抗缪勒氏管激素抑制山麻鸭卵泡发育分子机制的研究.pdf

中国畜牧兽医 ,():C h i n aA n i m a lH u s b a n d r y&V e t e r i n a r yM e d i c i n e抗缪勒氏管激素抑制山麻鸭卵泡发育分子机制的研究周晓莉,张焯深,沈栩,潘建秋,黄运茂,江丹莉(仲恺农业工程学院动物科技学院,广州 )摘要:【目的】探究抗缪勒氏管激素(a n t i M l l e r i a nh o r m o n e,AMH)抑制山麻鸭卵泡发育的分子调控机制.【方法】选取 只 周龄产蛋山麻鸭,随机分为组:AMH、AMH、AMH 和对照组,AMH、AMH 和AMH 组给予、和 g/dAMH多肽;对照组给予同等体积的生理盐水,整个试验持续 d;每天记录产蛋量,在试验末采集卵巢 和 卵 泡 进 行 计 数,称 重 计 算 卵 巢 指 数,测 定 血 清 促 黄 体 生 成 素(l u t e i n i z i n gh o r m o n e,LH)、孕 酮(p r o g e s t e r o n e,P)和雌二醇(e s t r a d i o l,E)水平,检测等级卵泡(F)、小黄卵泡(S Y F)和大白卵泡(LWF)中卵泡刺激素受体(F S HR)、促黄体生成素受体(LHR)、类固醇生成急性调节蛋白(S t A R)、羟类固醇脱氢酶(H S D)、雌激素合成酶(C Y P A)、生长分化因子(G D F)、骨形态发生蛋白(BMP )基因表达量,以及F 和S Y F中S t A R、G D F 蛋白表达水平.【结果】与对照组相比,AMH 和AMH 组的产蛋率显著下降(P ),其中AMH 组对产蛋率的抑制作用最为明显;AMH 和AMH 组S Y F和LWF数量显著上升(P ),而卵巢指数和L Y F数量没有明显变化,血清LH、P和E水平呈剂量依赖性下降,AMH 组对生殖激素抑制作用较明显,其中AMH 组LH水平显著下降(P ).与对照组相比,在F 中,AMH 组G D F基因和AMH 组BMP 基因表达水平显著上升(P );在S Y F中,除AMH 组G D F基因外,各试验组F SHR基因表达水平显著下降,G D F和BMP 基因表达水平显著上升(P ),AMH 组G D F 蛋白水平显著上升(P );在LWF中AMH 和AMH 组的G D F和BMP 基因表达水平显著上升(P ).给予外源性AMH对F 和LWF中C Y P A、HS D和S t A R基因表达水平均无显著影响(P ),在S Y F中,AMH、AMH 和AMH 组中C Y P A、HS D和S t A R基因表达水平均显著低于对照组(除AMH 组的C Y P A基因外,P );与对照组相比,给予外源性AMH对F 和S Y F中S t A R的蛋白水平均无显著影响(P ).【结论】g/d外源性AMH可显著抑制卵泡发育,主要通过抑制LH、P和E的分泌,上调卵泡中G D F 和BMP 表达水平,下调F S HR和LHR以及影响类固醇激素合成通路关键因子的表达来影响卵泡发育.关键词:抗缪勒氏管激素(AMH);促性腺激素受体;类固醇;卵泡发育;山麻鸭中图分类号:S 文献标识码:AD o i:/j c n k i 开放科学(资源服务)标识码(O S I D):修回日期:基金项目:广东省自然科学基金(A );广东省科技厅科技特派员项目(K T P );广州市科技计划基础与应用基础研究项目()联系方式:周晓莉,E m a i l:z h o u x i a o l i c o m.通信作者江丹莉,E m a i l:d a n l i c o mS t u d yo nt h eM o l e c u l a rM e c h a n i s mo f I n h i b i t i o no fF o l l i c u l a rD e v e l o p m e n ti nS h a n m aD u c k sb yA n t i M l l e r i a nH o r m o n eZ HOUX i a o l i,Z HANGZ h u o s h e n,S HE NX u,P ANJ i a n q i u,HUANGY u n m a o,J I ANGD a n l i(C o l l e g e o fA n i m a lS c i e n c ea n dT e c h n o l o g y,Z h o n g k a iU n i v e r s i t yo fA g r i c u l t u r ea n dE n g i n e e r i n g,G u a n g z h o u ,C h i n a)A b s t r a c t:【O b j e c t i v e】I n v e s t i g a t i n g t h e i n h i b i t i o no f a n t i M l l e r i a nh o r m o n e(AMH)o n f o l l i c u l a rd e v e l