在125个通路上，富集较为显著的有柠檬酸循环（TCA循环，citrate cycle（T CA c y c l e）)，涉及2 0 个基因；类胡萝卜素生物合成（carotenoidbiosynthesis），涉及3个基因；核黄素代谢（riboflavinmetabolism），涉及XH-4172023,39(9)样品名称Sample IDFOaFObG12aG12hG24aG24bG48aG48hG6aG6bK12aK12hK24aK24hK48aK48bK6aK6hW12aW12bW24aW24bW48aW48bW6aW6h娄慧等：抗、感品种棉花根系分泌物对尖孢镰刀菌生长及基因表达的影响表2 测序数据评估统计表Table 2 Evaluation statistics of sequencing data质控数据Clean reads原始数据Raw reads23.634.2267 078961 59624 8011137426.874.55219.0619865.703 668 45422.878.8976 847 717 36823252.2806 960 709 83219.547 876585329979828 294 1938.474 124 61823 044 1056 899 543 00825 066 6107 505 211 56022.483 8186 732 866 92020 7810356 222 244 28420 396 9156 107 771 74822.3958106.701 578 95819 324.0665781 190570202531956.063580670234314217 015 769.46219.328.4025.788.003.554204605466 123 145 102203175856.085 191 946233990267007306 03222.727 5616 805 789 076217499906.509670.55826 2121027 848 652.47825 1739387 534 704 60422.480 5036 733 786 86626 838 5388 034 600 906161CC/%Q20/%52.9698.6552.9798.4352.3097.1252.3798.4952.4298.3452.4097.0952.5898.2252.5197.2952.6898.3352.7098.5152.2696.8552.2097.5052.3097.4652.2097.4952.5997.3252.5498.6352.7597.2452.6697.5252.2998.2552.2398.2552.3998.0952.2898.2752.7398.4252.7597.9352.6798.4452.8198.48Q30/%95.8195.3192.4395.4895.1292.3894.7792.7995.0595.5191.9493.2293.2093.2492.8095.7792.6493.2594.8494.8694.4694.8395.3094.1295.3395.43参考基因组比对Mapped reads44807027（94.7 9%）46 773 111(94.30%)33826843（8 8.7 3%）41697.513(91.13%)42 523 192(91.44%)35 197149（90.0 3%）51 256 558(90.58%)41 817 664(90.73%)45 107683(89.98%)40929 019（91.0 2%）37148 780（8 9.38%)36 813 504(90.24%)39332014（8 7.8 1%）33512754（8 6.7 1%)37310755（92.11%）42.942 424(91.63%)34813490（90.0 6%)36420714（8 9.0 0%)37516540（92.33%)42862234(91.59%)42220799（92.8 8%）40 299 468（92.6 4%）49 390 772(94.21%)47 156 136(93.66%)41 135 869(91.49%)49 740 879(92.67%)10个基因；谷胱甘肽代谢（glutathione metabolism），涉及2 1个基因；淀粉和蔗糖代谢（starch andsucrose metabolism）涉及40 个基因（图6-A）。抗病品种XH-41根系分泌物处理样本中，共有8 8 2 个差异基因注释在12 3个通路上，富集较为显著的有碳代谢（carbonmetabolism）类胡萝卜素生物合成（c a r o t e n o i d b i o s y n t h e s i s），涉及6 8 个基因；其他聚糖降解（other glycan degradation），涉及11个基因；ABC运输工具（ABC transporters），涉及36 个基因；脂肪酸代谢（lipoicacid metabolism），涉及2 个基因；角质、木栓素和蜡的生物合成（cutin，s u b e r i n e a n dwax biosynthesis），涉及3个基因（图6-B)。