胶质母细胞瘤FGFR3-TACC3融合基因介导丙酮酸激酶M2入核促进DNA损伤修复基础研究.pdf

基础研究745Chin J Contemp Neurol Neurosurg,August 2023,Vol.23,No.8中国现代神经疾病杂志2 0 2 3年8 月第2 3卷第8 期胶质母细胞瘤FGFR3-TACC3融合基因介导丙酮酸激酶M2人核促进DNA损伤修复基础研究任修德李涛范吉康王希森贾晓丹杨学军【摘要】目的探讨胶质母细胞瘤FCFR3-TACC3（F3-T 3融合基因介导丙酮酸激酶M2(PKM2）人核激活DNA损伤修复致替莫唑胺（TMZ)耐药的作用机制。方法慢病毒转染构建稳定表达F3-T3融合基因和空载体的胶质母细胞瘤细胞系U87MG和U251MG,构建稳定表达F3-T3融合基因的胶质母细胞瘤裸鼠模型，小动物活体成像系统观察荷瘤鼠肿瘤荧光信号强度；采用生物信息学分析基因芯片转录组数据分析F3-T3融合基因的生物学功能,并分析肿瘤基因组学图谱计划(TCGA)数据库中胶质瘤患者生存期与PKM2基因表达的关系；瞬时转染小干扰RNA（s i RNA）敲低PKM2基因表达；CCK-8细胞增殖实验观察经梯度浓度替莫唑胺处理后、转染siRNA后、替莫唑胺联合PKM2抑制剂Compound3k处理后U87MG和U251MG细胞增殖活性；提取核质蛋白并观察经替莫唑胺处理后总蛋白提取物、胞质提取物和胞核提取物PKM2蛋白表达情况；Westernblotting法检测稳定表达F3-T3融合基因的U87MC和U251MG细胞PKM2蛋白相对表达量、磷酸化组蛋白H2AX（p-H 2 A X）相对表达量、siRNA敲低PKM2基因p-H2AX相对表达量。结果（1)CCK-8细胞增殖实验显示，经替莫唑胺6 40、32 0、16 0、8 0、40 mol/L处理后F3-T3转染组的U87MG细胞存活率均高于空载体转染组（P=0.000,0.000,0.000,0.004,0.010），经替莫唑胺6 40、32 0、16 0、8 0、40、2 0、5mol/L处理后F3-T3转染组的U251MG细胞存活率亦均高于空载体转染组（P=0.000,0.000,0.000,0.0000.002,0.001,0.002）；然而，经替莫唑胺6 40、32 0、16 0、8 0、40、2 0、10、5和2.50 mol/L处理后si-PKM2-1009转染组的U87MC细胞存活率均低于F3-T3转染组（P=0.000，0.000,0.000,0.012,0.006,0.030,0.000,0.0070.025），经替莫唑胺6 40、32 0、16 0、8 0、40、2 0、5mol/L处理后si-PKM2-1377转染组U251MG细胞存活率亦低于F3-T3转染组（P=0.000,0.000,0.002,0.000,0.002，0.0480.042）；经替莫唑胺6 40、32 0、16 0、8 0、40、2 0 mol/L处理后TMZ+Compound3k组U87MG细胞存活率低于TMZ组（P=0.000,0.000,0.000,0.000,0.001,0.002），经高浓度（6 40、32 0、16 0、8 0、40 mol/L）替莫唑胺处理后TMZ+Compound3k组U251MG细胞存活率亦低于TMZ组（P=0.000,0.000,0.000,0.000，0.003），而经低浓度（10、5、2.50 mol/L）替莫唑胺处理后TMZ+Compound3k组U251MG细胞存活率高于TMZ组（P=0.000,0.000,0.006）。（2)胶质母细胞瘤动物模型显示，荷瘤鼠存在替莫唑胺耐药。（3)生物信息学分析,F3-T3融合蛋白的生物学功能显著富集于DNA修复通路（P=0.000）。T CG A 数据库中胶质瘤患者PKM2基因高表达组生存率和总生存期均低于低表达组（P0.05）。（4)W e s t e r n b l o t t i n g 法显示，经替莫唑胺处理48 h再更换培养基后2 4、36 和48 h，F3-T 3转染组U87MG（P=0.0 0 0,0.0 0 0,0.0 0 4)和U251MG(P=0.000,0.007,0.005）细胞p-H2AX蛋白相对表达量均低于空载体转染组；经替莫唑胺处理后F3-T3转染组U87MG和U251MG细胞均可见明显的PKM2人核，而空载体转染组细胞均未见这一现象；：s i-PK M 2-10 0 9和si-PKM2-1377分别敲低U87MG(P=0.000,0.0010.006)和U251MG（P=0.0 0 0,0.0 0 00.000)细胞PKM2基因表达的效果最显著。结论F3-T3融合基因可促进PKM2入核，激活DNA损伤修复相关通路，进而介导胶质母细胞瘤对替莫唑胺耐药，不同细胞株对替莫唑胺的耐药浓度不一致，PKM2抑制剂可逆转这种耐药。