苦瓜多糖和皂苷对秀丽隐杆线虫脂代谢的调节作用.pdf

CEREAL&FOODINDUSTRYVol.30,2023,No.5粮食与食品工业Cereal and Food Industry食品科技苦瓜多糖和皂苷对秀丽隐杆线虫脂代谢的调节作用贾董浩，周心雨，詹恩琪，欧阳子安，祝莹*江苏大学食品与生物工程学院（镇江2 1 2 0 1 3)摘要：本试验研究了苦瓜多糖与苦瓜皂苷联合作用对秀丽隐杆线虫脂质沉积的影响。通过测定线虫体长、体宽和运动能力，评估苦瓜多糖和皂苷对线虫基础生理指标的影响；结合油红O染色与甘油三酯含量，分析苦瓜多糖和皂苷对线虫脂肪沉积的作用。结果表明：苦瓜多糖和苦瓜皂苷均对N2野生型线虫的生长无抑制作用，且能降低线虫的体宽、增加身体弯曲频率，具有一定的协同作用；同时还能减少线虫体内的脂肪堆积，降低体内的甘油三酯含量，且二者联合添加时效果最优，具有协同调节脂代谢的作用。关键词：秀丽隐杆线虫；苦瓜多糖；苦瓜皂苷；脂代谢；协同作用中图分类号：TS201Effects of bitter melon polysaccharides and saponins on文献标识码：Blipid metabolism in C.elegans文章编号：1 6 7 2-5 0 2 6(2 0 2 3)0 5-0 2 8-0 5Jia Donghao,Zhou Xinyu,Zhan Enqi,Ouyang Zian,Zhu YingSchool of Food and Biological Engineering,Jiangsu University(Zhenjiang 212013)Abstract:To investigate the combined effects of bitter melon polysaccharides(BPS)and bit-ter melon saponins(BMS)on lipid deposition in Caenorhabditis elegans(C.elegans).The im-pacts of BPS and BMS on the basic physiological activities of C.elegans were evaluated by meas-uring body length,body width and locomotive activity.The effects of BPS and BMS on lipid dep-osition of C.elegans was analyzed by oil red O staining and triglyceride assay.Results:both BPSand BMS had no inhibitory effect on the growth of C.elegans.BPS and BMS could synergistical-ly decrease the body width and increase the frequency of body movement in C.elegans.Mean-while,BPS and BMS could also reduce lipid accumulation and triglyceride content in C.elegans,and the combined addition exhibited strong inhibitory effects on lipid accumulation.Key words:C.elegans;bitter melon polysaccharides;bitter melon saponin;lipid metabo-lism;synergistic effect随着人民生活水平的提高，高糖高脂食物摄人偏多，导致肥胖人口比例显著增高。肥胖不仅影响收稿日期:2 0 2 3-0 4-1 1作者简介：贾董浩，男，2 0 0 0 年出生，研究方向为食品质量与安全。*通讯作者：祝莹，女，1 9 8 7 年出生，讲师，博士，研究方向为食品营养。