2.2.4丝细胞壁降解相关基因的分析Fov从穿透根细胞壁到在宿主植物定殖期间内，会分泌多种细胞壁降解相关的酶，在植物细胞壁的降解和宿主病原体互作中起重要作用。本研究对抗、感病品种XH-14和XH-41根系分泌物处理样本的基因相对表达水平，进行聚类分析。共有2 4个DEGs富集到细胞壁降解相关通路，14个水解酶活性，水解0-糖基化合物（hydrolase activity,hydrolyzing O-glycosylcompounds,H）、2 个-L-葡糖苷酶活性（alpha-L-fucosidase activity，A）3个-半乳糖苷酶（beta-galactosidaseactivity,B）2 个甘露糖寡糖葡萄糖苷酶活性(mannosyl-oligosaccharide glucosidase activity,M)1个果胶裂解酶活性（pectate lyaseactivity,PL）、1个聚半乳糖醛酸酶活性(polygalacturonase activity,P）1个纤维素酶活性（cellulaseactivity，C）。其中“水解酶活性、水解O-糖基化合物”基因富集最多，与162生物技术通报BiotechnologyBulletin2023,Vol.39,No.9HeatmapFOa1.00FOb0.80G6a0.60G6bW6a0.40W6bK6aK6bG48aG48bK48aK48bW48aW48bW12aW12bK12aK12bG12aG12bW24aW24bG24aG24bK24aK24b图2 尖孢镰刀菌样本间相关性分析Fig.2 Correlation analysis among the samples of F.oxysporum20-1-2-3ZIM图3尖孢镰刀菌的差异表达基因统计Fig.3 Statistics of differentialy expressed genes of F.oxysporumK6、12、2 4、48 h 处理相比，在G6、12、2 4、48 h处理下显著上调，其中G6 h处理上调基因数目达到忆M10个（图7）。结果表明，在感病品种XH-14根系分泌物处理下，尖孢镰刀菌中存在更多与细胞壁降2023,39(9)娄慧等：抗、感品种棉花根系分泌物对尖孢镰刀菌生长及基因表达的影响AG24vsW24428G12vsW12962231477232163BG48 vs W48K24vs W24684665299G6vsW6K12 vs W12107662103271132135141K48vsW4849861245911191512K6vs W6431373502177748422500-DEGs_downCD2000-1500-12272.255DEGs_up7161000500-6GvsWKvsW2CVSWvsKA：G v s W 的6、12、2 4、48 hDEGs韦恩图；B：K v s W 的6、12、2 4、48 hDEGs韦恩图；C：（G v s W）v s（K v s W）的DEGs韦恩图；D:GvsW和KvsW的6、12、2 4、48 h上、下调DEGsA:Venn diagram of G vs W 6,12,24 and 48 h DEGs.B:Venn diagram of G vs W 6,12,24 and 48 h DEGs.C:Venn diagram of(G vs W)vs(K vs W).D:K vs W and G vs W 6,12,24 and 48 h up and down DEGs图4尖孢镰刀菌的差异表达基因Fig.4 Differentially expressed genes of F.oxysporum解相关的基因，参与到Fov致病的相关代谢通路中使棉花感病。2.2.5尖孢镰刀菌的RNA-seq数据验证随机选取12个DEGs进行RT-qPCR验证，结果发现DEGs的表达趋势与RNA-seq结果相一致，表明RNA-seq数据可信度高（图8）。3讨论3.1根系分泌物对尖孢镰刀菌生长的影响根系分泌物是植物与土壤及土传病菌相互作用的桥梁，不仅可以通过改变土壤环境间接抑制土传病菌，还可以通过自身作用直接抑制土传病菌-1。众多学者对植物根系分泌物进行了研究,Liang 等14研究结果表明,西瓜枯萎病菌在不同抗性水稻（OryzasativaL.）品种的根系分泌物处理下会产生不同的响应，其中ELI0和40 0 7 品种的根系分泌物会抑制枯萎病菌孢子的萌发和菌的生长，显著减少了西瓜枯萎病的发生。Chen等15 研究发现，因抗病黄瓜（Cu c u m i s s a t i v u s L.）品种的根系分泌物中含糖类物质较少，对尖孢镰刀菌产生抑制作用；感病、中抗品种的根系分泌物中含糖类物质较多，能够促进病原菌的生长。Lyu等【16 研究发现，抗病品种的根系分泌物抑制枯萎病菌丝生长、孢子萌发和产孢，未接菌与对照相比，提高抑制率，并在接菌后抑制作用增强；感病品种的根系分泌物则表现出促进作用。这与本研究结果一致，抗病品种XH-41的根系分泌物对棉花枯萎病病原菌生长发育具有一定的抑制作用，XH-41根系