【关键词】胶质母细胞瘤；受体，成纤维细胞生长因子，3型；基因融合；丙酮酸激酶；DNAdoi:10.3969/j.issn.1672-6731.2023.08.015基金项目：国家自然科学基金青年科学基金资助项目（项目编号：8 2 10 2 951）作者单位：30 0 0 52 天津医科大学总医院神经外科（任修德，李涛，范吉康，王希森，贾晓丹）；10 2 2 18 北京清华长庚医院神经外科（杨学军）通讯作者：杨学军，Email：y x ja 0 37 2 8 b t c h.e d u.c n746Chin J Contemp Neurol Neurosurg,August 2023,Vol.23,No.8中国现代神经疾病杂志2 0 2 3年8 月第2 3卷第8 期修复；春替莫唑胺；抗药性，肿瘤；细胞增殖；免疫印迹法；肿瘤细胞,培养的；疾病模型,动物The study of FGFR3-TACC3 fusion gene mediating pyruvate kinase M2 nucleartranslocation to promote DNA damage repair in glioblastomaREN Xiu-de,LI Tao,FAN Ji-kang,WANG Xi-sen,JIA Xiao-dan,YANG Xue-jun?Department of Neurosurgery,Tianjin Medical University General Hospital,Tianjin 300052,ChinaDepartment of Neurosurgery,Bejing Tsinghua Changgung Hospital,Bejing 102218,ChinaCorresYANGXue-lunE)Abstract)Objective To explore the mechanism of FGFR3-TACC3(F3-T3)fusion gene mediatingDNA damage repair through promoting pyruvate kinase M2(PKM2)s nuclear translocation in glioblastoma.Methods The lentiviral transfection technology was used to constructed stable transitional cell linesU87MG cells and U251MG cells that stably expressing F3-T3 and empty vector.In vivo glioblastomamodel was constructed by intracranial in situ tumor implantation in athymic mice,and the tumorigenicability of F3-T3 transfected cells in athymic mice of each treatment group was observed by small-animal invivo imaging system.Bioinformatics analysis was performed to analyze gene microarray data exploring thepossible biological functions of F3-T3 mediating chemoresistance and identify the relationship betweensurvival expectations and PKM2 expression levels in glioblastoma patients from The Cancer Genome Atlas(TCGA)database.Transient transfection of small interference RNA(siRNA)was used to knock down theexpression of PKM2 in the F3-T3 transfected cells.Proliferative activity of U87MG and U251MG cellstreated with different concentrations of temozolomide(TMZ),transfected with siRNA,and TMZ incombination with Compound 3k,a PKM2 inhibitor,was observed in CCK-8 cell proliferation assays.Nuclear and cytoplasmic proteins were extracted separately and PKM2 protein expression was observed inwhole cell extract,cytoplasmic extract and cytosolic extract after TMZ treatment.Relative expression ofPKM2,relative expression of cytosolic phosphorylated histone H2AX(p-H2AX)and relative expression