胶原蛋白的提取及其纳米纤维的制备与表征.pdf

韩洪帅，宋秘钊，李家鑫，等.胶原蛋白的提取及其纳米纤维的制备与表征 J.食品工业科技，2023，44（19）：182190.doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022100267HAN Hongshuai,SONG Mizhao,LI Jiaxin,et al.Extraction of Collagen and Preparation and Characterization of NanofibersJ.Science and Technology of Food Industry,2023,44(19):182190.(in Chinese with English abstract).doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022100267 工艺技术 胶原蛋白的提取及其纳米纤维的制备与表征胶原蛋白的提取及其纳米纤维的制备与表征韩洪帅1，宋秘钊1,2,*，李家鑫1，姚丹丹1，王彦珍1（1.齐齐哈尔大学轻工与纺织学院，黑龙江齐齐哈尔 161006；2.齐齐哈尔大学寒区麻及制品教育部工程研究中心，黑龙江齐齐哈尔 161006）摘要：为提高羊皮中胶原蛋白的提取率和利用率，采用酸酶复合法提取羊皮胶原蛋白，再利用静电纺技术制备胶原基纳米纤维。以羊皮胶原蛋白提取率为评价指标，考察料液比、乙酸浓度、胃蛋白酶浓度和酶解时间四个因素对羊皮胶原蛋白提取效果的影响，确定单因素最优水平；在此基础上，采用正交试验设计对羊皮胶原蛋白提取的工艺条件进行优化，并通过紫外光谱扫描、红外光谱扫描、SDS-PAGE 图谱和扫描电镜等生化技术探讨酶解过程对胶原蛋白结构性质的影响；然后将胶原蛋白和聚乳酸复合静电纺丝，制备得到胶原基纳米纤维。结果表明，酸酶复合法提取羊皮胶原蛋白最佳工艺为：料液比 1:25 g/mL、乙酸浓度 1.2 mol/L、胃蛋白酶用量 1.0%、酶解时间72 h，在此条件下羊皮胶原蛋白提取率为 38.42%0.49%；紫外光谱扫描显示羊皮胶原蛋白于 230 nm 附近出现最大紫外吸收峰；红外光谱扫描、SDS-PAGE 图谱分析表明羊皮胶原蛋白主要有 1、2、三种亚基成分组成，属于型胶原蛋白，且胶原蛋白的空间结构保留完整；扫描电镜直观表明了羊皮胶原蛋白的纤维网络结构保留较完整；静电纺丝得到的胶原基纳米纤维直径为 418.02183.77 nm，拉伸强度为 3.6160.386 MPa，断裂伸长率为8.69%1.95%，物理性能优良，有做细胞支架的潜力。本研究为提高羊皮和羊皮胶原蛋白的高值化利用提供了一定的理论基础，也为胶原基纳米医用纤维产品开发提供理论支撑。关键词：胶原蛋白，静电纺丝，共混改性，医用材料，支架本文网刊:中图分类号：TS251.9 文献标识码：B 文章编号：10020306（2023）19018209DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2022100267ExtractionofCollagenandPreparationandCharacterizationofNanofibersHANHongshuai1，SONGMizhao1,2,*，LIJiaxin1，YAODandan1，WANGYanzhen1（1.College of Light Industry and Textiles,Qiqihar University,Qiqihar 161006,China；2.Engineering Research Center for Hemp and Product in Cold Region of Ministry of Education,Qiqihar University,Qiqihar 161006,China）Abstract：In order to improve the extraction rate and utilization rate of collagen in sheepskin,sheepskin collagen wasextracted by acid enzyme compounding method,and collagen-based