28着人体的身心发育，还可能引发高血压、高血脂、心血管疾病、脂肪肝和糖尿病等多种慢性疾病 1。但长期服用降脂药物的会产生肝功能损害等毒副作用。因此，从天然作物中探索具有防治脂代谢异常的有效成分将具有重要意义。苦瓜（Momordica charantia L.）含有多糖、皂粮食与食品工业Cereal and Food Industry苷、多肽、类黄酮以及生物碱等活性成分，长期以来作为一种药食同源的食品被用来预防和改善肥胖、糖尿病等代谢综合征 2 。苦瓜多糖是一种苦瓜中重要的生理活性成分 3 。已有研究表明，苦瓜多糖具有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、抗病毒、降血糖、降胆固醇、抗炎以及免疫调节等作用 4。苦瓜皂苷是一种植物糖苷，存在于苦瓜的根、茎、叶及果实中,以三皂苷为主，具有调脂降糖的作用 5 。但对于苦瓜多糖和皂苷联合改善脂代谢、缓解脂质沉积的研究较少，为了对苦瓜资源的开发提供更科学的数据，可深入研究其活性成分联合降脂活性。秀丽隐杆线虫（Caenorhabditiselegans）是一种非寄生、可独立生存且无毒无害的线虫，具有结构简单、遗传信息清楚、基因组测序完成、生长周期短、繁殖量大、易于培养观察、无害等特点 6 。线虫脂代谢通路被证实与人类高度相似，且关键调控基因相似度极高，是一种优良的模式生物。线虫脂代谢调控的核心通路有胰岛素信号通路和TGF-信号通路、核激素受体介导的信号通路、转录调节因子SREBP调节的信号通路、5 一羟色胺介导的信号通路等7 。因此，本实验旨在利用添加葡萄糖建立秀丽隐杆线虫肥胖模型，探讨苦瓜多糖与苦瓜皂苷联合作用对秀丽隐杆线虫脂质沉积的影响，并探究苦瓜多糖与皂苷调节脂代谢是否具有协同作用。1材料与方法1.1材料与试剂苦瓜,购自扬中绿健苦瓜种植基地;线虫N2野生型菌株、大肠杆菌E.coliOP50，实验室保存。油红染色液，购于上海生工生物工程有限公司;甘油三酯(TG)和蛋白检测试剂盒，购于南京建成生物工程研究所；其他生化试剂，购自国药集团上海化学试剂有限公司。1.2仪器设备体视显微镜，南京江南永新光学有限公司；多功能酶标仪，赛默飞世尔科技；正置显微镜，尼康光学仪器（中国）有限公司；线虫培养箱，上海一恒有限公司；FD8 型真空冷冻干燥机，北京博医康有限公司；超净台，苏州净化设备有限公司。1.3试验方法1.3.1苦瓜多糖和苦瓜皂苷的制备苦瓜多糖的提取：采用热水浸提一乙醇沉淀的Vol.30,2023,No.5经典方法。称取2 5 g苦瓜冻干粉，9 5%乙醇回流2h得滤渣，滤渣经9 0 热水浸提3 次，收集滤液，浓缩后采用 Sevage法除蛋白，经醇沉、透析、冻干后即得苦瓜多糖（BPS）。苦瓜皂苷的提取：称取苦瓜冻干粉1 0 0 g，石油醚脱脂，残渣加7 5%乙醇8 0 回流提取2 次，收集滤液，用水饱和的正丁醇萃取3 次，取正丁醇相浓缩至呈褐色粘稠状时冷却，甲醇溶解后加人丙酮充分搅拌使之产生沉淀，离心，重复2 次，冷冻干燥得到苦瓜皂苷（BMS）。1.3.2线虫培养线虫以大肠杆菌OP50为食，在2 0 培养箱中培养。线虫同步化处理：用M9缓冲液将处于产卵期的线虫清洗至EP管中，离心弃上清，再加入M9缓冲液清洗两遍。洗净之后加入裂解液（0.5 mol/LNaOH溶液和体积分数2.5%NaCIO)，涡旋震荡。线虫裂解充分后，离心弃上清，M9缓冲液反复清洗3次，将虫卵转移至2 0 培养箱中孵育过夜得L1期幼虫，待试验所用。1.3.3模型的建立及试验分组配置含1 0 0 mmol/L葡萄糖的培养基，将同步化处理的L1期线虫转到高糖培养皿上培养48 h，即可建立肥胖线虫模型 8 。试验分为正常组、模型组、BPS 组(1 0 0 0 g/mL BPS)、BMS 组(1 0 0 g/mLBMS),BPS+BMS 组(5 0 0 g/mL BPS 和 5 0 g/mLBMS),将BPS和BMS分别与大肠杆菌OP50菌液1：1 混匀，在高糖培养皿中加人混合液1 0 0 L/个，将处于L1期幼虫转到各组NGM培养皿上，恒温培养48 h，即可进行试验处理。