ofsiRNA knockdown PKM2 gene in U87MG and U251MG cells stably expressing the F3-T3 fusion gene,detected by Western blotting.Results 1)CCK-8 cell proliferation assay showed that the survival rate ofU87MG cells in the F3-T3 transfected group was higher than that in the empty vector transfected groupafter treatment with TMZ 640,320,160,80,40 mol/L(P=0.000,0.000,0.000,0.000,0.004,0.010),andthe survival rate of U251MG cells in the F3-T3 transfected group was also higher than that in the emptyvector transfected group after TMZ 640,320,160,80,40,20,5 mol/L(P=0.000,0.000,0.000,0.002,0.001,0.002);the survial rate of U87MG cells in the si-PKM2-1009 transfected group was lower than thatof F3-T3 transfected group after TMZ 640,320,160,80,40,20,10,5,2.50 mol/L,the survival rate ofU251MG cells in the si-PKM2-1377 transfected group was also lower than that in F3-T3 transfected groupafter TMZ 640,320,160,80,40,20,5 mol/L(P=0.000,0.000,0.002,0.000,0.002,0.048,0.042);andthe survival rate of U87MG cells in TMZ+Compound 3k group was lower than TMZ group after TMZ 640,320,160,80,40,20 mol/L(P=0.000,0.000,0.000,0.000,0.001,0.002),and the survival rate ofU251MG cells in TMZ+Compound 3k group after treatment with high concentrations of TMZ(640,320,160,80 and 40 mol/L)was also lower than TMZ group(P=0.000,0.000,0.000,0.000,0.003),while thesurvival rate of U251MG cells in TMZ+Compound 3k group after treatment with low concentrations of TMZ(10,5 and 2.50 mol/L)was higher than that of TMZ group(P=0.000,0.000,0.006).2)An animal modelof glioblastoma showed the presence of TMZ resistance in homozygous mice.3)Bioinformatic analysisshowed that the biological function of F3-T3 was significantly enriched in the DNA repair pathway(P=0.000).Survival and overall survival of glioblastoma patients in the TCGA database were lower in thePKM2 high expression group than in the low expression group(P 0.05).4)Western blotting showed thatthe relative expression of p-H2AX in U87MG(P=0.000,0.000,0.004)and U251MG(P=0.000,0.007,0.005)cells in the F3-T3 transfected group were lower than those in the empty vector transfected groupafter TMZ treatment for 48 h and then medium change for 24,36 and 48 h.PKM2 protein