决明子水提物对急性酒精性肝损伤小鼠的保护作用研究.pdf

440 食品与药品 Food and Drug 2023年第25卷第5期收稿日期：2022-09-27基金项目：山西省中医药大学中药炮制学科建设项目（编号：2018-1）；山西省中医药大学中药炮制研究创新团队（编号：2022TD1014）；中药炮制山西省重点实验室项目（编号：202104010910029）作者简介：闫志芳，高级实验师，研究方向：中药炮制现代研究，E-mail:*通讯作者：李秀英，副教授，博士，研究方向：中药新制剂与靶向药物系统研究，E-mail:决明子水提物对急性酒精性肝损伤小鼠的保护作用研究闫志芳，任可乐，孟祥龙，李秀英*（山西中医药大学 中药与食品工程学院，中药炮制山西省重点实验室，山西 晋中 030619）摘 要：目的 探究决明子水提物对急性酒精性肝损伤小鼠的保护作用。方法 将60只ICR小鼠随机分为空白组、模型组、阳性药水飞蓟素组（0.2 g/kg）、决明子水提物低、中、高剂量（2.25，4.5，9 g/kg）组。空白组和模型组灌胃生理盐水，给药组分别灌胃相应剂量的决明子水提物及水飞蓟素溶液，连续给药7 d，除空白组外其余各组末次给药后9 h，灌胃大剂量42白酒。观察与分析各组小鼠体质量、肝脏指数、油红O染色；检测小鼠血清和肝脏生化指标。结果 与模型组相比，决明子水提物中、高剂量组体质量显著增长，肝脏指数显著降低；决明子水提物高剂量组总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、丙二醛（MDA）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、肿瘤坏死因子（TNF-），白介素1（IL-1）和白介素6（IL-6）含量显著降低，谷胱甘肽（GSH）含量升高（P0.01，P0.05）；病理切片观察结果表明，各给药组小鼠肝脏病理变化中脂肪滴变性明显降低。结论 决明子水提物能显著减轻酒精引起的肝损伤，具有保肝的作用。关键词：决明子水提物；急性酒精性肝损伤；保肝；抗炎；脂质抗氧化中图分类号：R285 文献标识码：A 文章编号：1672-979X（2023）05-0440-06DOI：10.3969/j.issn.1672-979X.2023.05.012Protective Effect of Water Extract of Cassiae Semen on Acute Alcoholic Liver Injury in MiceYAN Zhi-fang,REN Ke-le,MENG Xiang-long,LI Xiu-ying（Shanxi Provincial Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Processing,College of Traditional Chinese Medicine and Food Engineering,Shanxi University of Chinese Medicine,Jinzhong 030619,China）Abstract:Objective To explore the protective effect of water extract of Cassiae Semen on acute alcoholic liver injury in mice.Methods Sixty ICR mice were randomly divided into blank group,model group,positive(silymarin)group(0.2 g/kg),and Cassiae Semen water extract low-dose,medium-dose and high-dose(2.25,4.5,9 g/kg)groups.The rats in blank group and model group were gavaged with physiological saline,while the rats in the experimental groups were given corresponding doses of water extract of Cassiae Semen and silymarin solution by gavage,respectively,for 7 days.Except for the blank group,the rats in the other groups were given a large dose of 42-degree Erguotou spirit by gavage at the 9th hour after the last administration.The body weight,liver index and oil Red O staining of each group were observed and analyzed.Serum and liver biochemical indexes of mice were detected.Results Compared with the model group,the mice body weight of Cassiae Semen water extract