抗杀螟硫磷纳米抗体表达、纯化策略研究及检测方法建立.pdf

郭鹏燕，徐振林，陈子键，等.抗杀螟硫磷纳米抗体表达、纯化策略研究及检测方法建立 J.食品工业科技，2023，44（23）：298305.doi:10.13386/j.issn1002-0306.2023030328GUOPengyan,XUZhenlin,CHENZijian,etal.Expression,PurificationStrategyandDetectionMethodEstablishmentofAnti-FenitrothionNanobodyJ.ScienceandTechnologyofFoodIndustry,2023,44(23):298305.(inChinesewithEnglishabstract).doi:10.13386/j.issn1002-0306.2023030328 分析检测 抗杀螟硫磷纳米抗体表达、纯化策略研究及抗杀螟硫磷纳米抗体表达、纯化策略研究及检测方法建立检测方法建立郭鹏燕1，徐振林1，陈子键2,*，沈兴1,*（1.华南农业大学食品学院，广东广州510642；2.肇庆学院食品与制药工程学院，广东肇庆526061）摘要：为了高效制备高纯度的抗杀螟硫磷纳米抗体，本研究对一株低表达水平的重组抗杀螟硫磷纳米抗体在大肠杆菌中的表达条件进行优化，以 IPTG 浓度、温度为自变量，Nb 表达量为因变量进行单因素实验，同时对抗体纯化方法进行研究。结果表明，在 37、无 IPTG 条件下抗杀螟硫磷纳米抗体表达量最高，达到 6mg/L，并且发现IPTG 用量与诱导温度存在交互效应，通过 Ni 亲和层析与凝胶过滤层析两步纯化法，最终得到了纯度 98%以上的抗杀螟硫磷抗体，表明该表达与纯化策略可以高效制备抗杀螟硫磷纳米抗体。利用所获得的纳米抗体，建立了 ic-ELISA 检测方法，其 IC50为 5.81ng/mL，检出限为 0.25ng/mL，检测范围为 0.7843.07ng/mL。选择生菜和白菜为样品进行添加回收实验，添加回收率在 93.3%111.7%之间，变异系数（CV）值在 2.3%18.2%之间。基于杀螟硫磷纳米抗体所建立的方法灵敏度高，能够满足国标规定的杀螟硫磷监测需求，可用于杀螟硫磷的快速筛查。本研究为开发高效快速的杀螟硫磷免疫检测方法奠定了基础。关键词：杀螟硫磷，纳米抗体，诱导表达，纯化策略，活性鉴定本文网刊:中图分类号：TS201.3文献标识码：A文章编号：10020306（2023）23029808DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2023030328Expression,PurificationStrategyandDetectionMethodEstablishmentofAnti-FenitrothionNanobodyGUOPengyan1，XUZhenlin1，CHENZijian2,*，SHENXing1,*（1.CollegeofFoodScience,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou510642,China；2.SchoolofFoodPharmaceuticalEngineering,ZhaoqingUniversity,Zhaoqing526061,China）Abstract：Forthepurposeofpreparinganti-fenitrothionnanobodieswithhigh-purityefficiently,theexpressionconditionsofarecombinantanti-fenitrothionnanobodywithlowexpressionlevelinE.coliwasoptimized.TheIPTGconcentrationandinducingtemperaturewereselectedastheindependentvariablesandthenanobodyexpressionlevelwasusedasthedependentvariableforsingle-factorexperiments,andthepurificationstrategywasalsoinvestigated.Theresultsshowedthatthehighestexpressionlevelof6mg/Lanti-fenitrothionnanobodywasachievedat37withoutIPTG.Moreover,aninteractive