incorporationinto the nucleus was observed in both U87MG and U251MG cells in the F3-T3 transfected group after TMZtreatment,whereas it was not observed in cells in the empty vector transfected group;si-PKM2-1009 and si-PKM2-1377 knocked down the relative expression of p-H2AX in U87MG(P=0.000,0.001,0.006)andU251MG(P=0.000,0.000,0.000)cells,respectively.Conclusions In the presence of TMZ,F3-T3promotes PKM2s nuclear translocation and activates DNA damage repair pathways,which in the eventuallyresults resistance of glioblastoma cell to TMZ.PKM2 inhibitors can compromise the resistance glioblastomacells stably expressing F3-T3 fusion gene to TMZ.Key wordsGlioblastoma;Receptor,fibroblast growth factor,type 3;Gene fusion;Pyruvatekinase;DNA repair;Temozolomide;Drug resistance,neoplasm;Cell proliferation;Immunoblotting;747Chin J Contemp Neurol Neurosurg,August 2023,Vol.23,No.8中国现代神经疾病杂志2 0 2 3年8 月第2 3卷第8 期Tumor cells,cultured;Disease models,animalThis study was supported by the National Natural Science Foundation of China for Young Scientists(No.82102951).Conflicts of interest:none declared脑胶质瘤是临床最常见的中枢神经系统肿瘤，其中胶质母细胞瘤恶性程度最高，预后极差，中位生存期仅14 17 个月。胶质母细胞瘤存在广泛的基因组学改变,其中基因融合是常见的染色体畸变，由染色体重排引发，导致致癌融合基因的产生。FGFR3-TACC3（F3-T 3)融合基因由定位于染色体4p16的FGFR3基因150 10 bp长度范围内罕见染色体重排所形成，最早在胶质母细胞瘤中被检出2 。F3-T3融合蛋白由大部分纤维母细胞生长因子受体3(FCFR3)结构域和小部分转录相关酸性卷曲蛋白3（T A CC3）结构域组成，既保留野生型FGFR3蛋白的重要磷酸化位点3，又具有组成性激活（c o n s t i t u t i v e a c t i v a t i o n）特点【4)。替莫唑胺（TMZ）是胶质瘤治疗的一线烷化剂，但是由于肿瘤的异质性进展，其治疗抵抗和治疗后复发仍是呕待解决的问题。一方面,F3-T3融合基因阳性的胶质瘤患者经替莫唑胺治疗后易复发，且复发肿瘤仍携带F3-T3融合基因5-6 ;另一方面，胶质瘤FGFR3基因表达变化显著影响烷化剂治疗敏感性【3。本研究拟体外构建胶质母细胞瘤模型，探究F3-T3融合蛋白和F3-T3融合基因引发胶质母细胞瘤替莫唑胺耐药的作用机制以及对抗或逆转这种耐药性的方案，以为携带F3-T3融合基因的胶质母细胞瘤患者提供更精准的治疗方案材料与方法一、实验材料1.细胞系来源人胶质瘤细胞系U87MG和U251MG均购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。以含体积分数为10%胎牛血清(FBS)的DMEM高糖培养基置于37、含5%二氧化碳（CO，）的恒温培养箱培养，每2 3天进行传代培养2.动物来源无特定病原体（SPF）级BALB/c裸鼠共10 只，雄性和雌性各5只，6 12 周龄，体重为1721g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。实验动物于环境温度2 4 2 7、12 h昼-12 h夜循环照明环境中饲养，自由摄食、饮水。本实验经天津医科大学总医院实验动物福利伦理委员会审查通过（审批号：IRB2021-DWFL-076)。3.