nanofibers were prepared by electrospinningtechnology.Taking the extraction rate of sheepskin collagen as the evaluation index,the effects of four factors,namelymaterial-liquid ratio,acetic acid concentration,pepsin concentration and enzymatic hydrolysis time,on the extraction effectof sheepskin collagen were investigated,and the optimal level of single factors were determined.On this basis,the processconditions of sheepskin collagen extraction were optimized by orthogonal experimental design.The effects of enzymatichydrolysis on the structural properties of collagen were explored by biochemical techniques such as ultraviolet spectrumscanning,infrared spectrum scanning,SDS-PAGE mapping and scanning electron microscopy.Collagen and polylactic acidwere then compounded and electrospun to obtain collagen-based nanofibers.The results showed that the best process forextracting sheepskin collagen by acid enzyme compounding method was as follows:Material-liquid ratio of 1:25 g/mL,收稿日期：20221028 基金项目：黑龙江省教育厅项目（135509129）；齐齐哈尔大学研究生创新科研项目（YJSCX202010）；黑龙江省高教强省产业化引导资金项目（150112222011）；黑龙江省省教育厅基本科研业务费（130212222125）。作者简介：韩洪帅（1996），男，硕士研究生，研究方向：蛋白基复合材料的制备及其性能研究，E-mail：。*通信作者：宋秘钊（1969），男，博士，教授，研究方向：蛋白基复合材料的研究，E-mail：。第 44 卷 第 19 期食品工业科技Vol.44 No.192023 年 10 月Science and Technology of Food IndustryOct.2023 acetic acid concentration of 1.2 mol/L,pepsin dosage of 1.0%,enzymatic hydrolysis time of 72 h.Under these conditions,the extraction rate of sheepskin collagen was 38.42%0.49%.Ultraviolet spectroscopy showed that sheepskin collagen hada maximum UV absorption peak around 230 nm.Infrared spectrum scanning and SDS-PAGE map analysis showed thatsheepskin collagen was mainly composed of 1,2 and three subunit components,which belonged to type I collagen,andthe spatial structure of collagen was intact.Scanning electron microscopy showed that