medium and high dose groups increased significantly,and the liver index decreased significantly.The levels of total cholesterol(TC),triglyceride(TG),malondialdehyde(MDA),alanine aminotransferase(ALT),aspartate aminotransferase(AST),tumor necrosis 食品与药品 Food and Drug 2023年第25卷第5期 441factor-(TNF-),interleukin-1(interleukin-1)and interleukin-6(IL-6)in the mice of Cassiae Semen water extract high dose group significantly decreased(P0.01),while the content of glutathione(GSH)increased(P0.05).The results of pathological section observation showed that among the liver pathological changes of mice,the fat droplet degeneration in each administration group was significantly reduced.Conclusion The water extract of Cassiae Semen can significantly reduce the liver injury caused by alcohol,and has the function of protecting liver.Key Words:water extract of Cassiae Semen;acute alcoholic liver injury;protecting liver;anti-inflammatory;lipid antioxidant酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）是肝脏相关疾病和肝病死亡的主要原因之一1。ALD早期表现为急性酒精性损伤，主要原因是短时间内饮用的大量酒精。肝细胞在人体消化吸收代谢酒精时，产生大量的氧自由基和多种炎性介质，这些物质使肝脏的氧化还原反应无法进行，导致脂质过氧化，损害细胞膜，细胞器的功能受到限制，肝脏受到损伤2。现代医学治疗ALD需长期服用的保肝药物会产生一定的耐药性、药源性疾病等不良反应。决明子为豆科植物钝叶决明Cassia btusifolia L.或决明（小决明）Cassia tora L.的干燥成熟种子，具有清热明目，润肠通便的作用。研究发现，决明子富含多种化学活性物质，主要包括蒽醌类、脂肪酸类、黄酮类、多糖类、苷类等3，具有保肝4、降血压5、降脂6、降糖7、抗氧化8等药理作用。其中，水溶性物质蒽醌类等被证实通过改善转氨酶水平、抗炎、调节Nrf2介导的ERK/MAPK/JNK等信号通路等，缓解酒精引起的急性肝损伤9-13。为研究决明子缓解酒精所致肝损伤，本文通过灌胃白酒建立小鼠急性酒精性肝损伤模型14，经决明子水提物给药后检测小鼠血清及肝脏组织中生化指标与血清炎性因子的变化，观察肝脏病理组织病变程度，以明确决明子水提物对于肝脏的保护作用，并探讨初步的作用机制，旨在为决明子进一步开发与利用提供实验基础与理论依据。1 材料与方法1.1 材料与试剂决明子（北京同仁堂，产地安徽，批号：220216004），经山西中医药大学张朔生教授鉴定为豆科植物钝叶决明Cassia obtusifolia L.或决明（小决明）Cassia tora L.的干燥成熟种子。白酒（42，北京红星）；水飞蓟素（批号：C10742879，麦克林）；通用型组织固定液（批号：G1101，Servicebio）；油红染液、苏木素染液、分化液、返蓝液、甘油明胶封片剂（Servicebio）；异丙醇（批号：80109218，国药集团）。甘油三酯（TG，批号：20210819）、总胆固醇（TC，批号：20210530）、丙氨酸氨基转移酶（ALT，批号：20200815）、天冬氨酸氨基转移酶（AST，批号：20210726）、丙二醛（MDA，批号：20200921）、谷胱甘肽（GSH，批号：20209717）（南京建成生物工程研究所）；肿瘤坏死因子（TNF-，批号：202109），白介素1（IL-1，批号：202107）、白介素6（IL-6，批号：202106）（上海酶免生物）；实验用水均为超纯水。1.2 仪器与设备TGL-20B高速冷冻离心机（中国上海安亭科学仪器厂）；AX224ZH/E十万分之一电子天平（奥豪斯上海）；KZ-III-FP高速低温组织研磨仪（武汉赛维尔）；SynergyHTX多功能酶标仪（美国伯腾）；RE-2000B旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；CRYOSTAR NX50冰冻切片机（Thermo）；LEICA 819切片刀（上海徕卡）；黏附载玻片（冰冻切片，白漆色带，G6012-2，Servicebio）。