试剂与仪器（1)药品与试剂：胎牛血清和DMEM高糖培养基均购自美国Gibco公司；荧光素酶底物（规格：10 0 mg）购自美国GoldBio公司；替莫唑胺（规格：2 5mg)购自美国Cayman公司；二甲基亚矾（DMSO）、磷酸盐缓冲液（PBS)干粉（规格：2 L）、BCA蛋白定量检测试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司；核质蛋白提取试剂盒（含胞质提取剂I、和胞核提取剂）购自英国Abcam公司；冻干粉形式的小干扰RNA（s i RNA，规格：40 g)购自上海和元生物技术股份有限公司；CCK-8检测试剂盒购自上海东仁化学科技有限公司；丙酮酸激酶M2（PK M 2）抑制剂Compound3k（规格：2 5mg）购自美国SelleckChemicals公司；I抗工作液包括鼠源性抗磷酸化组蛋白H2AX（p-H 2 A X）单克隆抗体（1：1000)购自美国Millipore公司，兔源性抗PKM2单克隆抗体（1：10 0 0）、兔源性抗LAMINA/C多克隆抗体（1：10 0 0）为美国Cell SignalingTechnology公司产品，鼠源性抗人-肌动蛋白（-actin）单克隆抗体（1：30 0 0）、鼠源性抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)单克隆抗体（1：10 0 0)以及抗工作液包括辣根过氧化物酶（HRP)标记的山羊抗鼠IgG抗（1：30 0 0)和山羊抗兔IgG抗（1：30 0 0），均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。（2)设备与仪器：含5%CO,的37 恒温培养箱和低温高速离心机购自德国Heraeus公司，IX73倒置相差荧光显微镜（600）购自日本Olympus株式会社，IVISSpectrum小动物活体成像系统（精密度：2 0 m）购自美国Xenogen公司，Synergy2多功能酶标仪（精密度：0.001OD）购自美国BioTek公司，PowerPacHC电泳仪（电流1mA、电压1V、功率1W）为美国Bio-Rad公司产品，G：BO XCh e m i XT 4化学发光/荧光/凝胶成像系统（分辨率：42 0 万像素）为英国Syngene公司产品。二、实验方法1.慢病毒转染与细胞分组F3-T3质粒载体构748Chin J Contemp Neurol Neurosurg,August 2023,Vol.23,No.8中国现代神经疾病杂志2 0 2 3年8 月第2 3卷第8 期建和慢病毒包装由上海吉凯基因医学科技股份有限公司完成，载体携带嘌岭呤霉素抗性基因、不携带GFP基因。将生长良好、处于对数生长期的细胞实验用U87MG和U251MG细胞分别接种于2 个6 孔板，每孔细胞数10 0 10 3个，分为F3-T3转染组、空载体转染组和空白对照组（每种细胞各2 孔）；恒温培养箱培养2 4h后更换新鲜的DMEM完全培养基（2 m l/孔），向转染组（F3-T3转染组和空载体转染组)加入配制好的含慢病毒和感染增强液的转染复合物，空白对照组不转染病毒；恒温培养箱培养2 4h后再更换培养基，继续培养2 4h，各组同时加人嘌呤霉素2 g/ml,倒置相差荧光显微镜观察细胞存活情况，空白对照组细胞完全死亡且转染组细胞未见明显死亡提示转染成功，再将转染组细胞进一步扩大培养。动物实验用稳定表达F3-T3融合基因的U251MG细胞另转染荧光素酶慢病毒,F3-T3质粒载体构建、慢病毒包装和转染流程同上述方法，无需设置转染组，转染后无需嘌呤霉素筛选细胞，小动物活体成像系统观察到细胞发出荧光信号提示转染成功，再进一步扩大培养。2.胶质母细胞瘤动物模型制备与分组取处于对数生长期、转染荧光素酶慢病毒、稳定表达F3-T3融合基因的U251MG细胞，制备含细胞（细胞数为0.5010个/5l)的磷酸盐缓冲液。腹腔注射5%水合氯醛（0.10 ml/10g）麻醉裸鼠，切开头皮，于前卤前1mm、中线右2 mm处钻孔，注射制备的含U251MG细胞的磷酸盐缓冲液5l,缝合头皮。细胞接种后第7 和14天，于腹腔注射荧光素酶底物（50 l/10g）麻醉小鼠，以小动物活体成像系统观察荷瘤鼠颅内肿瘤生长情况，肿瘤发生荧光信号为模型制备成功。10 只裸鼠均建模成功，随机分为替莫唑胺组和对照组，替莫唑胺组将药物溶解于二甲基亚砜溶液，磷酸盐缓冲液稀释（稀释比1：10 0），于注射第15 19和2 2 2 6 天灌胃给药5mg/（k g d），对照组予以与替莫唑胺相同体积的二甲基亚矾溶液，均于细胞接种后第2 1、2 8、35和42 天采用小动物活体成像系统观察荷瘤鼠肿瘤荧光信号强度。3.生物信息学分析差异基因分析和基因富集分析（GSEA）所用E-MTAB-6037基因芯片数据从ArrayExpress数据库（https:/www.ebi.ac.uk/biostudies/arrayexpress）中下载，该基因芯片数据共包括4组转录组数据，即F3-T3组（稳定表达F3-T3融合基因的人星形胶质细胞）、F3-T3PD173074组（以FGFR抑制剂PD173074处理稳定表达F3-T3融合基因的人星形胶质细胞）、F3-T3KD组（稳定表达F3-T3融合基因的激酶失活形式人星形胶质细胞）和空载体组（稳定表达空载体的人星形胶质细胞）。采用R语言软件包DESeq2分析F3-T3组与空载体组的差异基因，软件包org.Hs.eg.db、c l u s t e r Pr o f i l e r、GSEABase和msigdbr对差异基因行通路富集分析，软件包ggplot2将分析结果可视化。