the fiber network structure ofsheepskin collagen was relatively intact.The collagen-based nanofibers obtained by electrospinning had a diameter of418.02183.77 nm,a tensile strength of 3.6160.386 MPa,and an elongation at break of 8.69%1.95%,which hadexcellent physical properties and the potential to be used as a cell scaffold.This study would provide a theoretical basis forimproving the high-value utilization of sheepskin and sheepskin collagen,and also provide theoretical support for thedevelopment of collagen-based nanomedical fiber products.Keywords：collagen；electrospinning；blending modification；medical materials；bracket 胶原蛋白，简称胶原，是一种生物大分子，常见的胶原蛋白类型有型、型、型，其中型胶原蛋白主要存在于动物皮、韧带、眼角膜、骨骼和肌腱中，约占全部胶原蛋白含量的 90%；II 型胶原蛋白主要存在于软骨中；III 型胶原蛋白主要存在内脏中12。我国是畜牧业大国，动物皮产量日益增加，而这些动物皮多用于食品、医疗、皮革、服装等领域，在品质、价值方面仍处于弱势35，毛皮利用率低，在生皮加工中会造成大量的浪费和污染。动物皮是制取动物胶原蛋白的主要载体，目前研究主要是从猪皮、牛皮、鱼皮中水解得到动物胶原蛋白，但以羊皮为研究对象的报告很少。我国羊皮资源丰富，每年生产上亿张羊皮，而羊皮主要成分是角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白，古书记载羊皮蛋白外敷具有治疗跌打肿痛的作用，现代研究表明羊皮胶原蛋白具有透气、保暖、吸湿的特点，对关节炎和风湿病人具有较好的疗效6。胶原蛋白的提取方法较多，有酶法、酸法、盐法、碱法、热水法78，其中盐法用于胶原蛋白的分离纯化；碱法会使胶原蛋白变性成有毒物质；热水法容易导致胶原蛋白变性，常用于明胶的制备。酸法和酶法较为常用，因此本文利用酸酶复合法提取羊皮胶原蛋白。纳米纤维是指纤维直径小于 1 m 的纤维，因其具备尺寸效应和表/界面效应而广泛应用于生物医用、食品包装、吸附过滤、传感等领域9。纳米纤维可通过拉伸、模板合成、自组装、静电纺、相分离等方法制得，静电纺丝法相较于其他方法具有成本低廉、生产设备简单、工艺可控等优点，是近年来发展起来的一种加工技术10。随着科技的发展，静电纺丝用原料也趋向多元化，如天然高聚物（纤维素、蛋白质、多糖等）、合成高聚物（聚乙烯醇、聚己内酯、聚乳酸等），其中胶原蛋白作为动物蛋白的一种，是天然的生物大分子材料，而且具有良好的生物相容性、低免疫原性、可降解性，在止血、药物缓释载体、组织工程支架等方面有广泛应用1112。静电纺胶原蛋白纳米纤维兼具纳米纤维的结构特征和胶原蛋白的化学特征，比表面积大、孔隙率高、生物相容性好、含有大量的活性基团、可模拟细胞外基质13，是理想的生物医用材料。但由于胶原蛋白力学性能较弱，致使其在纺丝和应用中受到限制，因此需要将胶原蛋白改性1415。已知聚乳酸天然可再生、易降解、成纤性好，同时具有良好的抗菌性和力学性1617，本文采用物理共混改性，将胶原蛋白和聚乳酸复合纺丝提高胶原纤维力学性能。相较于化学改性，共混改性无毒无污染，细胞亲和性好。近年来，国内外通过提取动物胶原蛋白，再利用静电纺丝法制备复合材料应用到生物医学领域成为热点。本研究采用酸酶复合法提取羊皮中的胶原蛋白，并进行工艺优化和蛋白表征，然后将胶原蛋白与聚乳酸溶于六氟异丙醇中进行静电纺丝，以期制备出纤维形貌均一、成纤效果好的纳米纤维膜，旨在提供具有一定力学性能和生物活性的医用纳米纤维材料，为进一步的细胞试验和胶原蛋白医用产品开发提供支撑。