effect of IPTG dosage and inducing temperature was found.After a two-step purification of Ni affinitychromatographyandgelfiltrationchromatography,theanti-fenitrothionnanobodieswasfinallyyieldedwithmorethan98%purity,indicatingthattheexpressionandpurificationstrategiesinthisstudycanobtainanti-fenitrothionnanobodiesefficiently.Anic-ELISAassaywasthenestablishedbasedontheobtainednanobody,withanIC50of5.81ng/mLandanLODof0.25ng/mL,andadetectionrangeof0.7843.07ng/mL.Theassaywasappliedtodeterminefenitrothionin收稿日期：20230329基金项目：广东省基础与应用基础研究基金项目（2021A1515110513）。作者简介：郭鹏燕（1998），女，硕士，研究方向：纳米抗体稳定性结构基础研究，E-mail：。*通信作者：陈子键（1991），男，博士，讲师，研究方向：食品安全快速检测技术，E-mail：。沈兴（1987），女，博士，副教授，研究方向：食品安全快速检测，E-mail：。第44卷第23期食品工业科技Vol.44No.232023年12月ScienceandTechnologyofFoodIndustryDec.2023Chinesecabbageandlettucesamples.Therecoveryrateofadditionwasbetween93.3%111.7%,andthecoefficientofvariation(CV)wasbetween2.3%18.2%.Theproposedassaybasedonanti-fenitrothionnanobodyhashighsensitivity,whichcanmeettherequirementsformonitoringoffenitrothionunderthenationalstandard,thuscanbeusedforrapidscreening of fenitrothion.This study laid a foundation for the development of efficient and rapid immunoassays forfenitrothion.Keywords：fenitrothion；nanobody；inducedexpression；purificationstrategy；activityidentification我国作为传统农业大国，农业生产规模巨大，农药滥用及不合理施用的现象也比比皆是1。农药在水、土壤以及农作物中的残留严重威胁了人类的生命健康23。杀螟硫磷作为一种广谱的有机磷类杀虫剂，因其高效的杀虫性能和低廉的价格被广泛地应用于蔬菜、水果、谷物等农产品的虫害防治45，其不合理施用导致的农药残留严重威胁人类的生命健康安全。