肿瘤基因组学图谱计划（TCGA）数据从其官网（https:/www.cancergenome.nih.gov/）下载，包含6 39例胶质瘤患者的临床信息及其中17 3例患者的基因转录组测序数据，采用R语言软件包survival和survminer分析胶质瘤患者预后与PKM2基因表达变化的相关性，软件包ggplot2和ggpubr将分析结果可视化。4.核质蛋白分离提取文将F3-T3转染组和空载体转染组细胞（U87MG和U251MG)接种于培养皿（规格：10 0 mm），加人替莫唑胺10 0 mol/L,48h后提取核质蛋白。重悬细胞，细胞悬液收集至1.50 mlEP管中，离心半径为13.50 cm、转速8 0 0 r/min离心5min，弃上清液，加入2 0 0 l冰冷胞质提取剂I，冰浴10 min后，再加人11l冰冷胞质提取剂，冰浴1min后，于4预冷下离心半径为13.50 cm、转速12000r/min离心5min，取上清液，即为胞质提取物；再向沉淀中加入10 0 l冰冷胞核提取剂，冰浴40min，于4预冷下离心10 min，取上清液，即为胞核提取物。胞质和胞核提取物用于Westernblotting检测。5.瞬时转染小干扰RNA敲低PKM2基因表达敲低PKM2基因的siRNA冻干粉以超净水配制成10mol/L溶液，上海和元生物技术股份有限公司合成siRNA序列，无义对照序列（si-PKM2-control组）：5-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3,PKM2干扰序列分别为si-PKM2-819转染组：5-GCAAGAUCUACGUGGAUGAUGTT-3、siPKM21009转染组：5GGAUGUUGAUAUGGUGUUUGCTT-3、s i-PK M 2 -1377转染组:5-GCAUGAUGCUGUCUGGAGAAATT-3。一EP管加人10 lsiRNA和2 50 l高糖DMEM培养基，另一EP管加人5lLipofectamine2000和250l高糖DMEM培养基，两管混匀后于室温静置25min，配制转染复合物；将稳定表达F3-T3融合基因的U87MG和U251MG细胞以密度50 10 3个/ml接种于6 孔板，恒温培养箱培养48 h，加人转染复合749Chin J ContempNeurol NeurosurgAugust2023,Vol.23,No.8中国现代神经疾病杂志2 0 2 3年8 月第2 3卷第8 期物，转染7 2 96 h，提取各siRNA转染组总蛋白，用于Western blotting检测。6.CCK-8法检测肿瘤细胞增殖活性将U87MG和U251MG细胞接种于96 孔板，每孔细胞数1500个，分为替莫唑胺孔、对照孔和空白对照孔，替莫唑胺孔依次加人梯度浓度（6 40、32 0、16 0、8 0、40、20、10、5和2.50 mol/L）替莫唑胺（每个浓度5个复孔），对照孔接种细胞但不加入替莫唑胺（5个复孔），空白对照孔不接种细胞（3个复孔）。96 孔板恒温培养箱培养7 2 h，吸掉各孔培养基，每孔加人含100l完全培养基和10 lCCK-8溶液的检测体系混合物，恒温培养箱培养30 min、1h、1.50 h 和2 h后，以酶标仪于450 nm处测定光密度（OD）值，并计算细胞存活率，公式为细胞存活率（%）=（替莫唑胺孔OD4s0mm-空白对照孔OD450m）/（对照孔OD4s0mm-空白对照孔0 D450mm）10 0%。采用CCK-8法分别检测稳定表达F3-T3融合基因和空载体（F3-T3转染组和空载体转染组）、稳定表达F3-T3融合基因和转染siRNA的稳定表达F3-T3融合基因（F3-T3转染组和siRNA转染组）、替莫唑胺和替莫唑胺联合PKM2抑制剂Compound3k（1mol/L）处理后（TMZ组和TMZ+Compound3k组）U87MG和U251MG细胞增殖活性。再采用GraphPadPrism8软件绘制U87MG和U251MG细胞增殖活性与替莫唑胺浓度的标准曲线，并计算替莫唑胺半数抑制浓度（ICso）。7.Westernblotting法检测目的蛋白表达量(1)PKM2蛋白的核质定位：将F3-T3转染组和空载体转染组细胞（U87MG和U251MG）各接种于2 个培养皿（规格：10 0 mm），加人替莫唑胺10 0 mol/L，48h后一皿提取核质蛋白、另一血提取总蛋白,BCA法检测总蛋白提取物、胞质提取物、胞核提取物蛋白含量；并行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SD S-PA G E），聚偏二氟乙烯（PVDF)转膜，以质量分数为5%胎牛血清白蛋白V的封闭液封闭2 h，加I抗工作液包括兔源性抗PKM2单克隆抗体、兔源性抗LAMINA/C多克隆抗体和鼠源性抗GAPDH单克隆抗体（均1：10 0 0），再加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgGI抗和山羊抗兔IgG抗（均1：3000），凝胶成像系统采集目的条带，以GAPDH作为胞质提取物的内参照物、LAMINA/C作为胞核提取物的内参照物，观察总蛋白提取物、胞质提取物和胞核提取物PKM2蛋白表达情况。