1.3.4线虫体长和体宽的测定BPS和BMS处理线虫48 h后，随机挑取3 0 条左右线虫到M9缓冲液中,6 0%异丙醇固定后，采用正置显微镜拍照，并用ImageJ对线虫体长和体宽进行定量。1.3.5线虫运动指标的测定BPS和BMS处理线虫48 h后，参考白娟等 9 的方法测定头部摆动频率和身体弯曲频率。头部摆动频率：记录1 min内线虫头部摆动次数，一个往返为摆动1 次；身体弯曲频率：记录1 min内线虫身体弯曲次数，假设以咽泵的方向规定为轴，在爬行过程中，线虫身体沿着轴方向完成1 次正弦运动即为1 个身体弯曲。每组测定3 0 条线虫。29食品科技1.3.6油红0 染色M9缓冲液收集BPS和BMS处理48 h后的线虫，离心弃上清，加人6 0%异丙醇脱水固定，离心弃上清，加入5 0 0 L油红O染色液，室温避光震荡61 8 h 后离心弃上清，加人0.0 1%Triton-X100，在正置显微镜下拍照。1.3.7甘油三酯含量测定BPS和BMS 处理同步化L1 线虫 48 h 后,用M9缓冲液洗线虫3 遍，自然沉降，弃上清，加人适量M9重悬，超声破碎后离心取上清液。根据甘油三酯试剂盒说明书测定含量，蛋白质含量根据Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定。每组3 个平行试验。1.4数据处理采用DPS软件进行统计分析，结果用平均值土标准误差表示。采用ANOVA单因素方差分析比较多组间的差异显著性，p0.05为具有显著差异。700r600贾董浩等：苦瓜多糖和皂苷对秀丽隐杆线虫脂代谢的调节作用2结果与讨论2.1苦瓜多糖和皂苷对线虫体长和体宽的影响秀丽隐杆线虫的基础生理指标如体长、体宽会受到食物和生长环境的影响，可反映其生长状态 1 0 1。图1 展示的是苦瓜多糖和皂苷添加后对线虫体长和体宽的影响。从图1(a)可知，添加葡萄糖后，线虫的体长显著高于正常组（p0.05），可能是因为高糖环境刺激了线虫，导致体长应激性增加。苦瓜皂苷添加后，线虫体长显著减小（p0.05）；添加苦瓜多糖和苦瓜皂苷培养的线虫身体弯曲频率均显示出高于模型组的现象，且苦瓜多糖和皂苷联合添加的线虫身体弯曲频率的升高最为显著（2 5.7 9 次数/min对比1 8.42 次数/min）(p0.05)。以上结果表明苦瓜多糖和苦瓜皂苷均能通过增加线虫运动行为增加能量消耗，且二者联合添加时效果最优，具有协同增加线虫能量消耗的作用。预示苦瓜多糖和皂苷可能具有协同调节脂代谢的作用。30粮食与食品工业Cereal and Food Industry45a4035(uu/)/2提卡302520151050正常组模型组BPS1000BMS100BPS+BMSa.线虫头部摆动频率图2 苦瓜多糖和皂苷对线虫运动行为的影响2.3苦瓜多糖和皂苷对线虫脂肪沉积的影响秀丽隐杆线虫的脂肪主要位于皮下组织及肠道，呈脂滴状。脂溶性染料油红O可特异性地附着于中性脂肪分子而使其呈现红色，因此可直接观察到线虫体内脂肪沉积的情况。通过油红染色，可以初步判断脂肪沉积情况。如图3 所示，与正常组相比，模型组线虫体内红色较深且染色面积较大。BPS100组和BMS100组体内红色均变浅，BPS+BMS组体内红色较浅且染色面积较小。通过Im-ageJ软件进一步分析油红O染色图像，测定线虫脂肪占比，可以较为准确的分析功能成分对线虫的脂肪沉积影响。从图4可以看出，模型组的相对脂肪含量相较正常组有显著增加（5 4.2 4%对比62.88%）;经过苦瓜多糖和皂苷处理后的线虫相对脂肪含量较模型组均显著降低（p0.05）,其中苦瓜皂苷处理过的线虫相对脂肪含量降低最明显（5 5.8 0%对比6 2.8 8%）。这表明苦瓜多糖和苦瓜皂苷均能有效减少线虫体内的脂肪沉积，且苦瓜多糖和皂苷可以联合降低线虫体内脂肪沉积。正常组模型组2.4苦瓜多糖和皂苷对线虫甘油三酯含量的影响油红染色结果已显示苦瓜多糖和皂苷可以协同降低高糖诱导的肥胖线虫体内的脂肪沉积，为进一步研究苦瓜多糖和皂苷的协同降脂作用，我们继续测定线虫体内甘油三酯水平。