1材料与方法 1.1材料与仪器干羊皮食品级，齐齐哈尔皮革厂；透析袋（Mw=14000）浙江博时医疗器械有限公司；胃蛋白酶（1200 U/g）、四甲基乙二胺、-巯基乙醇分析纯，上海蓝季科技发展有限公司；氯化钠、异丙醇、丙三醇、三氯乙酸化学纯，天津市光复科技发展有限公司；甲醇、乙醇分析纯，天津市天力化学试剂有限公司；十二烷基磺酸钠、丙烯酰胺、N-N 双丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷电泳级，上海阿拉丁生化科技有限公司；碳酸钠、过硫酸铵、乙酸化学纯，天津市凯通化学试剂有限公司；溴酚蓝、考马斯亮蓝 R-250电泳级，上海创赛科技有限公司；甘氨酸、蛋白 marker电泳级，上海生物生工工程股份有限公司；聚乳酸、六氟异丙醇分析纯，上海麦克林生化科技有限公司。DF-集热式磁力加热搅拌器江苏荣华公司；BS223S 电子天平北京赛多利斯公司；TDL40B 离心机上海安亭公司；PB-10 pH 计北京赛多利斯公司；LGJ-12 冷冻干燥机北京松源华兴公司；Lamda35 紫外分光光度计美国 PE 公司；Spectrum红外光谱仪美国 PE 公司；DYCZ-24DM 电泳仪北京六一公司；FSP-T 高压静电纺丝机天津云帆公司；S-3400 扫描电镜日本日立公司；TH-8100 万能材料试验机济南普创机电有限公司；325-301 测厚第 44 卷 第 19 期韩洪帅，等：胶原蛋白的提取及其纳米纤维的制备与表征 183 计江都市天发试验机械厂；JY-82C 视频接触角测定仪承德鼎盛试验机检测设备有限公司。1.2实验方法 1.2.1 羊皮预处理称取一定质量的干羊皮，浸入浓度为 12%的氯化钠溶液中，4 h 后取出以除去杂质，用蒸馏水冲洗 3 次，滤干后浸入脱脂剂（6%碳酸钠/8%异丙醇混合溶液 1:1）中，24 h 后取出以除去杂蛋白和脂肪18，用蒸馏水重复洗 3 次，自然通风晾干后称重为 W1，待用，试验温度 4。1.2.2 羊皮胶原蛋白的提取已知哺乳类动物胶原蛋白变性温度和胃蛋白酶的最适温度为 3637 19，本文选择 36 作为酶解温度。把预处理过的干羊皮按照料液比 1:25 g/mL 加入蒸馏水，然后加入乙酸至 1.2 mol/L（反应体系中乙酸的浓度）和 1.0%的胃蛋白酶（相对于干羊皮重）溶解羊皮20，在 36 条件下磁力搅拌 72 h，过滤之后离心（离心机转速为3000 r/min，离心时间 30 min，离心温度 4），收集上清液以除去不溶性物质；将上清液装入的透析袋中，密封并放入大烧杯中，加入蒸馏水，磁力搅拌加速透析，在 4 下透析 3 d，每隔 6 h 换一次蒸馏水，最后得到较为透明的乳白色溶液；把胶原蛋白溶液依次装入培养皿中，用保鲜膜包裹并扎眼透气，在冰箱中预冷冻 12 h 后，快速转移到冷冻干燥机中冷冻干燥（预冷冻温度为18，冷冻干燥温度为60），48 h后取出称重为 W2，得到乳白色的海绵状羊皮胶原蛋白2122。胶原蛋白的提取率 R 按如下公式计算：R(%)=W2W1100式中：R 为羊皮胶原蛋白提取率（%）；W1为预处理后干羊皮质量（g）；W2为冷冻干燥后提取的羊皮胶原蛋白质量（g）。1.2.3 单因素实验设计 1.2.3.1 料液比对羊皮胶原蛋白提取率的影响设置乙酸浓度为 1.1 mol/L、胃蛋白酶浓度为 1.0%、提取时间为 72 h，研究不同料液比（1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35 g/mL）对羊皮胶原蛋白制备效果的影响。1.2.3.2 乙酸浓度对羊皮胶原蛋白提取率的影响设置料液比为 1:25 g/mL、胃蛋白酶浓度为 1.0%、提取时间为 72 h，研究不同乙酸浓度（0.5、0.7、0.9、1.1、1.3、1.5 mol/L）对羊皮胶原蛋白制备效果的影响。1.2.3.3 胃蛋白酶浓度对羊皮胶原蛋白提取率的影响设置料液比为 1:25 g/mL、乙酸浓度为 1.1 mol/L、提取时间为 72 h，研究不同胃蛋白酶浓度（0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%）对羊皮胶原蛋白制备效果的影响。