（2)转染siRNA后PKM2蛋白相对表达量：瞬时转染siRNA敲低PKM2基因表达后，行SDS-PAGE、转膜、封闭，加入I抗工作液包括兔源性抗PKM2单克隆抗体（1：1000）和鼠源性抗人-actin单克隆抗体（1：30 0 0），再加人辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG抗和山羊抗兔IgG抗（均1：30 0 0），凝胶成像系统采集目的条带，采用ImageJ软件分析目的条带的灰度值，以-actin作为内参照物，计算PKM2蛋白相对表达量并筛选出PKM2基因敲低效果最佳的siRNA。(3)p-H2AX蛋白相对表达量：将F3-T3转染组和空载体转染组细胞（U87MG和U251MG)接种于培养皿（规格：10 0 mm）,加入替莫唑胺10 0 mol/L,48h后更换为不含替莫唑胺的新鲜DMEM完全培养基，于更换培养基后即刻、2 4、36 和48 h提取总蛋白，BCA法检测总蛋白含量；并行SDS-PAGE、PVD F转膜、封闭，加人I抗工作液包括鼠源性抗p-H2AX单克隆抗体（1：10 0 0）、鼠源性抗人-actin单克隆抗体（1：30 0 0），再加人辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG抗（1：30 0 0），凝胶成像系统采集目的条带，ImageJ软件分析目的条带灰度值，以-actin作为内参照物，计算p-H2AX蛋白相对表达量。（4)转染siRNA后p-H2AX蛋白相对表达量：将F3-T3转染组和空载体转染组细胞（U87MG和U251MG)接种于培养皿（规格：10 0 mm），实验组转染筛选出的敲低PKM2基因效果最佳的siRNA、对照组不转染，2 4h后均加人替莫唑胺10 0 mol/L,48h后更换为不含替莫唑胺的新鲜DMEM完全培养基，分别于更换培养基后2 4和48 h提取总蛋白,BCA法检测总蛋白含量；并行SDS-PACE、转膜、封闭，加人I抗工作液包括鼠源性抗p-H2AX单克隆抗体（1：10 0 0)和鼠源性抗人-actin单克隆抗体（1：30 0 0），再加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG抗和山羊抗兔IgG抗（均1：30 0 0），凝胶成像系统采集目的条带，ImageJ软件分析目的条带灰度值，以-actin作为内参照物，计算p-H2AX蛋白相对表达量。8.统计分析方法去采用GarphPadPrism8软件进行数据处理与分析。呈正态分布的计量资料以均数标准差(xs)表示，采用单因素方差分析，两两比较行LSD-t检验。以P0.05为差异具有统计学意义。结果果CCK-8细胞增殖实验显示，经替莫唑胺6 40、320、16 0、8 0、40 mol/L处理7 2 h后，F3-T3转染组750Chin JContemp Neurol Neurosurg,g,August2023,Vol.23,No.8中国现代神经疾病杂志2 0 2 3年8 月第2 3卷第8 期表1梯度浓度替莫唑胺处理后F3-T3转染组与空载体转染组U87MG和U251MG细胞存活率的比较（xs，%）Table 1.Comparison of the survival rates of U87MG and U251MG cells between F3-T3 transfected group and empty vectortransfected group under different concentrations of TMZ(s,%)替莫唑胺(mol/L)组别样本数*6403201608040201052.50U87MG空载体转染组553.964.5265.96 1.8967.66 2.5770.67 5.5775.15 3.0679.48 2.2785.193.0289.83 3.6794.09 3.39F3-T3转染组588.70 4.4090.46 4.7390.97 4.5684.223.9985.455.2683.78 4.9782.26 5.7385.2410.8293.43 6.02值11.0219.6178.9133.9533.3851.5740.9060.8030.758P值0.0000.0000.0000.0040.0100.1540.3910.4450.476替莫唑胺（mol/L)组别样本数*6403201608040201052.50U251MG空载体转染组542.09 1.5351.75 1.0354.71 4.0659.34 2.2073.95 3.97 83.78 2.2188.28 4.0585.373.7891.52 3.39F3-T3转染组589.66 3.3292.72 2.5196.68 5.2091.95 5.5297.05 5.2093.02 3.2392.95 4.8595.40 22.2496.70