1.3 实验动物SPF级ICR小鼠，雄性，体重1525 g，许可证号：SCXK（京）2019-0011，合格证号：110324210102969025斯贝福（北京）。伦理批准号：AWE202209002（动物实验经山西中医药大学医学伦理委员会批准）。实验期间动物饲养于温度25，湿度40%70%的清洁级动物房。442 食品与药品 Food and Drug 2023年第25卷第5期1.4 方法1.4.1 决明子水提物的制备 称取决明子200 g，加8倍量的水，浸泡1 h，再加热回流提取2次，每次30 min，将提取液混合浓缩至200 ml（相当于生药1 g/ml），备用。1.4.2 动物分组、造模及给药 参照文献方法15，将60只小鼠适应性饲养一周，按体质量高低，随机分为空白组、模型组、阳性组、决明子水提物低、中、高剂量组（2.25，4.5，9 g/kg）（依据2020年版中国药典，通过人临床剂量换算成小鼠等效剂量，按照折合后剂量的3，9，18倍换算而得），每组10只。空白组与模型组灌胃等体积蒸馏水，阳性组灌胃水飞蓟素（0.2 g/kg），其余各给药组按照相应剂量灌胃给药，连续给药7 d。末次给药9 h后，除空白组外其余各组均按照体质量12 ml/kg一次性灌胃白酒（10 ml/kg），建立急性酒精性肝损伤模型。1.4.3 血液和组织样本采集 最后一次给药结束后，乙醚麻醉，摘眼球取血，室温静置30 min，于3000 r/min离心15 min，得待测血清，放置于-80 冰箱。分离取肝脏并称重，部分肝脏固定于组织固定液中，其余肝脏置于-80 冰箱。1.4.4 体重变化及脏器指数 记录60只小鼠体质量每日的变化，计算小鼠日平均增重；解剖取新鲜肝脏，利用生理盐水清洗干净肝脏，置于滤纸上吸干水分后，称重，计算肝脏的脏器指数。计算按式1、式2。小鼠日平均增重（g）=各组小鼠平均总增重（g）/生长天数（d）式1肝脏指数（%）=肝脏鲜重（g）/体重（g）100%式21.4.5 肝脏组织油红O染色 取肝脏组织同一部位的组织做冰冻切片，经生理盐水清洗后，用4%多聚甲醛溶液固定，冰冻切片，晾干，油红染液浸染68 min。将切片停留3 s后依次浸入60%异丙醇分化2次，各3 s和5 s，再依次浸入纯水中浸洗2次，各10 s。取出切片，停留3 s后浸入苏木素复染35 min，纯水浸洗3次，各5，10，30 s。分化液（以 60%酒精为溶剂）分化28 s，蒸馏水洗2次各10 s，返蓝液返蓝1 s，将切片轻轻浸入自来水中浸洗2次，各5 s和10 s，甘油明胶封片。在显微镜下观察肝脏组织的形态学，并采集图片10。1.4.6 生化指标检测 参照试剂盒说明，检测小鼠血清中TG、TC、ALT、AST、MDA含量以及肝脏组织中GSH的含量。1.4.7 炎性因子水平的测定 采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测小鼠血清中TNF-、IL-1、IL-6的水平。1.4.8 统计学方法 用GraphPadPrism 8.0.2统计软件进行t检验，以均数方差（s）表示为数据资料，组间比较以P0.05为差异有统计学意义。2 结果与分析2.1 对急性酒精性肝损伤小鼠体重及肝脏指数的影响与空白组相比，模型组体质量显著降低，肝脏指数显著升高（P0.05或P0.01）。体重降低表明酒精性肝损伤可能引起某些病理变化，引起小鼠食欲下降致体重增长减慢；肝脏指数显著升高说明一次性大量饮酒使得肝脏受损，导致肝脏肿大。与模型组比较，阳性药和决明子水提物高剂量组小鼠体质量增长明显，且能显著降低肝脏指数（P0.05或P0.01），结果呈剂量依赖关系。表明决明子水提物可降低小鼠的肝脏指数，缓解酒精造成的肝脏肿胀问题（见图1）。x*P0.05，*P0.01 vs 空白组；#P0.05，#P0.01 vs模型组图1 决明子水提物对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏指数、小鼠体质量的影响（s，n=10）x食品与药品 Food and Drug 2023年第25卷第5期 4432.2 对急性酒精性肝损伤的小鼠肝脏病理影响肝脏组织油红O染色结果见图2。由图2可见，空白组小鼠肝组织未见脂肪颗粒堆积。模型组与空白组对比肝细胞体积增大，出现大量的不同程度的红色脂滴聚集。与模型组相比，决明子水提物各组的脂滴聚集减少。结果表明，决明子水提物能减少急性酒精性肝损伤的小鼠体内脂质的累积。图2 决明子水提物对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏的病理变化的影响（200）2.3 对急性酒精性肝损伤小鼠血清TG、TC含量的影响与空白组相比，模型组小鼠TG、TC水平显著升高（P0.05或P0.01）。与模型组相比，决明子水提物各剂量组TG、TC含量均有下降趋势，阳性药组与决明子水提物中、高剂量组TG、TC含量呈显著下降（P0.05或P0.01）（见图3）。表明决明子水提物能有效降低急性酒精性肝损伤血清中的TC、TG水平，对急性酒精性肝损伤有一定的改善作用。2.4 对急性酒精性肝损伤小鼠血清氨基转移酶水平ALT、AST含量的影响与空白组相比，模型组小鼠ALT、AST两种氨基转移酶水平显著升高（P0.01）；与模型组相比，阳性药组与决明子水提物各剂量组ALT含量均明显下降（P0.01），且呈剂量依赖性；阳性药组与决明子水提物中、高剂量组AST含量均明显下降（P0.01）（见图4）。