我国食品安全国家标准 GB2763-2021 对杀螟硫磷在谷物、油类、蔬菜、水果和肉类等食品中的最大残留限量（MRLs）作出了规定，以蔬菜水果为例，最大残留限量均不超过 0.5mg/kg。近年来在各地农产品农药残留监测中，仍常有杀螟硫磷残留检出的报导，例如 2017 年一项针对泉州地区蔬菜中有机磷农药残留的监测显示，几种残留超标的化合物杀螟硫磷、甲拌磷、丙溴磷和水胺硫磷的气相检测值分别为 5.85、0.04、1.28、0.062mg/kg，远远高于国标规定的蔬菜中最大残留限量，其中杀螟硫磷超标最为严重6。因此，应对杀螟硫磷残留进行监测，找到有效保障人民健康安全，高效、经济、实用的检测方法。目前，我国食品安全国家标准检测方法（GB23200.113-2018）规定的杀螟硫磷残留的检测方法是气相色谱-质谱联用仪器分析法7，但是其需要繁琐的前处理、仪器操作相对复杂，对相关操作人员要求较高，不能满足现场大规模快速检测8。免疫分析方法由于其灵敏度高、特异性好、方便快捷、易操作等优点，被广泛应用于农药、兽药残留等食品安全监测910。近几年报道了很多食品中杀螟硫磷残留的免疫分析检测方法，其中应用较多的是单克隆抗体和多克隆抗体1114，但存在生产周期长、成本高、免疫效果不稳定、重复性较差等问题15。与传统抗体相比，基因工程抗体具有制作成本较低、制备周期短、抗体较稳定具有更好的实验重现性，并且可以通过基因工程的手段对抗体进行改造等诸多优势1617。纳米抗体（Nbs）本质上属于基因工程抗体的一种，相较于传统抗体衍生来的 Fab、scFv 等基因工程抗体，Nbs 分子极小、结构紧致，具有溶解度好、稳定性和亲和力高的优势1820，因而从被发现以来迅速地被应用于生物制药、医疗诊断和食品安全监测等领域，应用前景十分广阔。目前常用的纳米抗体体外表达体系主要是大肠杆菌和酵母细胞，其中大肠杆菌是最早用于外源基因表达的宿主细胞，也是目前重组蛋白制备最常用的表达系统，有成熟的操作方法以及各类商业化表达载体和宿主21，具有表达水平高，操作简单，培养成本低、周期短等优势22。Nbs 可以在细胞质表达或者通过信号肽介导到周质腔表达，后者处于氧化环境，有利于二硫键形成，促进 Nbs 正确折叠表达，产生可溶性蛋白2324。但是 Nbs 在周质腔中的表达水平较低，往往难以富集，因此需要通过适宜的表达与纯化策略以达到高效获取 Nbs 的目的。除了本实验室的前期研究之外，目前尚未见其他关于抗杀螟硫磷纳米抗体的报道，而本实验室前期构建的异源表达体系表达水平和纯度较低，抗体富集较为困难，无明确的表达及纯化策略用于制备高纯度的抗杀螟硫磷纳米抗体，制约了其在杀螟硫磷监测中的应用2526。本研究在前期构建的一株低表达水平的抗杀螟硫磷纳米抗体工程菌基础上，通过对其表达条件进行优化以及对纯化策略进行研究，以期高效制备高纯度的抗杀螟硫磷纳米抗体，并验证其检测性能，为纳米抗体的制备与相关免疫检测方法的开发奠定基础。1材料与方法1.1材料与仪器PINQ-VHH（sm6）质粒、杀螟硫磷检测抗原实验室前期制备；质粒小提试剂盒北京天根生化科技有限公司；表达菌株 BL21（DE3）感受态北京全式金生物技术股份有限公司；酵母提取物、胰蛋白胨美国 Thermo 公司；琼脂糖广州 BioFroxx 公司；卡那霉素、异丙基-D-硫代半乳糖苷（IPTG）广州华奇盛生物公司；Tris、咪唑、甘氨酸、SDS广州 Bio-Froxx 公司；PAGEGelFastPreparationKit上海雅酶生物医药科技有限公司；NiSepharoseTM6FastFlow、HiloadSuperdex75pg16/600 层析柱美国GEHealthcare 公司；DTT上海阿拉丁生化科技股份有限公司；ProteinMarker、DNAMarker美国Thermo 公司；ultraGelRed（10000）南京 Vazyme公司；MonoRabTMRabbitanti-CamelidVHH（HRP）南京金斯瑞科技有限公司；杀螟硫磷标准品坛墨质检科技股份有限公司；白菜、生菜样品购自华南农业大学三角市市场；其他化学试剂均为分析纯。