o p m e n t a n dt h em o l e c u l a rm e c h a n i s mi nS h a n m ad u c k s【M e t h o d】h e a l t h y w e e k o l dS h a n m ad u c k sw e r er a n d o m l yd i v i d e di n t og r o u p s AMH,AMH a n dAMH g r o u p sw e r e中国畜牧兽医 卷g i v e n,a n d g/dAMHf o r d,r e s p e c t i v e l y A n dt h ec o n t r o lg r o u pw a sg i v e ns a l i n e D u r i n gt h ee x p e r i m e n t,e g gp r o d u c t i o nw a sr e c o r d e dd a i l y S a m p l e sw e r ec o l l e c t e da tt h ee n do ft h i se x p e r i m e n t,t h en u m b e ro ff o l l i c l e sw e r ec o u n t e d,a n dc a l c u l a t e dt h eg o n a d o s o m a t i ci n d e x(G S I)S e r u ml u t e i n i z i n gh o r m o n e(LH),p r o g e s t e r o n e(P)a n de s t r a d i o l(E)l e v e l s,t h eg e n ee x p r e s s i o nl e v e l so fF o l l i c l es t i m u l a t i n gh o r m o n er e c e p t o r(F S HR),l u t e i n i z i n gh o r m o n er e c e p t o r(LHR),s t e r o i d o g e n i ca c u t er e g u l a t o r yp r o t e i n(S t A R),h y d r o x y s t e r o i dd e h y d r o g e n a s e(H S D),e s t r o g e n s y n t h a s e(C Y P A),g r o w t h d i f f e r e n t i a t i o n f a c t o r(G D F),b o n em o r p h o g e n e t i cp r o t e i n(BMP )i ng r a d e df o l l i c l e s(F),s m a l ly e l l o wf o l l i c l e s(S Y F)a n dl a r g ew h i t ef o l l i c l e s(LWF),a n dt h ep r o t e i nl e v e l so fS t A Ra n dG D F i nF a n dS Y F w e r ed e t e c t e d【R e s u l t】C o m p a r e dw i t hc o n t r o lg r o u p,t h el a y i n gr a t ew e r es i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e di nAMH a n dAMH g r o u p s(P ),a n dAMH g r o u ps h o w e dt h em o s ts i g n i f i c a n t i n h i b i t i o no f e g gp r o d u c t i o nr a t e T h en u m b e r so fS Y Fa n dLWFw e r e s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d i nAMH a n dAMH g r o u p s(P ),w h i l eG S Ia n dt h en u m b e r so fL Y Fh a dn os i g n i f i c a n t t r e n d S e r u mLH,P a n d E l e v e lw e r ei nd o s e d e p e n d e n tr e d u c t i o n,a n d AMH g r o u ps h o w e da m o r ep r o n o u n c e d i n h i b i t i o no f t h e s eh o r m o n e s LHl e v e lw a ss