结果表明，决明子水提物能*P0.05，*P0.01 vs 空白组；#P0.05，#P0.01 vs 模型组图3 决明子水提物对急性酒精性肝损伤小鼠TG、TC含量的影响（s，n=10）x显著降低氨基酸转移酶的水平。2.5 对急性酒精肝损伤小鼠血清GSH含量的影响与空白组相比，模型组小鼠GSH含量显著降低（P0.01）；与模型组相比，阳性药组与决明子水提物中、高剂量组GSH含量显著升高（P0.05或P0.01）（见图5）。结果表明，决明子水提物可提高机体抗氧化酶的活性，消除酒精代谢过程中产生过多自由基及其他损害物质，从而减轻肝脏受损状况。444 食品与药品 Food and Drug 2023年第25卷第5期2.6 对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏MDA含量的影响与空白组相比，模型组小鼠MDA水平显著升高（P0.001）；与模型组相比，各剂量组均有不同程度的降低趋势，阳性药组与决明子水提物高剂量组MDA水平显著降低（P0.05或P0.01）（见图6）。结果表明，决明子水提物可减缓代谢酒精过程中脂质过氧化反应，对急性酒精性肝损伤有一定的保护作用。*P0.01 vs 空白组；#P0.05，#P0.01 vs 模型组图4 决明子水提物对急性酒精性肝损伤小鼠AST、ALT含量的影响（s，n=10）x*P0.01 vs 空白组；#P0.05 vs 模型组图5 决明子水提物对急性酒精性肝损伤小鼠GSH含量的影响（s，n=10）xx图6 决明子水提物对急性酒精性肝损伤小鼠MDA含量的影响（s，n=10）*P0.001 vs 空白组；#P0.05 vs 模型组2.7 对急性酒精性肝损伤小鼠血清TNF-、IL-6和IL-1水平的影响与空白组相比，模型组显著高于正常组（P0.01），表明酒精代谢过程中可导致小鼠肝细胞发生炎性损伤；与模型组相比，阳性药组与决明子水提物高剂量组小鼠血清TNF-、IL-6和IL-1水平显著降低（P0.05或P0.01）（见图7）。结果表明，决明子水提物可抑制炎性因子水平，发挥其肝保护作用。*P0.01，*P0.001 vs空白组；#P0.05，#P0.01 vs模型组图7 决明子水提物对急性酒精性肝损伤小鼠TNF-、IL-6、IL-1水平的影响（s，n=10）x食品与药品 Food and Drug 2023年第25卷第5期 445综上，决明子水提物对酒精引起的酒精性肝损伤有一定的保护作用，其作用机制可能与改善肝细胞代谢紊乱、降低脂质代谢、提高机体抗氧化酶活性、抑制促炎细胞因子表达有关16-26。本研究为进一步开发决明子水提物保肝等功能性产品提供理论基础，下一步将探究决明子缓解急性酒精性肝损伤的通路和靶点。参考文献1 Wang M,Ma L J,Yang Y,et al.n-3 Polyunsaturated fatty acids for the management of alcoholic liver disease:A critical reviewJ.Crit Rev Food Sci Nutr,2019,59(sup1):S116-S129.2 Louvet A,Mathurin P.Alcoholic liver disease:mechanisms of injury and targeted treatmentJ.Nature Rev Gastroenterol Hepatol,2015,12(4):231-242.3 董玉洁,蒋沅岐,刘毅,等.决明子的化学成分、药理作用及质量标志物预测分析J.中草药,2021,52(9):2719-2732.4 Seo Y,Song J S,Kim Y M,et al.Toralactone glycoside in Cassia obtusifolia mediates hepatoprotection via an Nrf2-dependent anti-oxidative mechanismJ.Food Res Int,2017,97:340-346.5 Dong X,Zeng Y,Liu Y,et al.Aloe-emodin:A review of its pharmacology,toxicity,and pharmacokineticsJ.Phytother Res,2020,34(2):270-281.6 张森,饶思静,洪芬芳,等.基于网络药理学方法研究决明子活性成分治疗动脉粥样硬化的分子机制J.南昌大学学报（医学版）,2022,62(4):1-9.7 Wang Q Y,Tong A H,Pan Y Y,et al.The effect of cassia seed extract on the regulation of the LKB1-AMPK-GLUT4 signaling pathway in the skeletal muscle of diabetic rats to improve the insulin sensitivity of the skeletal muscleJ.Diabetol Metab Syndr,2019,11:108.8 Dong X,Zeng Y,Liu Y,et al.Aloe-emodin:A review of its pharmacology,toxicity,and pharmacokineticsJ.Phytother Res,2020,34(2):270-281.9 谢薇,刘广超.