PowerPacTM 通用电泳仪美国 Bio-Rad 公司；AKTApure 蛋白质层析系统美国 GEHealthcare公司；SW-CJ-IF 型净化工作台苏州净化设备厂；HZQ-X100 恒温振荡培养箱培英实验设备有限公司；80 超低温冰箱Panasonic；LRH-150A 型生化培养箱广东省医疗器械厂；高压灭菌锅日本Hirayama 公司；UniversalHoodII 多功能凝胶成像第44卷第23期郭鹏燕，等：抗杀螟硫磷纳米抗体表达、纯化策略研究及检测方法建立299仪美国 Bio-Rad 公司；Nanodrop2000c 微量分光光度仪美国Thermo公司；SorvallLynx4000超高速冷冻离心机美国 Thermo 公司；MultiskanMK3酶标仪美国Thermo公司；WellwashMK2洗板机上海艾研生物科技有限公司；HHW21-600 电热恒温水浴箱上海悦丰仪器仪表有限公司；SKFG-01电热恒温鼓风干燥箱黄石市恒丰医疗器械有限公司。1.2实验方法1.2.1PINQ-VHH-sm6 质粒提取与转化实验室前期制备的含有 sm6 重组质粒的冻存甘油菌27，接种到 10mLKana 抗性 LB 液体培养基中活化，用质粒小提试剂盒进行质粒提取，提取完成后用核酸电泳进行验证。将 12L 重组质粒加入到感受态中，轻弹混匀后置于冰水浴 30min，接着于 42 水浴锅热击 90s，立即冰水浴 2min，取出后加入 600800LLB 液体培养基，200r/min、37 振荡培养 1h。培养后的菌液 12000r/min 离心 2min 弃去大部分上清，留 150L 进行菌体重悬，涂布于 LB-Kana 平板，于 37 恒温培养箱中倒置培养 1216h，待长出单一菌落。1.2.2抗杀螟硫磷纳米抗体表达条件优化从转化后的平板上挑取单菌落到 10mLLB-Kana 液体培养基中，200r/min、37 振荡培养过夜。取活化的菌液以 1:100 的比例加入到 2YT-Kana 液体培养基，37、250r/min 振荡培养到对数期，将菌液以每管10mL 分装到 50mL 离心管中进行诱导表达。诱导温度分别选择 37、28、16，诱导剂 IPTG 用量分别采用 1、0.7、0.5、0.3、0.1mmol/L28，于 250r/min 振荡诱导表达 16h，以探索不同温度与诱导剂用量下的目的蛋白表达情况。将培养好的菌液在 12000r/min、4 条件下离心 5min 收集菌体，弃去上清。采用蔗糖渗透压法提取周质蛋白29，每管收集菌体中加入 70L5TES，重悬菌体，80 冻存 3h，取出后加入 210L1TES，室温解冻重悬菌体，16、200r/min 振荡培养 1h 后，于 12000r/min、4 条件下离心 25min，收集上清，即为周质蛋白。将不同表达条件下的周质蛋白跑 SDS-PAGE 电泳验证表达情况。1.2.3抗杀螟硫磷纳米抗体纯化1.2.3.1亲和层析纯化采用 NiSepharoseHP5mL亲和柱对上一步提取的周质蛋白进行第一步亲和纯化，首先使用结合缓冲液（20mmol/LTris-HCl、300mmol/LNaCl，pH7.4）进行上样，继续冲洗 5 个柱体积后，逐渐提高洗脱缓冲液（20mmol/LTris-HCl、300mmol/LNaCl、500mmol/L 咪唑，pH7.4）的浓度进行梯度洗脱，在 50min 内洗脱缓冲液的比例从 0%增加到 100%，对洗脱峰进行收集并用Nanodrop 测定蛋白浓度，跑 SDS-PAGE 电泳对纯化效果进行验证。此外，为了提升亲和层析的纯化效果，同时采用在结合缓冲液和洗脱缓冲液中加入1mmol/LDTT 的策略，探索对纯化效果的影响。1.2.3.2凝胶过滤层析法采用 Superdex75pg 凝胶柱进行第二步纯化。将上一步纯化得到的蛋白溶液用 3000Da 的超滤管反复离心浓缩到 5mL，用1.2 个柱体积的平衡缓冲液（20mmol/LTris-HCl、100mmol/LNaCl，pH7.4）平衡柱子后进行上样，继续冲洗 1 个柱体积，不同分子量大小的蛋白在不同时间被洗脱下来，收集全部的洗脱峰进行 SDS-PAGE 电泳验证，用 Nanodrop 测定目的蛋白浓度。