i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e di nAMH g r o u p(P )C o m p a r e dw i t hc o n t r o lg r o u p,t h ee x p r e s s i o no fG D Fg e n ei nAMHg r o u pa n dBMP g e n e i nAMH g r o u pw e r es i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d i nF(P )I nS Y F,e x c e p t f o rG D Fg e n e i n t h eAMH g r o u p,t h e e x p r e s s i o no fF SHRg e n ew a s s i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e d,w h i l et h ee x p r e s s i o no fG D Fa n dBMP g e n e s i ne a c he x p e r i m e n tg r o u pw e r es i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d(P )T h eG D F p r o t e i n l e v e l i nAMH g r o u pw a s s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d(P )T h ee x p r e s s i o no fG D Fa n dBMP g e n e s i nAMH a n dAMH g r o u p sw e r es i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e di nLWF(P )T h ea d m i n i s t r a t i o no fe x o g e n o u sAMH d i dn o ts i g n i f i c a n t l ya f f e c tt h ee x p r e s s i o no fC Y P A,HS Da n dS t A Rg e n e si n F a n d LWF(P )I n S Y F,C Y P A,HS Da n dS t A Rg e n e sw e r eo b s e r v e d i nAMH,AMH,a n dAMH g r o u p sw e r es i g n i f i c a n t l y l o w e r t h a nt h o s eo f c o n t r o l g r o u p(e x c e p t f o rC Y P Ag e n e i nAMH g r o u p,P )C o m p a r e dw i t hc o n t r o lg r o u p,t h ea d m i n i s t r a t i o no fe x o g e n o u sAMHh a dn os i g n i f i c a n te f f e c to nt h ep r o t e i n l e v e l so fS t A Ri nF a n dS Y F(P )【C o n c l u s i o n】g/de x o g e n o u sAMHc o u l ds i g n i f i c a n t l y i n h i b i t f o l l i c u l a rd e v e l o p m e n t,m a i n l yb y i n h i b i t i n gt h es e c r e t i o no fLH,P,a n dE,u p r e g u l a t i n gt h ee x p r e s s i o no fG D F a n dBMP i nf o l l i c l e s,d o w n r e g u l a t i n gt h ee x p r e s s i o no fF S HR a n d LHR,a s w e l la sk e yf a c t o r sa f f e c t i n gs t e r o i d h o r m o n es y n t h e s i sp a t h w a y s K e yw o r d s:a n t i M u l l e r i a nh o r m o n e(AMH);g o n a d o t r o p i nr e c e p t o r;s t e r o i dh o r m o n e;f o l l i c u l a rd e v e l o p m e n t;S h a n m ad u c k s禽类的卵泡发育是一个复杂的生理过程,涉及一系列复杂的生化和生理变化.