1.2.3.4 提取时间对羊皮胶原蛋白提取率的影响设置料液比为 1:25、乙酸浓度为 1.1 mol/L、胃蛋白酶浓度为 1.0%，研究不同提取时间（24、36、48、60、72、84 h）对羊皮胶原蛋白制备效果的影响。1.2.4 正交试验设计基于单因素实验，选择以料液比（A）、乙酸浓度（B）、胃蛋白酶浓度（C）、提取时间（D）作为正交试验因素，以羊皮胶原蛋白提取率为参考指标，设计四因素四水平正交试验进行分析，正交试验设计见表 1。表 1 正交试验因素水平设计Table 1 Factor level design of orthogonal test水平A料液比（g/mL）B乙酸浓度（mol/L）C胃蛋白酶浓度（%）D提取时间（h）11:210.90.86021:231.00.96631:251.11.07241:271.21.178 1.2.5 胶原蛋白的检测与表征 1.2.5.1 UV 检测称取一定量的胶原蛋白，用0.5 mol/L 乙酸溶液溶解，配成浓度为 1 mg/mL 的胶原蛋白溶液；另取同样乙酸溶液作对照。紫外分光光度计扫描测定23，波长范围为 200330 nm。1.2.5.2 FT-IR 检测取适量冻干胶原蛋白，KBr 压片，放入红外光谱仪中检测。扫描范围 4004000 cm1，分辨率 4 cm1，扫描速度 0.2 cm/s。1.2.5.3 SDS-PAGE 检测利用 SDS-PAGE 分析蛋白样品，采用 5%浓缩胶和 12%的分离胶体系进行电泳分离，用 0.5 mol/L 乙酸配置样品质量浓度为1 mg/mL 胶原蛋白溶液，上样量 12 L。采用直流恒压电源进行电泳（浓缩胶电压 80 V，分离胶电压120 V）。电泳分离后，用马斯亮蓝 R-250 染色胶体 4 h，并用甲醇-乙酸脱色液脱色 23 次至背景颜色为无色，最后便可以分析分离条带的分子量24。1.2.5.4 SEM 检测取冷冻干燥后的胶原蛋白样品固定于载物片上，真空喷金，置于扫描电镜观察胶原蛋白样品的表面形态结构，电压 20 kV，放大 200 倍。1.2.6 静电纺胶原蛋白/聚乳酸纳米纤维静电纺丝装置主要由高压电源、注射器、不锈钢针头和接收屏组成。将一定量的羊皮胶原蛋白和聚乳酸溶于六氟异丙醇中，然后将混合溶液磁力搅拌 3 h，搅拌温度为 20，转速为 300 r/min，得到所需纺丝溶液。将纺丝液置于微注射泵上的 10 mL 注射器中，电纺获得胶原基纳米纤维膜2526。静电纺丝工艺参照王彦珍等27做的电纺试验，本试验设置为胶原与聚乳酸质量比为 2:8、溶质质量分数为 10%、纺丝电压为15 kV、纺丝速度为 1 mL/h、纺丝距离为 15 cm，纺丝针头为 21 G。1.2.7 胶原蛋白/聚乳酸纳米纤维膜的检测与表征 1.2.7.1 SEM 检测从铝箔纸上取下小块纳米纤维膜固定于载物片上，真空喷金，置于扫描电镜观察胶原蛋白样品的表面形态结构，电压 20 kV，放大 2000 184 食品工业科技2023 年 10 月倍。然后使用 Image Pro Plus 6.0 直径分析软件测量纳米纤维的直径，从而得到纤维直径分布图。1.2.7.2 机械性能检测取长 85 mm、宽 15 mm 的纳米纤维膜样品，用测厚计测量其厚度，测量十次，取平均值，然后利用万能材料试验机测量其力学性能28。1.2.7.3 接触角检测取长 40 mm、宽 20 mm 的纳米纤维膜，用接触角测定仪测量其接触角，观察其疏水性29。1.3数据处理所有试验均重复进行三次，结果表示为平均值标准偏差的形式。采用 Excel 2010、SPSS 27 和Minitab 19 软件对数据进行试验设计和统计分析，用 Image Pro Plus 6.0 软件测量直径，用 Origin 2018软件进行绘图。2结果与分析 2.1单因素实验结果 2.1.1 料液比的选择由图 1 结果可知，料液比从1:10 至 1:25 g/mL，羊皮胶原蛋白提取率呈现上升趋势。当料液比为 1:25 g/mL 时，胶原蛋白提取率为 38.4%。料液比从 1:25 至 1:35 g/mL，胶原蛋白提取效果反而下降。这表明当添加蒸馏水过少时，酶分子不能与底物充分接触，导致蛋白酶活性无法发挥，造成胶原蛋白提取不完全。而过多添加蒸馏水使酶分子扩散范围变大，降低蛋白酶与底物接触效率会影响胶原蛋白提取率30。因此综合效益与成本，料液比定为 1:25 g/mL 最为适宜。