1.2.4间接 ELISA 检测方法建立利用纯化得到的抗杀螟硫磷纳米抗体建立间接 ELISA 方法（indirectcompetitiveenzyme-linkedimmunesorbentassay,ic-ELISA），对纳米抗体的检测性能进行评价，建立标准曲线，具体操作步骤如下：用包被液将杀螟硫磷检测抗原稀释至 0.5g/mL，加入到 96 孔酶标板中，每孔100L，置于 37 恒温水浴锅中孵育 12h，用 PBST洗板后用封闭液封闭 3h。在 0.5g/mL 包被原条件下，测定波长 450nm 处的吸光值在 0.81.5 之间的抗体浓度作为工作浓度。将 50L 抗体工作溶液与50L 不同浓度杀螟硫磷标准溶液在微孔中混合，37 孵育 40min 后洗板 5 次。按照 1:5000 的比例用 PBST 稀释 anti-VHHHRP 二抗，每孔加入 100L二抗，37 孵育 30min 后再次洗板 5 次。每孔加入 100L 显色液 37 孵育 10min，用 10%H2SO4终止反应。用酶标仪测定波长 450nm 处的吸光值，以 B/B0值为纵坐标，以杀螟硫磷药物浓度为横坐标，其中 B 为相应浓度稀释的吸收值，B0为空白孔的吸收值，拟合函数的方程为：y=(AD)1+(x/C)B+D式中，A 是药物浓度最低时对应的吸收值；D 是药物浓度最高时对应的吸收值；C 是中点浓度，当药物浓度等于 C 是吸收值为（A+D）/2，处于曲线的拐点处，对应浓度即为 IC50；B 是曲线的陡峭程度，即斜率因子。1.2.5实际样品检测样品前处理方法参考 GB23200.113-2018 进行：白菜和生菜去除根部，分别打成匀浆，准确称取匀浆样品 10g 于 50mL 离心管，加入 10mL 乙腈、4g 硫酸镁、1g 氯化钠、1g 柠檬酸钠、0.5g 柠檬酸氢二钠和 1 颗陶瓷搅拌子，振荡涡旋 1min，4200r/min，离心 5min。吸取 6mL 上清液到 15mL 离心管中，加入 885mg 硫酸镁、150mg乙二胺-N-丙基硅烷化硅胶（PSA）及 1545mg 石墨化炭黑（GCB），涡旋混匀 1min，4200r/min 离心5min。为了简化前处理步骤，样品提取液不经过氮吹复溶，用 PBS 稀释至一定倍数后直接用于 ic-ELISA检测。300食品工业科技2023 年12月1.3数据处理采用 MicrosoftExcel 软件进行数据统计，所有数据均为 3 次平行实验测定结果的平均值标准差，并采用 Origin2018 软件（美国 OriginLab 公司）对实验数据进行分析。2结果与分析2.1抗杀螟硫磷纳米抗体诱导表达条件优化提升纳米抗体体外表达水平的方法有很多，如对基因编码序列进行密码子优化3031、与分子伴侣（GroES、GroEL、DnaK 等）、折叠酶（PDI、Dsb 家族等）或可溶性蛋白融合表达3233，以及更换表达载体或宿主等，而优化培养条件是一种最为简单且有效的方法，可以通过低温诱导、调整诱导剂浓度或在培养基中加入营养物质等方式提高重组蛋白可溶性表达水平。本研究以 37、1mmol/LIPTG 作为初始表达条件，首先进行温度优化，分别在 37、28、16 条件下进行诱导，同时设置不加 IPTG 的样品作为对照，提取周质蛋白进行电泳验证，结果如图 1（a）所示。在 1mmol/LIPTG 条件下，目的蛋白表达量随着诱导温度升高而降低，在 16 下诱导表达提取得到的周质可溶性蛋白量最多。与此同时，发现没有 IPTG诱导的对照组也能正常表达，且表达量较高，说明该重组质粒存在泄露表达，因此接着对诱导剂的浓度进行优化。通过在 16 下对 01mmol/L 浓度范围的 IPTG用量进行探索，结果发现诱导剂的用量对于蛋白的表达量影响并不大，且与无 IPTG 条件下的表达量接近，因此从节约成本和简化操作的角度考虑，选择不加诱导剂直接进行表达，并在此条件下重新确定最优表达温度。