据报道,抗缪勒氏管激素(a n t i M l l e r i a nh o r m o n e,AMH)与卵泡发育和选择密切相关.AMH又称缪勒氏抑制物质(M I S)或缪勒氏抑制因子(M I F),属于转化生长因子超 家 族(t r a n s f o r m i n g g r o w t hf a c t o rb e t a,T G F)中的一员,是卵泡发育的重要调控因子.目前AMH影响卵泡发育的相关研究主要集中在哺乳动物上.研究表明,AMH可抑制哺乳动物原始卵泡的激活、卵泡生长和选择;随着卵泡的发育和体积增大,AMH表达量逐渐下降,提示AMH水平可能会影响卵泡发育;AMH基因敲除小鼠在卵泡刺激素(f o l l i c l e s t i m u l a t i n gh o r m o n e,F S H)低水平条件 下,卵巢中 有更多的腔前 卵泡,提示AMH影响F S H对卵泡的促进作用;同样,AMH对AMH基因敲除小鼠卵巢中原始卵泡的募集起抑制作用;羊 主 动 免 疫AMH的 研 究 表 明,抑 制AMH的生物学活 性 可 以 增 加 有 腔 卵 泡 数 量;AMH通 过 下 调 小 鼠 卵 巢 中 促 黄 体 生 成 素 受 体(l u t e i n i z i n gh o r m o n er e c e p t o r,LHR)、卵泡刺激素期周晓莉等:抗缪勒氏管激素抑制山麻鸭卵泡发育分子机制的研究受 体(f o l l i c l e s t i m u l a t i n g h o r m o n e r e c e p t o r,F S HR)和类固醇生成急性调节蛋白(s t e r o i d o g e n i ca c u t er e g u l a t o r yp r o t e i n,S t A R)的表达来抑制卵泡发育;在小鼠和羊颗粒细胞和猪膜细胞培养液中添加AMH可显著下调芳香化酶的表达和E的分泌.以上研究均表明AMH主要通过影响促性腺激素和类固醇激素来调控哺乳动物卵泡发育.与哺乳动物相比,AMH调控禽类卵泡发育的研究较少.据报道,在禽类中,AMH表达水平同样随着卵泡生长逐渐下降 ,提示AMH可能影响禽类卵泡发育;与高产母鸡相比,低产母鸡卵泡和卵巢中AMH表达量显著提升.以上研究均提示AMH在禽类卵泡发育过程中起着负向调节作用,但具体作用机制尚不明确.因此,本研究通过给予山麻鸭外源性AMH,探究其对山麻鸭卵泡发育的影响,揭示AMH抑制禽类卵泡发育的机制.材料与方法 主要试剂AMH多 肽为化学合 成的鸭 氨 基 酸 序 列(C QG L E V R K F P NMVA E E),由上海强耀生物科技有限 公 司 合 成,纯 度.P r i m e S c r i p tTMR TR e a g e n t K i t w i t h g D NA E r a s e r(P e r f e c t R e a l T i m e)试 剂 盒 购 于T a K a R a公 司;P o w e r U PTMS Y B RTMG r e e n M a s t e r M i x购于A p p l i e dB i o s y s t e m s公司;W e s t e r nb l o t t i n g及I P细胞裂解液均购于上海碧云天生物技术有限公司;S t A R抗体、a c t i n抗体均购于A f f i n i t yB i o s c i e n c e s公 司;生 长 分 化 因 子(G D F)抗体购于A b c a m公司;T r i z o l购于A m b i o n公司;孕酮(P)试剂盒购自E l a b s c i e n c e公司;促黄体生成素(L H)试剂盒购于S i g n a l w a yA n t i b o d y公司;雌二醇(E)试剂盒购于C u s a b i o公司.试验设计试验选取 只 周龄的产蛋山麻鸭,采取笼养模式,随机分为组,每组 只.AMH、AMH 和AMH 组给予、和 g/d的AMH多肽,对照组(C ON)给予同等体积的生理盐水,整个试验持续 d,期间记录每天产蛋量,计算整个试验期间各组的平均产蛋率.山麻鸭的饲养规程及免疫程序按照仲恺农业工程学院试验动物养殖场安全养殖技术规范进行.方法 性腺指数及等级卵泡测定试验第 天每组随机挑选只鸭进行称重,翅下采血后宰杀并采集卵巢和卵泡,称重计算卵巢指数(G S I):卵巢指数()卵巢和卵泡总重(g)/体重(g).收集等级卵泡(L Y F,直径mm),由大到小排列分别为F、F、F、F、F、F,小黄卵泡(S Y F,直径为mm)及大白卵泡(LWF,直径为mm)并进行计数,取最小的等级卵泡F、S Y F和LWF,置于液氮中速冻后转至 保存备用.