如图5 所示，模Vol.30,2023,No.535aaaBPS 1000BMS 100BPS+BMS图3 线虫油红0 染色图aa30ab(au/x)/甲泉长2520151050正常组模型组BPS1000BMS100BPS+BMSb.线虫身体弯曲频率ab60OH50%/1早403020100正常组模型组BPS1000BMS100BPS+BMS图4苦瓜多糖和皂苷对线虫脂肪沉积的影响型组线虫体内的甘油三酯含量明显高于正常组(0.82mg/gprot对比1.6 9 mg/gprot)，而添加苦瓜多糖和苦瓜皂苷后线虫体内的甘油三酯含量均不同程度地低于模型组（p0.05），且添加BPS+BMS组线虫体内的甘油三酯含量最低（0.5 2 mg/gprot）。线虫体内甘油三酯含量的变化与线虫脂肪沉积的结果一致，均表明苦瓜多糖和皂苷可以协同调节线虫脂代谢。前期研究表明，苦瓜多糖和苦瓜皂苷均能调节HepG2细胞和线虫的脂代谢L4-5，而本研究进一步证实了苦瓜多糖和皂苷可以发挥协同降脂作用。2.01.81.61.41.2100um1.00.80.60.40.20正常组楼模型组BPS1000BMS100BPS+BMS图5 苦瓜多糖和皂苷对线虫甘油三酯含量的影响31bbabTabbbcbbcb食品科技3结论综上所述，苦瓜多糖和苦瓜皂苷均对N2野生型线虫的生长无抑制作用，且能降低线虫的体宽、增加身体弯曲频率，具有一定的协同作用；同时还能减少N2野生型线虫体内的脂肪堆积，降低体内的甘油三酯含量，且二者联合添加时效果最优，具有协同调节脂代谢的作用。研究结果为我们开发以苦瓜为主要成分的降脂功能食品提供了依据。参考文献i Chooi Y C,Ding C,Magkos F.The epidemiology of o-besity JJ.Metabolism,2019,92:6-10.2 Dwijayanti D R,Shimada T,Ishii T,et al.Bitter melonfruit extract has a hypoglycemic effect and reduces he-patic lipid accumulation in ob/ob mice J.Phytothera-py Research,2020,34(6):1338-1346.3 张易，董英，祝莹，等苦瓜碱提多糖调节HepG2细胞胰岛素抵抗的途径LJ.中国食品学报，2016,16(12):10-16.4 Zhu Y,Bai J,Zhou Y,et al.Water-soluble and alkali-soluble polysaccharides from bitter melon inhibitedlipid accumulation in HepG2 cells and Caenorhabditis el-egans JJ.International Journal of Biological Macromol-贾董浩等：苦瓜多糖和皂苷对秀丽隐杆线虫脂代谢的调节作用ecules,2021,166:155-165.L5 Bai J,Zhu Y,Li J,et al.Effects of Bitter Melon Sapo-nin on the Glucose and Lipid Metabolism in HepG2 Celland C.elegans J.Journal of Food Quality,2020.DOI:10.1155/2020/8860356.6王高坚，王珍珍，李嘉嘉，等蓝莓酵素的体外抗氧化及对秀丽隐杆线虫的氧化应激保护作用J.食品工业科技，2 0 2 1，42（1 5)：3 43.7 Yue Y,Li S,Shen P,et al.Caenorhabditis elegans as amodel for obesity research J.Current Research inFood Science,2021,4:692-697.8孙鑫娟发酵大麦-葡聚糖的特性及其对脂代谢调节作用研究MJ镇江：江苏大学，2 0 2 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