结果与预想不同，如图 1（c）所示，目的蛋白表达量随温度升高而升高，在 37 下表达量最高，与 1mmol/LIPTG 下的结果正好相反，说明 Nbsm6的表达水平随温度的变化趋势与 IPTG 用量密切相关，不同的 IPTG 含量使得 Nbsm6 的表达水平随温度变化呈现相反趋势。高 IPTG 条件下，可溶蛋白含量随温度的升高而降低；无 IPTG 条件下，可溶蛋白含量随温度的升高而增加，同样在实验过程中观察到的菌体含量也呈现出相同的趋势。有研究表明 IPTG在诱导蛋白表达的同时可能会具有影响表达菌生长的双重作用，原因在于 IPTG 本身的毒性以及异源基因快速诱导表达消耗了大肠杆菌的营养成分，造成了大肠杆菌的代谢负担。此外，重组蛋白活性引起的副反应或其底物、产物和中间体的毒性都会影响菌体生长3435，因此蛋白的表达量不会随着 IPTG 浓度的增加而无限增加，IPTG 浓度过高反而形成负面影响。除此之外，本研究发现在高温条件下，IPTG 对大肠杆菌的毒性作用更加明显，其原因可能是高温条件加速了早期重组蛋白表达以及半乳糖苷衍生物的积累，加大了对宿主的毒性以及胞内营养物质的消耗，进一步减缓了大肠杆菌生长3637，最终显著影响了蛋白表达水平；而在无 IPTG 时，由于泄漏表达可以使重组抗体在较高培养温度下产量更高。因此，在对重组蛋白进行表达制备时不能忽略IPTG 对大肠杆菌的负面作用及其对不同温度的响应情况，应同时考虑温度和诱导剂浓度的交互效应，以确定最优表达策略，不能只是通过单因素实验确定抗体的最佳表达条件，应该将不同温度和 IPTG 浓度进行交叉研究。另外，在对抗体的表达条件进行优化时，不能忽略不同因素对抗体活性的影响，抗体活性的降低将直接影响其检测效果。本研究中 Nbsm6的表达最终确定在 37、无 IPTG 条件下进行，相较于优化前在 37、1mmol/LIPTG 条件下蛋白表达量 1.565mg/L，优化后蛋白表达量为 6mg/L，是优化前的 3 倍以上。2.2抗体纯化策略优化将提取的周质蛋白，采用 Ni 亲和柱层析方法进行第一步纯化，纯化结果如图 2（a）所示。亲和层析后 18kDa 左右有明显目的蛋白富集，但依然存在较多杂蛋白，可能是在蛋白质浓度过高时发生了聚集38，(c)M123(b)M123456M(a)123418013010070554035101525图1抗体表达条件优化Fig.1Optimizationofantibodyexpressionconditions注：（a）1mmol/LIPTG 下诱导温度优化，1-无 IPTG，37；24 分别为 1mmol/LIPTG，37、28、16；（b）16 下诱导剂用量优化，16 分别是 0、1、0.7、0.5、0.3、0.1mmol/LIPTG；（c）无 IPTG 条件下诱导温度优化，13 分别是16、28、37；M：蛋白Maker。第44卷第23期郭鹏燕，等：抗杀螟硫磷纳米抗体表达、纯化策略研究及检测方法建立301形成多聚体吸附在层析柱上随单体一起被洗脱下来，可以通过改变缓冲液体系、pH、加入还原剂等方法提高纯化效果39。本研究中采取在亲和层析的缓冲溶液中加入 1mmol/LDTT，利用其还原作用破坏杂蛋白的构象，减少杂蛋白与镍柱的结合能力，从而达到去除杂蛋白的目的。图 2（b）显示了缓冲液中含有 DTT 的纯化效果，可以看出在 1mmol/LDTT 的作用下，大大减少了杂蛋白的结合，但仍有少量杂蛋白残留，且分子量较大，因此进一步地采用分子筛色谱利用分子量差异去除杂蛋白。结果如图 3 所示，经由分子筛纯化后，电泳结果显示在 18.6kDa 处得到了条带非常单一的目的蛋白，确定了两步法纯化方案，所获得的纳米抗体经 ImageJ 软件分析纯度达到 98%以上。140012001000洗脱体积(mL)杂蛋白sm68006004002000020406080100120140紫外吸收值(mAU)杂蛋白sm6M12345180130100705540351525图3凝胶过滤层析分离蛋白峰图及 SDS-PAGE 电泳图Fig.3ProteinpeaksseparatedbygelfiltrationchromatographyandSDS-PAGEelectrophoresis注：M：蛋白 Marker；1-凝胶过滤层析前的抗体样品；25-凝胶过滤层析后的抗体样品。