血清指标测定全血样品于室温静置h后 r/m i n离心 m i n,取上清于 保存,用于LH、E和P水平测定,测定方法按照E L I S A试剂盒说明书操作.R NA提取和c D NA合成采用T r i z o l法 提 取F、S Y F和LWF卵 泡 总R NA,采 用P r i m e S c r i p tTMR TR e a g e n tK i tw i t hg D NAE r a s e r(P e r f e c tR e a l T i m e)反 转 录 试 剂 盒 合 成c D NA,于 保存备用,用于后续荧光定量P C R分析.实时荧光定量P C R测定基因表达量根据N C B I上鸭F S HR、L HR、S t A R、羟类固醇脱氢酶(H S D)、雌激素合成酶(C Y P A)、G D F和骨形态发生蛋白(B M P )基因参考序列,使用O l i g o 软件设计实时荧光定量引物(表),引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成.以反转录获得的c D NA为模板进行实时荧光定量P C R.P C R反应体系 L:P o w e r U PTMS Y B RTMG r e e nM a s t e r M i x L,c D N AL,上、下 游 引 物 各L,d d HOL.P C R反应程序:m i n;s,m i n,共 个循环.每个样品个重复,以a c t i n作为内参基因,用 C t计算基因的相对表达量.蛋白免疫印迹测定蛋白表达量提取F 和S Y F卵泡的总蛋白,B C A法测定总蛋白浓度,蛋白变性后上样于 S D S P A G E.电泳 V m i n,V m i n.电泳结束后将蛋白转至P V D F膜,mA,m i n,脱脂牛奶室温封闭h,S t A R、G D F 和 a c t i n抗体孵育过夜,P B S T洗次,每次 m i n.羊抗鼠和羊抗兔二抗室温孵育h,P B S T洗次,每次m i n.E C L试剂盒显色,将膜置于化学发光仪中进行曝光,拍照并保存.采用I m a g eJ软件对蛋白条带进行灰度值分析.数据统计分析试验数据使用S P S S 软件进行单因素方差分析,组间差异显著性采用L S D多重比较法进行检验,结果以平均值标准误表示,P 表示差异显著.中国畜牧兽医 卷表引物信息T a b l eP r i m e r i n f o r m a t i o n基因G e n e s引物序列P r i m e r s e q u e n c e s()长度L e n g t h/b pG e n B a n k登录号G e n B a n ka c c e s s i o nN o a c t i nF:C C T C T T C C A G C C A T C T T T C T TR:T G T T G G C A TA C A G G T C C T T A C XM_ F SHRF:AG C A C C T T C C AA G C C T T AG AR:T GA C C A T G GAA G G C AG A T G T XM_ LHRF:G T A A C A C T G G A A T A A G G G A A TR:G AA G G C A T G A C T G T G G A TA XM_ S t A RF:C T G C C C A T C T C C TA C C G C C C A CR:C T G C T C C A C C A C C A C C T C C A XM_ HS DF:AG AA G T G A C AG G C C C AAA C TR:A C A T G G A T C T C A G G G C A C AA XM_ C Y P AF:G G A T G G GA G TA G G T AA T G C CR:A C AA GA C C AG G A C C A GA C AG NM_ G D FF:A T C T G T T C C C AA G C C C T C TR:G GA T T C A C C C A C T A C C G A C XM_ BMP F:T C C T C T T C C T C AA T GA C A C T CR:A G G G AG C AG T C G C T T T T A T C XM_ 结果 给予外源性AMH对山麻鸭卵巢指数和卵泡发育的影响由图可知,给予外源性AMH处理后,与对照组()相比,AMH 和AMH 组产蛋率(和 )显著下降(P ),其中,AMH 组产蛋率显著低于AMH 和AMH 组(P ).各组间卵巢指数无显著差异(P ).剖检鸭进行卵泡计数,结果显示各组间L Y F数没有显著差异(P ),但AMH 和AMH 组中S Y F和LWF显著高于对照组(P )(表).数据肩标不同字母表示差异显著(P );肩标相同字母或无字母标注表示差异不显著(P ).