决明子水溶性成分对四氯化碳所致小鼠急性肝损伤的保护作用研究J.中国民康医学,2016,28(3):76-77.10 张博,谢云亮.决明子总蒽醌对小鼠免疫性肝损伤保护作用的实验研究J.北华大学学报（自然科学版）,2018,19(6):741-744.11 Paudel P,Jung H A,Choi J S.Anthraquinone and naphthopyrone glycosides from Cassia obtusifolia seeds mediate hepatoprotection via Nrf2-mediated HO-1 activation and MAPK modulationJ.Arch Pharm Res,2018,41(6):677-689.12 梁朔,张振秋,米宝丽,等.生、炒决明子对CCl_4致大鼠急性肝损伤保护作用的比较研究J.中药材,2014,37(6):969-970.13 湛莉,汤荃荃,张梓莹,等.莓茶决明子固体饮料对大鼠慢性酒精肝损伤的保护作用J.食品与机械,2022,38(5):157-165,172.14 Lamas-Paz A,Hao F,Nelson LJ,et al.Alcoholic liver disease:Utility of animal models.World J Gastroenterol.2018,24(45):5063-5075.15 Koneru M,Sahu B D,Gudem S,et al.Polydatin alleviates alcohol-induced acute liver injury in mice:Relevance of matrix metalloproteinases(MMPs)and hepatic antioxidantsJ.Phytomedicine,2017,27:23-32.16 钟晓怡,林云,郭艳,等.高脂小鼠脂肪肝组织油红O特殊染色的应用J.上海预防医学,2018,30(10):873-877.17 任天羿.乙醛脱氢酶功能与酒精性肝损伤相关性的机制研究D.吉林大学,2020.18 Yuan R,Tao X,Liang S,et al.Protective effect of acidic polysaccharide from Schisandra chinensis on acute ethanol-induced liver injury through reducing CYP2E1-dependent oxidative stressJ.Biomed Pharmacother,2018,99:537-542.20 Jung J C,Lee Y H,Kim S H,et al.Hepatoprotective effect of licorice,the root of Glycyrrhiza uralensis Fischer,in alcohol-induced fatty liver diseaseJ.BMC Complement Altern Med,2016,16:19.21 Akbartabar Toori M,Joodi B,Sadeghi H,et al.Hepatoprotective activity of aerial parts of Otostegia persica against carbon tetrachloride-induced liver damage in ratsJ.Avicenna J Phytomed,2015,5(3):238-246.22 El-Newary S A,Shaffie N M,Omer E A.The protection of Thymus vulgaris leaves alcoholic extract against hepatotoxicity of alcohol in ratsJ.Asian Pac J Trop Med,2017,10(4):361-371.23 郝思奥,李艳,贺艳楠,等.黑果腺肋花楸黄酮提取物修复小鼠急性酒精肝损伤的研究J.食品研究与开发,2021,42(14):30-35.24 许皖,李娜,柳海艳,等.基于Keap1/Nrf2/ARE信号通路探讨葛花、枳椇子及其配伍对急性酒精性肝损伤小鼠抗氧化应激的作用机制J.中国实验方剂学杂志,2022,29(1):37-44.25 陈东方,高慧艳,徐冰,等.红景天沙棘口服液对酒精致小鼠急性肝损伤的保护作用检测J.中国卫生检验杂志,2022,32(13):1591-1593.26 An L,Wang X,Cederbaum A I.Cytokines in alcoholic liver diseaseJ.Arch Toxicol,2012,86(9):1337-1348.27 Lei Z,Xiao-Hong R,Jing H,et al.Protective effect of Phaeoporus obliquus polysaccharide against acute liver injury induced by carbon tetrachloride and alcohol in miceJ.Pak J Pharm Sci,2021,34(2):649-656.