2.3间接 ELISA 检测方法建立在包被原浓度为 0.5g/mL，抗体浓度为 900ng时，在 PBS 缓冲溶液中建立抗杀螟硫磷纳米抗体的ic-ELISA 标准曲线，结果如图 4 所示。优化前低表达抗体检出限（IC10）为 0.8ng/mL，线性范围为 1.510.9ng/mL27；优化后抗体所建立的 ic-ELISA 方法的 IC50为 5.81ng/mL，检出限（IC10）为 0.25ng/mL，线性范围为 0.7843.07ng/mL，相较于优化前所建方法在检出限和检测范围上都有提升。目前已经报道的基于杀螟硫磷单克隆抗体在缓冲体系中建立的 ic-1800(a)1600140012001000紫外吸收值(mAU)洗脱体积(mL)800600400200020010080604020浓度(%)0020406080100UVCond B上样12345678M 流穿1234567818013010070554035101525M1234567180130100705540351015252400(b)2200140016001800200012001000紫外吸收值(mAU)洗脱体积(mL)800600400200020010080604020浓度(%)0020406080100UVCond B上样1 234567图2亲和纯化分离蛋白峰图及 SDS-PAGE 电泳图Fig.2PeakdiagramofproteinisolatedbyaffinitypurificationandSDS-PAGEelectrophoresis注：（a）Ni 柱亲和纯化（不含 DTT）；（b）含 DTT 缓冲液 Ni 柱亲和纯化；M：蛋白 Marker；数字编号代表洗脱峰收集管号。302食品工业科技2023 年12月ELISA 方法 IC50分别是为 8.72ng/mL11、120.7ng/mL40，多克隆抗体 LOD 为 12ng/mL12，基于 scFv的 ELISA 方法 IC50为 3.4ng/mL41，本研究经表达和纯化优化后制备的 Nb 所建立的杀螟硫磷 ic-ELISA 检测方法与目前已经报道的基于单克隆抗体ELISA 检测方法相比具有更高的灵敏度，与报道的基于多克隆抗体和 scFv 的 ELISA 方法灵敏度相当，表明本研究所制备获得的抗杀螟硫磷纳米抗体具有良好的检测活性。2.4样品添加回收经过 QuEChERS 净化后的白菜和生菜样品提取液，用 PBS 稀释 10、20、30 倍后直接用于 ic-ELISA检测。建立标准曲线（见图 5）分析发现，两种蔬菜样品提取液稀释 20 倍后标准曲线与 PBS 标准曲线重合，而稀释 10、30 倍的标准曲线与 PBS 标准曲线重合度较差，影响样品中杀螟硫磷的定量检测效果。最终确定稀释 20 倍为消除基质效应的最小稀释倍数，其检测线性范围为 0.3346.08ng/mL，满足国家标准 GB2763-2021 中规定的最大残留限量标准的检测。在样品中添加低中高三个水平的杀螟硫磷标准药物，采用上述的前处理方法处理样品，ic-ELISA 检测样品中的杀螟硫磷，结果如表 1 所示，两种果蔬样品的回收率在 93.3%111.7%之间，变异系数（CV）值在 2.3%18.2%之间，说明方法准确性较高，误差在可接受范围内。表1两种蔬菜样品添加回收实验Table1Additiverecoveryexperimentoftwovegetablesamples样品添标量（ng/g）平均值标准偏差（ng/g，n=3）回收率（%）变异系数（%）生菜11.10.2110.018.266.71.2111.718.13636.40.1101.22.3白菜10.90.193.316.366.50.6107.89.13636.71.3101.83.53结论本研究通过优化抗杀螟硫磷纳米抗体在大肠杆菌表达体系中的培养条件，增加了重组蛋白在周质腔中的可溶性表达量，建立了获得高纯度抗杀螟硫磷纳米抗体的两步纯化法。