4038dcababba363432302826242220料液比(g/mL)提取率(%)1:101:151:201:251:301:35图 1 料液比对羊皮胶原蛋白提取率的影响Fig.1 Effect of material liquid ratio on the extraction rate ofsheepskin collagen注：不同小写字母表示差异显著（P提取时间（D）乙酸浓度（B）料液比（A），其中胃蛋白酶浓度和提取时间对羊皮胶原蛋白提取率影响显著（P0.05）。得到酸酶复合法提取羊皮胶原蛋白的最佳工艺条件为 A3B4C3D3，即料液比 1:25 g/mL、乙酸浓度 1.2 mol/L、胃蛋白酶浓度 1.0%、提取时间72 h，与单因素实验结果相近。然后在最优水平条件下进行三次平行试验，得到的羊皮胶原蛋白提取率为 38.42%0.49%。2.3羊皮胶原蛋白的测试与分析 2.3.1 UV 测试分析图 5 为胶原蛋白紫外吸收光谱图，由图可知最大吸收峰在 238 nm 附近。胶原蛋白大分子链结构中含有C=O，COOH，NH2等显色基团，这些基团的 n*跃迁在 230 nm 处形成吸收峰23,33。观察 280 nm 附近，三者并没有明显的吸收峰，说明芳香族氨基酸的含量较少，提取的胶原蛋白纯度高。总的来说，在 238 nm 附近有一个最大吸收峰，符合胶原蛋白的特性。3.02382.52.01.51.00.50.0220240260280波长(nm)吸光度300320图 5 羊皮胶原蛋白的紫外光谱Fig.5 Ultraviolet spectrum of sheepskin collagen 2.3.2 FT-IR 测试分析图 6 为胶原蛋白傅里叶变换红外谱图。在 3300.01 cm1处，胶原蛋白中存在一个特征吸收峰，为酰胺 A 带，这是因为氨基中的N-H 伸缩振动和羧基中的 O-H 伸缩振动，是胶原蛋白的特征峰34；在 2924.18 cm1处，胶原蛋白中存在一个特征吸收峰，为酰胺 B 带，这是因为 C-H 伸缩振动；在 1638.11 cm1处，胶原中存在一个特征吸收峰，为酰胺带，这是因为 C=O 的伸缩振动35，与胶原蛋白的二级结构有关，由此表明胶原蛋白的结构没有被破坏；在 1543.63 cm1处，胶原蛋白中有一个特征吸收峰，为酰胺带，这是由于胶原蛋白结构中的N-H 弯曲振动和 C-H 弯曲振动；在 1237.99 cm1处，1003300.012924.181638.111543.631451.901237.9980604020400030002000波数(cm1)透过率(%)1000图 6 羊皮胶原蛋白的红外光谱Fig.6 Infrared spectroscopy of sheepskin collagen 186 食品工业科技2023 年 10 月胶原蛋白中有一个特征吸收峰，为酰胺带，这是因为 C-N 伸缩振动36，在 1451.901237.99 cm1附近的吸收峰表明提取胶原的三螺旋结构是完整的。总的来说，红外谱图证明了本试验提取的胶原蛋白为I 型胶原蛋白。2.3.3 SDS-PAGE 测试分析图 7 是用酸酶复合法提取的羊皮胶原蛋白 SDS-PAGE 谱图，进行三组重复试验。由图 7 可知，所提取的胶原蛋白具有、链，其中在分子质量为 110 kDa 附近有两条链，分别是 1和 2链24；在分子质量为 200 kDa 附近，存在一条比较宽的 链，是两条 链的二聚体；图中2链以下没有明显的电泳带，说明提取的胶原蛋白几乎没有降解为小分子多肽。结合紫外和红外分析表明，利用该工艺提取的胶原蛋白结构完整，所得到的胶原蛋白符合型胶原蛋白的特征。200 kDa180 kDa110 kDa95 kDa72 kDa56 kDa43 kDaMarkerCol1Col2Col3链1链2链图 7 羊皮胶原蛋白的 SDS-PAGEFig.7 SDS-PAGE of sheepskin collagen 2.3.4 SEM 测试分析冻干的羊皮胶原蛋白外貌呈乳白色，类似絮状海绵，触感细腻柔软，富有弹性。图 8 为提取的胶原蛋白微观结构图，从图 8 中可以看出羊皮胶原蛋白表面具有明显的纤维网状结构，层次分明，具有孔隙，同时网状纤维间距均匀，说明胶原蛋白是由网状结构的胶原纤维组成，结构稳定，分布均匀。