下同V a l u e sw i t hd i f f e r e n t l e t t e rs u p e r s c r i p t sm e a ns i g n i f i c a n td i f f e r e n c e(P );W h i l ew i t ht h es a m eo rn ol e t t e rs u p e r s c r i p t sm e a nn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c e(P )T h es a m ea sb e l o w图外源性AMH对山麻鸭产蛋率(A)和卵巢指数(B)的影响F i g E f f e c t o f e x o g e n o u sAMHo n l a y i n gr a t e(A)a n dG S I(B)i nS h a n m ad u c k s表外源性AMH对山麻鸭不同发育阶段卵泡数量的影响T a b l eE f f e c t o f e x o g e n o u sAMHo nn u m b e ro f f o l l i c l e s i nd i f f e r e n td e v e l o p m e n t s t a g e s i nS h a n m ad u c k s项目I t e m s对照组C ONAMH AMH AMH L Y F S Y F b a a a bLWF b a a a b同行数据肩标不同字母表示差异显著(P );肩标相同或无字母标注表示差异不显著(P ).下同I nt h es a m er o w,v a l u e sw i t hd i f f e r e n t l e t t e rs u p e r s c r i p t sm e a ns i g n i f i c a n td i f f e r e n c e(P );W h i l ew i t ht h es a m eo rn ol e t t e rs u p e r s c r i p t sm e a nn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c e(P )T h es a m ea sb e l o w期周晓莉等:抗缪勒氏管激素抑制山麻鸭卵泡发育分子机制的研究 给予外源性AMH对山麻鸭血清生殖激素水平的影响由图可知,给予外源性AMH,山麻鸭血清中LH、P和E水 平 呈 现 剂 量 依 赖 性 下 降,其 中AMH 组LH水平显著低于对照组(P );各组间P和E水平均无显著差异(P ).图外源性AMH对山麻鸭血清生殖激素水平的影响F i g E f f e c t o f e x o g e n o u sAMHo nr e p r o d u c t i v eh o r m o n e l e v e l s i nS h a n m ad u c k s 给予外源性AMH对山麻鸭卵泡发育相关因子表达的影响在基因 表 达 方 面,与 对 照 组 相 比,在F 中,AMH 组G D F基因和AMH 组BMP 基因表达水平均显著升高(P ,图 A);在S Y F中,AMH、AMH 和AMH 组F SHR基因表达水平显著下降,其中AMH 组的抑制作用最为明显;G D F(除AMH 组)和BMP 基因表达水平显著上升(P ,图 B);在LWF中AMH 和AMH 组的G D F和BMP 基因表达水平显著上升(P ,图 C).AC,分别为F、S Y F、LWF中相关基因表达量;D和E,分别为F 和S Y F中相关蛋白表达量.下同A C,T h ee x p r e s s i o no f r e l a t e dg e n e s i nF,S Y Fa n dLWF,r e s p e c t i v e l y;Da n dE,T h ee x p r e s s i o no f r e l a t e dp r o t e i n s i nF a n dS Y F,r e s p e c t i v e l y T h es a m ea sb e l o w图外源性AMH对山麻鸭卵泡发育相关因子表达水平的影响F i g E f f e c t o f e x o g e n o u sAMHo nt h e e x p r e s s i o no f f o l l i c u l a rd e v e l o p m e n t r e l a t e df a c t o r s i nS h a n m ad u c k s中国畜牧兽医 卷在蛋白表达方面,在F 中各试验组G D F 蛋白水平与对照组相比均没有显著性差异(P ,图 D);在S Y F中AMH 组G D F 蛋白表达量显著高于对照组(P ,图 E).给予外源性AMH对山麻鸭类固醇生成通路的影响在基因表达水平方面,给予外源性AMH对于F 和LWF中C Y P A、HS D和S t A R基因的表达水平均无显著影响(图 A、C),在S Y F中,AMH、AMH 和AMH 组中C Y P A、HS D和S t A R基因的表达水平均显著低于对照组(P ,除AMH 组的C Y P A基因外,图 B).在蛋白表达水平方面,与对照组相比,给予外源性AMH对F 和S Y F中S t A R的蛋白水平均无显著影响(P ,图 D、E).