经过优化后，可以成功高效表达并纯化得到高纯度抗杀螟硫磷纳米抗体，表达量为 6mg/L，纯度达到 98%以上。此外，ic-ELISA 对纯化得到的纳米抗体建立标准曲线进行活性鉴定，结果显示IC50为5.81ng/mL，检出限LOD 为0.25ng/mL。选择生菜和白菜样品进行实际样品检测，其检测线性范围为 0.3346.08ng/mL，能够满足国标规定的杀螟硫磷最大残留限量监测需求，为开发杀螟硫磷快速免疫检测方法做了准备，也为后续抗杀螟硫磷纳米抗体结构、功能及相互作用机制研究奠定了基础。此外，研究过程中发现在诱导温度过高时 IPTG 诱导剂浓度对表达水平的影响巨大，不利于宿主菌正常生长，不利于蛋白质可溶表达；相反温度较低时 IPTG 诱导剂的用量对可溶性蛋白的表达量没有太大影响，且诱导剂浓度与诱导温度对纳米抗体的表达存在交互效应，为之后纳米抗体的异源表达提供了参考。参考文献1 HU H Y,YANG L Q.Developmentof enzymatic electro-chemical biosensors for organophosphorus pesticide detectionJ.JournalofEnvironmentalScienceandHealth,PartB，2021，56（2）：168180.2叶茂,沈晓玲,陈青舟,等.胶体金免疫层析法同时检测果蔬中四种农药残留J.食品工业科技，2023，44（6）：300308.YEMao,SHENXiaoling,CHENQingzhou,etal.Simultaneousdeter-minationoffourpesticideresiduesinfruitsandvegetablesbycol-loidalgoldimmunochromatographyJ.ScienceandTechnologyof1.00.80.6吸光度杀螟硫磷浓度(ng/mL)0.40.20102101100101102103104105图4抗杀螟硫磷纳米抗体 ic-ELISA 标准曲线Fig.4Anti-fenitrothionnanobodyic-ELISAstandardcurve1.0(a)0.80.6吸光度杀螟硫磷浓度(ng/mL)0.40.20102101100101102103104105PBS生菜10生菜20生菜301.0(b)0.80.6吸光度杀螟硫磷浓度(ng/mL)0.40.20102101100101102103104105PBS白菜10白菜20白菜30图5基质效应消除Fig.5Eliminationofmatrixeffect注：（a）生菜；（b）白菜。第44卷第23期郭鹏燕，等：抗杀螟硫磷纳米抗体表达、纯化策略研究及检测方法建立303FoodIndustry，2023，44（6）：300308.3 CANL A G,SRC B,ULUSOY H İ,et al.Analyticalmethodologyfortracedeterminationofpropoxurandfenitrothionpesticideresidues by decanoic acid modified magnetic nanoparti-clesJ.Molecules，2019，24（24）：4621.4王艳,赵宁,李虹佳,等.电沉积法构建 AChE/CODAuNPs共固定化酶生物传感器差分脉冲伏安法快速检测有机磷农药J.中 国 食 品 学 报，2023，23（1）：356363.WANG Yan,ZHAONing,LIHongjia,etal.Rapiddetectionoforganophosphoruspesti-cidesbydifferentialpulsevoltammetrywithAChE/CODAuNPsco-immobilized enzyme biosensor constructed by 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