2.4胶原蛋白/聚乳酸纳米纤维的测试与分析 2.4.1 SEM 测试分析使用 Image Pro Plus 6.0 直径分析软件，随机选取 100 根单纤维测量其直径37，然后绘制胶原蛋白纳米纤维直径分布图，如图 9 所示。纤维直径大多分布在 300500 nm 之间，直径分布较均匀，计算得到纤维平均直径为 418.02183.77 nm。已知动物细胞的平均直径为 3000 nm，胶原基纳米纤维直径比细胞小数倍，具有作为细胞支架的潜力。目前利用胶原蛋白与其他材料混合进行静电纺丝获得的胶原膜纤维直径大小不一，吴国良等38在胶原蛋白中加入聚已内酯进行静电纺丝，制备成纳米纤维膜的纤维平均直径为 750390 nm；王佳冕39将林蛙皮胶原蛋白和聚乳酸复合，静电纺得到的纤维膜平均直径为 59398 nm；肖世维等40将不同浓度的胶原蛋白和聚乙烯醇共混，制备纺丝溶液，得到的纤维直径约为 300 nm；本试验得到的胶原基纳米纤维直径分布较为均匀，纤维直径也较小。25201510500200400600纤维直径(nm)频率分布(%)800100020 m图 9 纳米纤维膜 SEM 和纤维直径分布Fig.9 SEM of nanofiber membrane and fiber diameterdistribution 2.4.2 机械性能测试分析测量纳米纤维膜的拉伸强度和断裂伸长率，试验得出，在一定范围内，膜的拉伸强度和断裂伸长率随着膜厚度的增加而增加。如表 4 所示，当膜的厚度为 0.1210.008 mm 时，其拉伸强度和断裂伸长率分别为 3.6160.386 MPa 和8.69%1.95%。陈腊梅等41利用胶原蛋白和聚己内 200 m图 8 羊皮胶原蛋白的 SEMFig.8 SEM of sheepskin collagen 第 44 卷 第 19 期韩洪帅，等：胶原蛋白的提取及其纳米纤维的制备与表征 187 酯，静电纺丝得到复合纳米纤维膜，纤维膜拉伸强度为 1.270.18 MPa；陈卫英等42测量厚度为 0.11 mm的胶原基纳米纤维膜的拉伸强度为 6.190.82 MPa；本试验得到的胶原基纳米纤维膜相较于上述两种力学性能良好，分析其原因主要是因为胶原纤维直径分布均匀，层次分明，交错排列形成网状结构43。2.4.3 接触角测试分析接触角大于 90，材料疏水；接触角小于 90，材料亲水。已知聚乳酸疏水44，而胶原蛋白亲水，通过水滴接触角测试仪器在复合纳米纤维膜的表面滴加一滴水滴，两秒之后纪录其形态和接触角。如图 10 所示，接触角平均值为 119.681.63，表明胶原蛋白复合聚乳酸纳米纤维膜是疏水的，但由于胶原蛋白和纳米孔隙的双重作用，随着时间推移纤维膜开始吸水，后期水滴会被完全吸收，表明纤维膜能够模拟细胞外基质43，可以作为细胞依附增殖的支架材料。Angel:118.07Angel:119.05Angel:121.92图 10 纳米纤维膜水滴接触角Fig.10 Nanofiber membrane water droplet contact angle 3结论以羊皮边角料为原料，采用酸酶复合法提取羊皮胶原蛋白。通过单因素实验和正交试验优化羊皮胶原蛋白提取工艺，得到最佳提取工艺条件：料液比为 1:25 g/mL、乙酸浓度为 1.2 mol/L、胃蛋白酶浓度为 1.0%、提取时间为 72 h，得到的羊皮胶原蛋白提取率为 38.42%0.49%。经过紫外谱图、红外谱图、SDS-PAGE、SEM 表征分析表明提取的胶原蛋白为型胶原蛋白，结构较为完整。总的来说实现了羊皮和羊皮胶原蛋白的重复利用，提取工艺和提取率较好。将制备的羊皮胶原蛋白和聚乳酸溶于六氟异丙醇溶剂中制备纺丝液，静电纺丝得到纳米纤维膜的平均纤维直径为 418.02183.77 nm，而且具有良好的力学性能，纳米纤维膜虽然前期表现疏水性但后期变得亲水，有作为生物医用材料和细胞支架的潜力。静电纺胶原蛋白复合聚乳酸纳米纤维结合了两者的优点，亦具有纳米纤维的优良特性，研究为进一步的细胞学试验提供了试验材料，也将为胶原蛋白基纳米医用纤维产品开发提供支撑。但是胶原基纳米纤维大多处于实验室阶段，本文也缺乏抗菌试验与细胞毒性试验，后期需要继续深入研究。参考文献 1 周丹,沈艳琴,武海良,等.胶原蛋白的应用研究现状J.合成纤维，2022，51（8）：58.ZHOU D,SHEN Y Q,WU H 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