图外源性AMH对类固醇生成通路相关因子表达水平的影响F i g E f f e c t o f e x o g e n o u sAMHo nt h e e x p r e s s i o no f s t e r o i db i o s y n t h e s i sp a t h w a y r e l a t e df a c t o r s i nS h a n m ad u c k s讨论禽类卵泡发育是一个十分复杂的过程,卵泡需严格按照等级次序排列,母禽每天都会有一个最大的卵泡发育成熟并排出.禽类高产的基础是良好的卵泡发育及等级排列次序.AMH在调节卵泡发育中起着重要作用,但其调控卵泡发育的分子作用机制目前尚不明确.因此本研究通过给予产蛋山麻鸭外源性AMH,探究AMH对禽类卵泡发育及相关调控 因 子 的 影 响.试 验 结 果 表 明,给 予 外 源 性AMH影响山麻鸭产蛋性能,其中连续给予 g/d外源性AMH显著下调山麻鸭产蛋率.前人研究发现给予外源性AMH使母鸡产蛋水平下降;主动免疫AMH以抑制机体内AMH的生物活性可以提高鹅的产蛋数,这些研究均表明AMH可以抑制禽类卵泡发育并影响其产蛋性能.研究表明,当禽类产蛋水平得到提升时,其等级卵泡、SWF和LWF数量增加;而当产蛋受到抑制时,母禽的各发育阶段的卵泡数量均有所减少 .但本试验结果发现给予外源性AMH下调山麻鸭的产蛋水平时,S Y F和LWF的数量反而显著增加,等级卵泡数量无明显变化.提示AMH可能在等级前卵泡中发挥抑制作用.相关研究发现,母鸡的非限制饲喂使卵泡数量显著增加,但这种过度增加导致卵泡排列次序紊乱及产蛋水平下降,同时发现卵泡中AMH表达水平期周晓莉等:抗缪勒氏管激素抑制山麻鸭卵泡发育分子机制的研究显著增加.通过转录组学分析鸡卵泡选择前后基因表达的变化,发现卵泡选择前后AMH发生了显著变化.禽类卵泡选择和等级次序排列是产蛋的基础,卵泡排列次序紊乱会影响其发育及排卵.因此,AMH可能通过影响等级前卵泡发育及选择过程,导致卵泡发育停滞而引起排列次序紊乱,最终等级前卵泡无法发育成等级卵泡而影响山麻鸭产蛋性能.禽类的卵泡发育过程受到多种生殖激素的调控,其中LH是调节禽类卵泡发育的主要促性腺激素之一.LH可以通过促进类固醇激素的合成和分泌来促进卵泡发育和排卵,刺激卵泡颗粒细胞分泌P,P在芳香化酶作用下可以转化为E,当卵泡中E水平升高时,可以进一步作用于颗粒细胞,增强芳香化酶活性来促进卵泡发育 .本试验结果发现,给予外源性AMH后血清中LH水平呈剂量依赖性下降.由于内分泌系统的相互调控,LH水平的下降进一步引起P和E减少,缺少类固醇激素的刺激,鸭的卵泡发育受阻,从而导致产蛋下降.前人研究中也有类似结果,给予外源性AMH可显著降低母鸡血液中P水平;主动免疫AMH能上调浙东白鹅血浆和垂体中LH基因表达水平,进而提高鹅的产蛋数.这些研究均表明AMH可以通过下调生殖激素水平来抑制卵泡发育.卵泡发育过程中,垂体生成的F S H和LH通过与卵泡中的受体F S HR和LHR结合,促进类固醇激素的合成与分泌,进而促进卵泡发育.相关研究发现,在母鸡产蛋水平显著提升时,其不同发育阶段卵泡 中 的F S HR和LHR表 达 水 平 均 有 所 提升.在禽类卵泡发育进程中,需每天从S Y F中选出一个卵泡进入等级发育,形成等级卵泡并成功排卵,S Y F的良好发育是母禽维持产蛋的前提.在本试验中,给予外源性AMH导致山麻鸭产蛋水平下降时,不同发育阶段卵泡中F SHR和LHR基因的表达均有所下降,其中显著下调S Y F中F SHR基因表达水平,表明AMH主要通过影响等级前卵泡,特别是S Y F的发育来抑制山麻鸭产蛋水平.G D F 和BMP 与AMH同属于T G F 超家族,参与卵泡发育过程.前人研究发现,番鸭就巢期G D F 表达量显著高于产蛋期;G D F 抑制牛卵泡中类固醇激素的生成;BMP 能通过下调鸡颗粒细胞中S t A R的水平进而影响孕酮分泌.在本试验中,与对照组相比,F 中AMH 组G D F和AMH 组BMP 基因表达水平显著上升;S Y F中G D F和BMP 基因表达水平显著上升(除AMH 组G D F基 因 外);LWF中AMH 和AMH 组的G D F和BMP 基因表达水平显著上升.以上结果表明AMH可能通过上调G D F 和BMP 表达量来抑制类固醇激素的分泌,进而影响卵泡发育.S t A R是类固醇合成途径的重要限速酶,为类固醇激素的合成提供原材料,研究表明S t A R在卵泡发育的各个阶段中均有表达,并调控P的合成分泌.C Y P A 能将雄烯二酮转化为雌激素,并调控卵泡发育;H S D有助于E的合成,并可以通 过 催 化 合 成 有 活 性 的P来 促 进 卵 泡 发育 .为进一步探究AMH对禽类卵泡发育的影响,通过检测给予外源性AMH对类固醇激素合成通路的影响,结果显示给予外源性AMH可显著下调S Y F中C Y P A、HS D和S t A R基因的表达,对F 和LWF中类固醇激素合成通路没有明显影响.前人研究中也有类似结果:在体外培养鸡S Y F颗粒细胞中添加AMH后能降低HS D和S t A R基因的表达水平;对体